动物营养学报 >

2025 , Vol. 37 >Issue 7: 4634 - 4650

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.379

研究论文

精粗分饲与颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛生长性能、养分表观消化率和瘤胃功能的影响

  • 袁金泉 , 1 ,
  • 别欣亚 1 ,
  • 周亚楠 1 ,
  • 杨得玉 1 ,
  • 单青生 2 ,
  • 冯宇哲 1 ,
  • 崔占鸿 , 1, *
展开
  • 1 青海大学畜牧兽医科学院,农业农村部青藏高原放牧牦牛藏羊动物营养与饲草料重点实验室,青海省牦牛工程技术研究中心,青海省高原放牧家畜动物营养与饲料科学重点实验室,西宁 810016
  • 2 海北藏族自治州高原生态畜牧业科技示范园管委会,海晏 810299
* 崔占鸿,研究员,博士生导师,E-mail:

袁金泉(2000—),男,吉林吉林人,硕士研究生,从事反刍动物营养与饲料科学研究。E-mail:

Copy editor: 武海龙

收稿日期: 2024-11-19

  网络出版日期: 2025-07-12

基金资助

青海省重大科技专项(2021-NK-A5)

海北州牦牛藏羊产业技术研发与集成示范

收起

Effects of Separate Concentrate and Forage and Pelleted Mixed Diet on Growth Performance, Nutrient Apparent Digestibility and Rumen Function of Weaned Yak Calves

  • YUAN Jinquan , 1 ,
  • BIE Xinya 1 ,
  • ZHOU Ya’nan 1 ,
  • YANG Deyu 1 ,
  • SHAN Qingsheng 2 ,
  • FENG Yuzhe 1 ,
  • CUI Zhanhong , 1, *
Expand
  • 1 Key Laboratory of Plateau Grazing Animal Nutrition and Feed Science of Qinghai Province, Yak Engineering Technology Research Center of Qinghai Province, Ministry of Agriculture and Rural Affairs Key Laboratory of Animal Nutrition and Forage-Feed of Grazing Yak and Tibetan Sheep in Qinghai-Tibetan Plateau, Academy of Animal Husbandry and Veterinary Science, Qinghai University, Xining 810016, China
  • 2 Management Committee of Plateau Ecological Animal Husbandry Science and Technology Demonstration Park, Haibei Tibetan Autonomous Prefecture, Haiyan 810299, China
* professor, E-mail:

Received date: 2024-11-19

  Online published: 2025-07-12

Fold

摘要

本研究旨在探究精粗分饲和颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛生长性能、养分表观消化率和瘤胃功能的影响,以期为颗粒型混合饲粮在断奶牦牛犊牛培育中的应用提供重要依据。选取10头体重[(57.90±2.93) kg]相近、健康的6月龄断奶母牦牛犊牛,随机分为2组,每组5头牛。2组分别进行精粗分饲(SCF组)和颗粒型混合饲粮饲喂(PMD组)。试验期70 d,其中预试期8 d,正试期62 d。结果表明:1)SCF组和PMD组之间生长性能和腹泻频率差异不显著(P>0.05)。PMD组的粗蛋白质(CP)表观消化率显著高于SCF组(P<0.05),干物质(DM)、中性洗涤纤维(NDF)表观消化率极显著高于SCF组(P<0.01)。2)PMD组的瘤胃微生物蛋白(MCP)含量显著高于SCF组(P<0.05)。3)PMD组的瘤胃纤维素酶、木聚糖酶活性显著高于SCF组(P<0.05),瘤胃胃蛋白酶活性极显著高于SCF组(P<0.01)。4)SCF组的瘤胃厚壁菌门(Firmicutes)、F082和理研菌科RC9肠道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)相对丰度显著高于PMD组(P<0.05)。5)SCF组和PMD组主要的代谢通路有亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、组氨酸代谢、脂肪酸降解、半胱氨酸和蛋氨酸代谢。综上所述,相比精粗分饲,饲喂颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛瘤胃功能具有正向调控作用,提高了瘤胃主要消化酶活性,提高了养分表观消化率,更有利于促进断奶牦牛犊牛的生长发育。

关键词： 断奶牦牛犊牛; 精粗分饲; 颗粒型混合饲粮; 生长性能; 瘤胃发酵; 微生物区系

本文引用格式

袁金泉 , 别欣亚 , 周亚楠 , 杨得玉 , 单青生 , 冯宇哲 , 崔占鸿 . 精粗分饲与颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛生长性能、养分表观消化率和瘤胃功能的影响[J]. 动物营养学报, 2025 , 37(7) : 4634 -4650 . DOI: 10.12418/CJAN2025.379

Abstract

This study aimed to investigate the effects of separate concentrate and forage and pelleted mixed diet on growth performance, nutrient apparent digestibility and rumen function of weaned yak calves, in order to provide an important basis for the application of pelleted mixed diet in the breeding of weaned yak calves. Ten healthy 6-month-old weaned female yak calves with similar body weight [(57.90±2.93) kg] were randomly divided into 2 groups with five calves in each group. Two groups were fed with separate concentrate and forage (SCF group) and pelleted mixed diet (PMD group), respectively. The experimental period was 70 days, including an 8-day preliminary trial period and a 62-day trial period. The results showed as follows: 1) there were no significant differences in growth performance and diarrhea frequency between SCF group and SCF group (P>0.05). The crude protein (CP) apparent digestibility of PMD group was significantly higher than that of SCF group (P<0.05), and the dry matter (DM) and neutral detergent fiber (NDF) apparent digestibility was significantly higher than that of SCF group (P<0.01). 2) The rumen microbial protein (MCP) content of PMD group was significantly higher than that of SCF group (P<0.05). 3) The activities of cellulase and xylanase in rumen of PMD group were significantly higher than those of SCF group (P<0.05), and the activity of pepsin in rumen was significantly higher than that of SCF group (P<0.01). 4) The relative abundances of Firmicutes, F082 and Rikenellaceae_RC9_gut_group in rumen of PMD group were significantly higher than those of SCF group (P<0.05). 5) The main metabolic pathways of SCF group and PMD group included linoleic acid metabolism, alpha-linolenic acid metabolism, arginine and proline metabolism, histidine metabolism, fatty acid degradation and cysteine and methionine metabolism. In summary, compare to separate concentrate and forage, feeding pelleted mixed diet has a positive regulatory effect on the rumen function of weaned yak calves, increases the activity of the main digestive enzymes in rumen, improves the nutrient apparent digestibility, and its more conducive to promoting the growth and development of weaned yak calves.

Key words： weaned yak calves; separate concentrate and forage; pelleted mixed diet; growth performance; rumen fermentation; microbial community

青海省是牦牛的主要产区之一[1],属于高寒牧区,气候环境具有海拔高、气温低、空气稀薄的特点,天然草地、放牧家畜的生产均表现为明显的季节性变化(暖季短、冷季长)[2]。进入漫长的冷季后,营养缺乏与不平衡是影响牦牛犊牛提质培育的最重要因素[3],冷季时因营养不足导致牦牛犊牛体重损失和体况变差的问题突出,严重影响其后期的生长发育[4]。传统自然放牧方式下恶劣的冷季环境中无法满足母牛对营养物质的需求,导致哺乳量显著减少,不利于犊牛早期的生长发育,从而制约了牦牛产业的高质量发展[5-7]。
牦牛犊牛在冷季的饲养应采用放牧加舍饲的模式[8],而饲粮是舍饲牦牛养殖的基础。目前我国饲料原料供应紧张,玉米供应不足,大豆依赖进口,严重影响饲料业和畜牧业的可持续发展[9]。传统的干草和精料分开饲喂容易导致干物质采食量不足和挑食,进而影响家畜生长[10]。但随着饲料原料需求的增加,这也导致了我国饲料业对玉米、豆粕的需求量急速上升[11]。研究表明,颗粒型混合饲粮相比精粗分饲更具优势,且能够利用当地农作物秸秆和副产品,减少饲料资源浪费,提高养殖经济效益[12]。颗粒型混合饲粮具有改善适口性、运输方便、降低管理成本等优点[13-14],并通过高温调质和制粒提高饲粮的消化吸收,促进动物生长[15]。目前,关于颗粒型混合饲粮在断奶牦牛犊牛上应用的报道较少。因此,本研究拟通过精粗分饲和颗粒型混合饲粮饲喂断奶牦牛犊牛的试验比较,探究精粗分饲与颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛生长性能、养分表观消化率和瘤胃功能的影响,为颗粒型混合饲粮在牦牛犊牛生产中的应用和节本增效饲养提供理论依据和重要参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本试验已通过青海省畜牧兽医科学院实验动物管理委员会批准,审批号:2024-QHMKY-004。
选取健康状况良好、体重[(57.90±2.93) kg]相近的10头6月龄断奶牦牛犊牛(母)作为试验动物,随机分为2组,每组5头牛。2组分别进行精粗分饲(SCF组)和颗粒型混合饲粮饲喂(PMD组),2组饲粮精粗比均为3:7。试验期70 d,其中预试期8 d,正试期62 d。颗粒型混合饲粮和精料组成及营养水平见表1,燕麦干草营养水平见表2所示。
表1 颗粒型混合饲粮和精料组成及营养水平(干物质基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of pelleted mixed diet and concentrate (DM basis)%

项目
Items		 颗粒型
混合饲粮
Pelleted mixed
diet		 精料
Concentrate
原料 Ingredients
燕麦干草 Oat hay 70.00
玉米 Corn 13.50 45.00
小麦 Wheat 2.70 9.00
小麦麸 Wheat bran 1.80 6.00
豆粕 Soybean meal 3.60 12.00
菜籽粕 Rapeseed meal 2.40 8.00
棉籽粕 Cottonseed meal 4.20 14.00
石粉 Limestone 0.30 1.00
食盐 NaCl 0.30 1.00
预混料 Premix1) 1.20 4.00
合计 Total 100.00 100.00
营养水平 Nutrient levels2)
粗蛋白质 CP 10.36 20.67
粗脂肪 EE 2.38 2.92
粗灰分 Ash 7.38 3.38
中性洗涤纤维 NDF 42.09 15.27
酸性洗涤纤维 ADF 22.74 8.87
钙 Ca 0.61 1.09
磷 P 0.37 0.59

1)每千克预混料含 One kg of the premix contained the following:VA 0.4 g,VE 3 g,VD3 0.08 g,Cu 1.5 g,Fe 5 g,Mn 4 g,Zn 2 g,P 0.1 g,Ca 0.09 g。
2)营养水平为实测值。表2同。Nutrient levels were measured values. The same as Table 2.

表2 燕麦干草营养水平(干物质基础)

Table 2 Nutrient levels of oat hay (DM basis)%

项目
Item		 粗蛋白质
CP		 钙
Ca		 磷
P		 酸性洗涤纤维
ADF		 中性洗涤纤维
NDF		 粗灰分
Ash		 粗脂肪
EE
燕麦干草Oat hay 5.67 0.40 0.27 29.72 55.31 4.97 1.49

1.2 饲养管理及饲料制备工艺

1.2.1 饲养管理

饲养试验在青海省海北州海晏县高原现代生态畜牧业科技试验示范园进行。在试验开始前,给每只断奶牦牛犊牛进行称重,并记录体重,每天07:00和17:00各饲喂1次,试验期间犊牛均在分栏圈里单独饲养,按照每组犊牛平均体重的2.5%进行投料,为了保证每头牦牛犊牛饲粮摄入量一致,先饲喂精料后饲喂粗饲料。

1.2.2 饲粮制备工艺

颗粒型混合饲粮的制备工艺主要包括以下步骤:配方设计、原料准备、原料预处理、搅拌混合、调质处理、制粒成型与切割、冷却打包、存储等。制粒过程中,粗饲料切短长度为1~2 cm。精粗分饲模式中粗饲料长度切短至3~5 cm。

1.3 样品采集与指标测定

1.3.1 生长性能

试验开始后,每隔30 d对犊牛进行空腹称重和体尺测量,并记录初始体重、终末体重、体斜长、体高、胸围和管围;每天记录采食量,计算平均日增重。

1.3.2 腹泻频率

试验开始后,每天观察犊牛的排粪情况,对粪便进行评分,粪便评分标准见表3。当粪便被评为3分及以上时记为腹泻,每头犊牛每腹泻1 d记为腹泻1次,计算腹泻频率[16]。
表3 粪便评分标准

Table 3 Fecal scoring criteria

评分 Score 形态 Shape 外观 Appearance
1 正常 条形或颗粒
2 成形 较软、糊状
3 不成形 呈水样
4 不成形 呈水样、黏液附着少量血丝
5 不成形 呈水样、黏液附着大量血丝
腹泻频率(%)=[(腹泻头数×腹泻天数)/(总头数×试验天数)]×100。

1.3.3 饲粮营养水平和养分表观消化率

在正试期结束前5 d,采用全收粪法收集所有试验牛新鲜的粪便,每天每头采集200 g,均分成2份,其中一份按照100 g粪样加20 mL 10%的硫酸固氮,待5 d收粪结束后,将同一头牛的粪便混合,随机取200 g于-80 ℃保存待测。加硫酸的粪样用来测定粗蛋白质(CP)含量,未加硫酸的粪样用来测定其他营养物质含量。饲粮和粪样中CP、粗脂肪(EE)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、钙(Ca)、磷(P)含量分别参照GB/T 6432—2018、GB/T 6433—2006、GB/T 20806—2022、NY/T 1459—2022、GB/T 6436—2018、GB/T 6437—2018中方法进行测定。养分表观消化率计算公式如下:
某养分表观消化率(%)=[(食入该养分含量-粪中该养分含量)/食入该养分含量]×100。

1.3.4 瘤胃发酵参数

于试验期最后1天08:00,采用口腔采集法用瘤胃液采集管抽取空腹条件下试验牛瘤胃液,用干净、卫生、无菌的4层纱布过滤抽取的瘤胃液后使用梅特勒酸度计对瘤胃液pH进行测定。剩余的瘤胃液置于5 mL冻存管中后立即投入液氮中保存待测。氨态氮(NH3-N)含量参照冯宗慈等[17],采用比色法使用紫外可见分光光度计测定。微生物蛋白(MCP)含量采用考马斯亮蓝法进行测定,瘤胃液样品常温解冻后,经3 000×g、4 ℃的条件下离心5 min,取上清液于测定管中,样品与显色液混匀后,静止10 min,使用紫外分光光度计测定。乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸(VFA)含量采用气相色谱仪(GC-2014,日本岛津公司)测定[18]。气相色谱条件为:载气为氮气(N2),分流比为40:1,进样量为1 μL,进样孔温度为250 ℃,辅助箱温度为250 ℃,气化室温度为250 ℃,火焰离子化检测器(FID)温度为250 ℃,色谱柱型号为AT-FFAP毛细管填充柱(30.0 m×0.32 μm)。恒流模式,流量2.1 mL/min,平均线速度38 cm/s,柱压11.3 psi(0.1 mPa)。

1.3.5 瘤胃主要消化酶活性

使用酶联免疫吸附法(ELISA)测定瘤胃中纤维素酶、内切葡聚糖酶、淀粉酶、木聚糖酶、脂肪酶和胃蛋白酶活性。首先对瘤胃液进行前处理,将内容物按照1:9(质量:体积)的比例置于生理盐水中并混匀,3 000×g离心10 min,收集上清液;然后严格按照ELISA试剂盒(江苏酶标生物科技有限公司)中的说明书进行操作;最后通过标准曲线计算样品中消化酶活性。

1.3.6 瘤胃微生物区系

采用MagPure Soil DNA LQ Kit,依照说明书对样本的基因组DNA进行提取。利用超微量分光光度计(NanoDrop 2000,美国Thermo Fisher Scientific公司)和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度,将提取的DNA于-20 ℃保存。以提取的基因组DNA为模板,使用带Barcode的特异引物和TaKaRa Ex Taq高保真酶进行细菌16S rRNA的PCR扩增。采用通用引物343F(5'-TACGGRAGGCAGCAG-3')和798R(5'-AGGGTATCTAATCCT-3')或515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3')和907R(5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3')扩增16S rRNA基因的V3~V4可变区,用于细菌多样性分析。文库构建和测序PCR扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳检测。然后使用AMPure XP beads磁珠纯化,纯化后作为二轮PCR模板,并进行二轮PCR扩增。并再次使用磁珠纯化,取纯化过的二轮产物进行Qubit定量,然后调整浓度进行测序。使用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行测序,并生成250 bp双端reads。测序由上海欧易生物技术有限公司进行。

1.3.7 瘤胃代谢组学

将-80 ℃下保存的样本取出,于冰水混合物中解冻,移取样本100 μL至1.5 mL EP管中。加入300 μL蛋白沉淀剂甲醇-乙腈(体积:体积=2:1,含混合内标,4 μg/mL),涡旋振荡1 min。冰水浴超声提取10 min,-40 ℃静置2 h后离心20 min(13 000×g,4 ℃),用注射器吸取150 μL的上清液,使用0.22 μm的有机相针孔过滤器过滤后,转移到进样小瓶,-80 ℃下保存,待进行液相色谱-质谱(LC-MS)分析。
分析采用Waters ACQUITY UPLC I-Class plus与Thermo QE HF超高效液相串联高分辨质谱仪组成的液质联用系统。色谱柱采用ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);柱温:45 ℃;流动相:A-水(含0.1%甲酸),B-乙腈;流速:0.35 mL/min;进样体积:3 μL。质谱仪的质量扫描范围设置为70~1 050 m/z,一级质谱扫描分辨率为60 000,二级质谱扫描分辨率为15 000,碰撞能量分别设定为10、20和40 eV。LC-MS数据由Progenesis QI V2.3软件进行处理,并参考HMDB、Lipidmaps (V2.3)、Metlin以及自建数据库,基于精确的质荷比、次级片段和同位素分布对化合物进行鉴定。经过定量结果的标准化处理后,最终获得代谢物的鉴定和相对定量结果,代谢组学数据分析由上海鹿明生物科技有限公司进行。

1.4 数据处理与统计分析

所有的数据用Excel 2019软件处理,采用SPSS 27.0对数据进行分析,数据均以平均值±标准误表示,P<0.05作为显著差异的判断标准,P<0.01作为极显著差异的判断标准。瘤胃微生物区系差异物种筛选标准为P<0.05,瘤胃代谢组学差异代谢物筛选标准为P<0.05、变量投影重要度(VIP)>1。

2 结果与分析

2.1 精粗分饲与颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛生长性能的影响

由图1可知,随着犊牛日龄增加,SCF组和PMD组的采食量均呈现上升趋势,总采食量相似。由表4可知,SCF组和PMD组之间终末体重、平均日增重、体斜长、体高、胸围和管围均差异不显著(P>0.05)。以上结果表明,相比精粗分饲,采用颗粒型混合饲粮饲喂断奶牦牛犊牛不会影响其生长性能的正常发挥。
图1 断奶牦牛犊牛采食量

Fig.1 Feed intake of weaned yak calves

表4 精粗分饲与颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛生长性能的影响

Table 4 Effects of separate concentrate and forage and pelleted mixed diet on growth performance of weaned yak calves

项目
Items		 组别 Groups P值
P-value
SCF PMD
初始体重 Initial body weight/kg 57.80±2.87 58.00±2.98 0.963
终末体重 Final body weight/kg 74.70±2.29 75.20±3.22 0.902
平均日增重 Average daily gain/(g/d) 281.70±19.60 286.70±17.80 0.855
体斜长 Body oblique length/cm 89.60±1.63 88.60±2.04 0.712
体高 Body height/cm 86.20±0.97 87.80±1.77 0.451
胸围 Chest circumference/cm 108.60±1.81 109.20±1.88 0.824
管围 Cannon circumference/cm 12.10±0.19 12.20±0.25 0.760

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01),无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), while with no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 精粗分饲与颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛腹泻频率的影响

由表5可知,SCF组和PMD组之间粪便评分和腹泻频率均差异不显著(P>0.05),表明采用颗粒型混合饲粮饲喂不会引起断奶牦牛犊牛腹泻频率的显著变化。
表5 精粗分饲与颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛腹泻频率的影响

Table 5 Effects of separate concentrate and forage and pelleted mixed diet on diarrhea frequency of weaned yak calves

项目
Items		 组别 Groups P值
P-value
SCF PMD
粪便评分 Fecal score/分 1.18±0.02 1.19±0.02 0.829
腹泻频率 Diarrhea frequency/% 2.26±0.96 3.54±0.94 0.367

2.3 精粗分饲与颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛养分表观消化率的影响

由表6可知,PMD组的CP表观消化率显著高于SCF组(P<0.05),DM、NDF表观消化率极显著高于SCF组(P<0.01)。SCF组和PMD组之间ADF、EE表观消化率均差异不显著(P>0.05)。
表6 精粗分饲与颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛养分表观消化率的影响

Table 6 Effects of separate concentrate and forage and pelleted mixed diet on nutrient apparent digestibility of weaned yak calves%

项目
Items		 组别 Groups P值
P-value
SCF PMD
干物质 DM 71.94±0.55B 74.71±0.56A 0.008
粗蛋白质 CP 65.34±1.41b 69.96±0.44a 0.014
中性洗涤纤维 NDF 66.28±0.83B 72.71±0.77A <0.001
酸性洗涤纤维 ADF 64.57±1.61 66.11±0.95 0.335
粗脂肪 EE 66.78±2.93 70.59±1.79 0.300

2.4 精粗分饲与颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛瘤胃发酵参数的影响

由表7可知,PMD组的瘤胃MCP含量显著高于SCF组(P<0.05)。SCF组和PMD组之间瘤胃pH和氨态氮、乙酸、丁酸、丙酸、总挥发性脂肪酸(TVFA)含量及乙酸/丙酸均差异不显著(P>0.05)。
表7 精粗分饲与颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛瘤胃发酵参数的影响

Table 7 Effects of separate concentrate and forage and pelleted mixed diet on rumen fermentation parameters of weaned yak calves

项目
Items		 组别 Groups P值
P-value
SCF PMD
pH 6.76±0.03 6.78±0.04 0.654
氨态氮 NH3-N/(mg/dL) 3.77±0.39 4.10±0.47 0.596
微生物蛋白 MCP/(mg/dL) 12.77±1.27b 16.43±0.31a 0.023
乙酸 Acetate/(mmol/L) 36.92±1.56 45.24±3.95 0.086
丙酸 Propionate/(mmol/L) 5.53±0.77 7.10±0.81 0.200
丁酸 Butyrate/(mmol/L) 5.56±0.71 8.18±1.02 0.069
总挥发性脂肪酸 TVFA/(mmol/L) 55.11±2.66 67.16±6.33 0.117
乙酸/丙酸 Acetate/propionate 6.57±0.46 6.48±0.36 0.858

2.5 精粗分饲与颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛瘤胃主要消化酶活性的影响

由表8可知,PMD组的瘤胃纤维素酶、木聚糖酶活性显著高于SCF组(P<0.05),瘤胃胃蛋白酶活性极显著高于SCF组(P<0.01)。SCF组和PMD组之间瘤胃淀粉酶、内切葡聚糖酶和脂肪酶活性均差异不显著(P>0.05)。
表8 精粗分饲与颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛瘤胃主要消化酶活性的影响

Table 8 Effects of separate concentrate and forage and pelleted mixed diet on rumen main digestive enzyme activities of weaned yak calves

项目
Items		 组别 Groups P值
P-value
SCF PMD
纤维素酶 Cellulase/(U/mL) 341.95±8.55b 373.66±7.97a 0.027
淀粉酶 Amylase/(U/L) 330.16±7.62 325.00±5.97 0.609
木聚糖酶 Xylanase/(U/mL) 368.24±11.49b 404.26±7.68a 0.031
内切葡聚糖酶 Endoglucanase/(U/L) 71.49±3.19 68.36±3.61 0.424
脂肪酶 Lipase/(U/L) 687.77±5.98 691.47±16.79 0.840
胃蛋白酶 Pepsin/(U/mL) 12.95±0.38B 14.54±0.21A 0.006

2.6 精粗分饲与颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛瘤胃微生物区系的影响

2.6.1 操作分类单元(OTU)聚类及基础分析结果

样本在高通量测序后,在97%的距离上,从10个不同的样本中总共获得OTU数目为3 955个,数据处理后得到804 212个原始数列,质控后得到645 291个有效序列,质控有效率为80.23%。

2.6.2 Venn图

由图2可知,PMD组和SCF组的OTU数目分别为1 843和3 039个,2组相同的OTU数目为927个;PMD组和SCF组特有的OTU数目分别为916和2 112个。
图2 Venn图

YPHQ_37代表PMD组,YPHJ_37代表SCF组。图3至图5同。

Fig.2 Venn diagram

YPHQ_37 represents the PMD group, and YPHJ_37 represents the SCF group. The same as Fig.3 to Fig.5

2.6.3 Alpha多样性指数

由表9和图3可知,PMD组和SCF组覆盖率均大于0.99,测序深度已经接近饱和状态,说明测序结果可代表样品中微生物的真实信息;SCF组的瘤胃微生物Chao1、ACE、Shannon指数极显著高于PMD组(P<0.01)。
表9 瘤胃微生物Alpha多样性指数

Table 9 Alpha diversity indexes of rumen microbiota

项目
Items		 组别 Groups P值
P-value
SCF PMD
Chao1指数 Chao1 index 985.36±73.95A 604.04±14.46B 0.001
ACE指数 ACE index 985.21±73.89A 603.69±14.72B 0.001
覆盖率 Good’s coverage 0.99±0.00 0.99±0.00 0.150
Shannon指数 Shannon index 8.26±0.29A 6.60±0.28B 0.003
Simpson指数 Simpson index 0.99±0.00 0.94±0.00 0.109
图3 覆盖率图

Fig.3 Good’s coverage diagram

2.6.4 瘤胃微生物优势菌门和菌属相对丰度

由表10可知,SCF组的瘤胃厚壁菌门、F082和理研菌科RC9肠道群相对丰度显著高于PMD组(P<0.05)。PMD组和SCF组之间其他瘤胃菌门和菌属相对丰度均差异不显著(P>0.05)。
表10 精粗分饲与颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛瘤胃微生物优势菌门和菌属相对丰度的影响

Table 10 Effects of separate concentrate and forage and pelleted mixed diet on relative abundance of microbiota dominant phyla and genera in rumen of weaned yak calves

项目
Items		 指标
Indexes		 组别 Groups P值
P-value
SCF PMD
门水平
Phyla level		 拟杆菌门 Bacteroidota 70.61±1.92 79.07±3.29 0.057
厚壁菌门 Firmicutes 26.84±1.83a 17.97±2.59b 0.023
变形菌门 Proteobacteria 0.86±0.23 0.93±0.25 0.826
螺旋体门 Spirochaetota 0.55±0.05 0.65±0.25 0.718
纤维杆菌门 Fibrobacterota 0.29±0.14 0.55±0.13 0.122
脱硫杆菌门 Desulfobacterota 0.40±0.07 0.33±0.11 0.586
放线菌门 Actinobacteriota 0.09±0.02 0.15±0.04 0.199
梭杆菌门 Fusobacteriota 0.04±0.01 0.07±0.01 0.095
迷踪菌门 Elusimicrobiota 0.02±0.01 0.05±0.01 0.087
巴氏杆菌门 Patescibacteria 0.01±0.01 0.02±0.01 0.836
属水平
Genera level		 普雷沃氏菌属 Prevotella 21.23±2.75 34.42±7.81 0.150
F082 14.73±1.46a 8.91±1.82b 0.038
理研菌科RC9肠道群 Rikenellaceae_RC9_gut_group 12.97±0.85a 9.12±1.00b 0.019
Muribaculaceae 8.73±1.91 12.55±3.54 0.371
普雷沃氏菌科UCG-001 Prevotellaceae_UCG_001 2.96±0.78 3.89±1.61 0.618
毛螺菌科ND3007群 Lachnospiraceae_ND3007_group 3.59±1.07 2.99±0.86 0.672
p-251-o5 1.44±0.32 3.15±2.49 0.516
普雷沃氏菌科NK3B31群 Prevotellaceae_NK3B31_group 1.14±0.41 2.61±1.07 0.237
NK4A214群 NK4A214_group 1.83±0.50 1.04±0.58 0.132
梭状芽孢杆菌属UCG-014 Clostridia_UCG-014 1.84±0.19 1.43±0.27 0.252
由图4可知,PMD组和SCF组断奶牦牛犊牛瘤胃中排名前10的菌门分别为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、螺旋菌门、纤维杆菌门、脱硫细菌门、放线菌门、梭杆菌门、迷踪菌门、巴氏杆菌门。
图4 精粗分饲与颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛瘤胃微生物门水平相对丰度的影响

Bacteroidota:拟杆菌门;Firmicutes:厚壁菌门;Protecbacteria:变形菌门;Spirochaetota:螺旋菌门;Fibrobacterota:纤维杆菌门;Desulfobacterota:脱硫细菌门;Actinobacteriota:放线菌门;Fusobacteriota:梭杆菌门;Elusimicrobiota:迷踪菌门;Patescibacteria:巴氏杆菌门;Campilobacterota:弯曲杆菌门;Planctomycetota:浮游菌门;Verrucomicrobiota:疣微菌门;Myxococcota:黏细菌门;Gemmatimonadota:芽单胞菌门;Others:其他。

Fig.4 Effects of separate concentrate and forage and pelleted mixed diet on rumen microbial relative abundance at phyla level of weaned yak calves

由图5可知,PMD组和SCF组断奶牦牛犊牛瘤胃中排名前10的菌属分别为普雷沃氏菌属、F082、理研菌科RC9肠道菌、Muribaculaceae、普雷沃氏菌科UCG-001、毛螺菌科ND3007群、p-251-o5、普雷沃氏菌科NK3B31群、NK4A214群、梭状芽孢杆菌属UCG-014。
图5 精粗分饲与颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛瘤胃微生物属水平相对丰度的影响

Prevotella:普雷沃氏菌属;Rikenellaceae_RC9_gut_group:理研菌科RC9肠道群;Prevotellaceae_UGG-001:普雷沃氏菌科UCG-001;Lachnospiraceae_ND3007_group:毛螺菌科ND3007群;Prevotellaceae_NK3B31_group:普雷沃氏菌科NK3B31群;NK4A214_group:NK4A214群;Clostridia_UCG-014:梭状芽孢杆菌属UCG-014;[Eubacterium]-coprostanoligenes-group:前列烷真杆菌属群;Prevotellaceae_UGG-003:普雷沃氏菌科UCG-003;Bacteroidales_RF16_group:拟杆菌目RF16群;Papillibacter:乳头状杆菌属;Christensenellaceae_R-7_group:克里斯滕森菌科R-7群;Others:其他。

Fig.5 Effects of concentrate and forage and pelleted mixed diet on rumen microbial relative abundance at genus level of weaned yak calves

2.7 精粗分饲与颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛瘤胃代谢组学的影响

2.7.1 主成分分析(PCA)

如图6可知,对代谢物进行主成分分析,PMD组和SCF组的置信椭圆区间重叠面积较小,说明组间具有差异,可进行下一步结果分析。
图6 主成分分析图

Fig.6 PCA diagram

2.7.2 正交偏最小二乘方-判别分析(OPLS-DA)

如图7可知,2组样本在OPLS-DA得分图上具有显著的差异。决定系数(R2)大于预测能力系数(Q2)且Q2回归直线与Y轴的截距均小于0,说明本试验中的模型没有“过拟合”,模型准确可信,可进行后续分析。
图7 瘤胃代谢产物正交偏最小二乘方-判别分析

200 permutations 1 components:200次置换1个成分;R2:决定系数 coefficient of determination;Q2:预测能力系数 coefficient of predictive ability。

Fig.7 OPLS-DA of rumen metabolites

2.7.3 瘤胃微生物差异代谢产物

如图8可知,对SCF组和PMD组进行组间分析,共得到差异代谢物228个,其中相较于PMD组,SCF组显著上调和下调的代谢物分别为115和113个。
图8 火山图

VIP:变量投影重要度 importance of variable projection;FC:差异倍数 fold change;P-value:P值;Significant down:显著下调;Non-significant:差异不显著;Significant up:显著上调。

Fig.8 Volcano plot

由表11可知,SCF组和PMD组主要的代谢通路有亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、组氨酸代谢、脂肪酸降解、半胱氨酸和蛋氨酸代谢。其中,代谢产物包括12,13-二羟基油酸、12R,13S-环氧-9S-羟基-10E-十八烯酸、N-甲基海因、N-乙酰组胺、戊二酸等。
表11 断奶牦牛犊牛瘤胃差异代谢产物

Table 11 Rumen differential metabolites of weaned yak calves

代谢通路
Metabolic
pathways		 代谢产物
Metabolites		 变量投影
重要度
VIP		 log2
(差异倍数)
log2(FC)		 P值
P-value		 变化
Change




亚油酸代谢
Linoleic acid metabolism		 12,13-二羟基油酸
12,13-dihydroxyoleic acid		 3.469 -0.543 0.011 下调
12R,13S-环氧-9S-羟基-10E-十八烯酸
12R,13S-epoxy-9S-hydroxy-10E-
octadecenoic acid		 2.698 -0.857 0.017 下调
α-亚麻酸代谢
Alpha-linolenic acid
metabolism		 (9S,10E,12Z,15Z)-9-羟基十八烷-
10,12,15-三烯酸
(9S,10E,12Z,15Z)-9-hydroxyoctadeca-
10,12,15-trienoic acid		 2.545 -0.692 0.032 下调



精氨酸和脯氨酸代谢
Arginine and proline metabolism		 N-甲基海因
N-methylhydantoin		 2.518 -0.253 0.030 下调
N-乙酰腐胺
N-acetylputrescine		 1.227 2.264 0.031 上调
组氨酸代谢
Histidine metabolism		 N-乙酰组胺
N-acetylhistamine		 1.785 -0.921 0.047 下调
脂肪酸降解
Fatty acid degradation		 戊二酸
Glutaric acid		 1.602 -0.495 0.048 下调
半胱氨酸和蛋氨酸代谢
Cysteine and methionine
metabolism		 蛋氨酸亚砜
Methionine sulfoxide		 1.002 1.371 0.002 上调

2.7.3 KEGG通路富集分析

由图9可知,对SCF组和PMD组牦牛犊牛瘤胃的差异代谢产物进行功能富集分析,由富集分析的气泡图可知,主要通路有嘧啶代谢,赖氨酸降解,嘌呤代谢,脂肪酸降解,初级胆汁酸的生物合成,组氨酸代谢,硫氨酸代谢,甘油磷脂代谢,丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,α-亚麻酸代谢,精氨酸和脯氨酸代谢,亚油酸代谢,糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚生物合成等。其中,精氨酸和脯氨酸代谢、亚油酸代谢这2个通路发生了显著变化(P<0.05)。
图9 KEGG富集分析气泡图

Pyrimidine metabolism:嘧啶代谢;Lysine degradation:赖氨酸降解;Drug metabolism-other enzymes:药物代谢-其他酶;Purine metabolism:嘌呤代谢;Fatty acid degradation:脂肪酸降解;Primary bile acid biosynthesis:初级胆汁酸的生物合成;Histidine metabolism:组氨酸代谢;Thiamine metabolism:硫氨酸代谢;Glycerophospholipid metabolism:甘油磷脂代谢;Alanine, aspartate and glutamate metabolism:丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢;Chemical carcinogenesis-receptor activation:化学致癌-受体激活;Glycine, serine and threonine metabolism:甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢;Alpha-linolenic acid metabolism:α-亚麻酸代谢; Arginine and proline metabolism:精氨酸和脯氨酸代谢;Choline metabolism in cancer:癌症的胆碱代谢;Linoleic acid metabolism:亚油酸代谢;Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchor biosynthesis:糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚生物合成;Autophag-animal:自噬-动物;Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection:卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒感染;Autophagy-other:自噬-其他。

Fig.9 Bubble map of KEGG enrichment analysis

3 讨论

3.1 精粗分饲与颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛生长性能、养分表观消化率和瘤胃功能的影响

合理的饲喂模式能够确保犊牛获得均衡的营养,从而保证其健康成长,提高生长速度和体重增长率。研究表明,颗粒型混合饲粮相比传统的精、粗料分饲更为优越[12]。韦崟崟等[19]研究发现,饲喂全混合日粮可以提高育肥湖羊采食量、终末体重和平均日增重。郭万正等[20]研究发现,饲喂全混合日粮对安格斯犊牛生长性能具有促进作用,并提高饲料利用率。而本试验中,2组生长性能无显著差异,可能是因为在冷季这个阶段牦牛犊牛会增加能量消耗,用于维持体温和免疫生理功能,来抵御寒冷。但总体来说,相比精粗分饲,饲喂颗粒型混合饲粮断奶牦牛犊牛的终末体重、平均日增重、体高和胸围略高。
养分表观消化率是评价家畜对饲料营养物质消化吸收程度的重要依据[21];提高养分表观消化率能增强反刍动物对饲料养分的吸收,优化瘤胃微生物区系平衡,促进瘤胃发酵效率,减少能量浪费,促进生长发育[22]。马宁等[23]研究表明,饲喂全混合日粮能够有效提高育肥羊的DM、CP和NDF表观消化率。班晖琼[24]等研究表明,饲喂全混合日粮提高了肉羊CP表观消化率。于忠升等[25]研究表明,饲喂全混合日粮提高了绵羊CP、NDF和ADF表观消化率。白嘎拉[26]研究发现,饲喂颗粒饲料显著提高了羔羊CP和NDF表观消化率,改善了饲料利用率,促进羔羊了生长发育。吴战宽[27]研究发现,全混合日粮饲喂技术在牛羊养殖中能提升饲料转化率、减少甲烷排放、改善动物健康并提高生产性能。本试验中,相比精粗分饲,饲喂颗粒型混合饲粮的断奶牦牛犊牛CP、DM和NDF表观消化率显著提高,这些结果与上述研究结果一致,表明颗粒型混合饲粮能提高断奶牦牛犊牛对营养物质的消化利用能力,改善饲料利用率,进而对生长性能有一定促进作用。分析原因可能是饲料在制粒的过程当中改善了饲料中一些营养成分的理化性质,使粗纤维膨胀软化和淀粉糊化,进而有利于动物对养分的消化吸收,提高了饲料利用率。
瘤胃是反刍动物极其重要的消化器官,其中瘤胃液pH是反映瘤胃发酵水平的重要指标[28]。瘤胃液pH一般在5.5~7.5,在此范围内瘤胃微生物能够迅速生长,有助于VFA产生,从而高效地为反刍动物提供所需的能量[29]。本试验中,2组瘤胃液pH均在正常范围内,说明2种饲粮对瘤胃无负面作用。VFA是反映饲粮发酵水平的重要指标,能够供给生命所需70%~80%的能量[30]。李刚[31]研究发现,饲喂全混合日粮能促进肉羊机体氮合成,加快蛋白质合成速率,显著提高瘤胃发酵功能。本试验中,相比精粗分饲,饲喂颗粒型混合饲粮的断奶牦牛犊牛VFA中乙酸和丁酸含量具有增加的趋势,可能是由于颗粒型混合饲粮均衡的营养供给有利于瘤胃微生物的活动,提高营养物质的消化率,使瘤胃微生物能更充分利用营养物质发酵产生乙酸、丁酸等VFA,为机体供能。NH3-N是瘤胃内微生物所需要的唯一氮源[32],同时也是瘤胃微生物合成MCP的主要成分。研究表明,MCP含量的提高可以提高饲粮蛋白质的消化率[33]。庞凯悦等[34]研究发现,全混合日粮的饲喂方式可以显著提高瘤胃MCP的合成。本试验中,相比精粗分饲,饲喂颗粒型混合饲粮显著提高了瘤胃MCP含量,说明颗粒型混合饲粮有助于提高饲粮蛋白质消化率,与本试验中CP养分表观消化率结果相对应。综上可知,饲喂颗粒型混合饲粮一定程度上可以维持瘤胃内环境稳定,提高瘤胃液中MCP含量,促进瘤胃发酵。
动物体内存在多种多样的酶,消化酶的活性能够体现出动物对营养物质消化吸收的能力[35]。瘤胃中的纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、内切葡聚糖酶及胃蛋白酶活性与瘤胃微生物密切相关[36]。瘤胃木聚糖酶能分解植物细胞壁中的木聚糖,提高饲料利用率,促进营养吸收[37];纤维素酶能够分解反刍动物摄入饲粮中的纤维素,将复杂且难以消化的纤维素分解为小分子糖类,进而增加对饲料的消化率[38]。胃蛋白酶可以分解蛋白质,促进多肽的生成,为瘤胃微生物提供更多的氮源[39]。胃蛋白酶活性提高使更多的蛋白质被分解和吸收,促进CP表观消化率提高;CP表观消化率的提高为瘤胃微生物提供了更多氮源,有助于MCP的合成,同时MCP合成的提高也进一步地提高了反刍动物对蛋白质的利用效率。本试验中,相较于精粗分饲,饲喂颗粒型混合饲粮的断奶牦牛犊牛瘤胃内纤维素酶、胃蛋白酶和木聚糖酶的活性显著提高,可能是因为颗粒型混合饲粮在制粒的过程中,高温熟化,使得营养物质能够更有效地被利用。这表明颗粒型混合饲粮有助于瘤胃微生物合成消化酶,从而分解更多纤维素、木聚糖和蛋白质等营养物质,为瘤胃微生物提供更多的可发酵底物,促进VFA的生成,与本研究中养分表观消化率和瘤胃发酵参数结果相对应。

3.2 精粗分饲与颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛瘤胃微生物区系及代谢产物的影响

反刍动物瘤胃微生物菌群的稳定对维持动物健康、提高饲料消化利用率和提高生产性能具有十分重要的意义。本试验中,SCF组瘤胃微生物Chao1、Ace指数和Shannon指数极显著高于PMD组,造成原因可能是相较于精粗分饲,颗粒型混合饲粮可能更易于消化,减少了对瘤胃微生物的刺激,从而影响微生物的多样性。本试验中,拟杆菌门和厚壁菌门是微生物群落的优势菌门,相比精粗分饲,饲喂颗粒型混合饲粮断奶牦牛犊牛的厚壁菌门相对丰度显著降低,可能是因为饲料制粒后在一定程度上降低了饲粮中粗纤维含量,从而减少了对瘤胃内纤维素分解菌的产生[40]。拟杆菌门主要参与非纤维性碳水化合物和蛋白质的降解,为机体提供能量[41],同时有助于维护胃肠道微生物平衡和反刍动物的健康[42]。杜瑞平等[43]研究表明,拟杆菌门数量增加而厚壁菌门数量减少,可对胃肠道致病菌有一定抑制,具有维持微生态区系稳定的作用,与本试验结果一致。本试验中,相比精粗分饲,饲喂颗粒型混合饲粮断奶牦牛犊牛的瘤胃内拟杆菌门相对丰度有升高的趋势,造成其原因可能是因为饲料制粒后有助于调节断奶牦牛犊牛瘤胃菌群,调控了瘤胃菌群结构的合理性,提高了断奶牦牛犊牛对纤维性物质的降解率,使断奶牦牛犊牛能更有效地从饲粮中摄取营养成分,进而为瘤胃微生物提供更多的可发酵底物,促进VFA的生成,与本试验中瘤胃发酵参数结果一致。研究表明,理研菌科RC9肠道群与VFA、乙酸和丙酸含量呈负相关,与脂肪代谢密切相关,也是反刍动物瘤胃中非常重要的菌群[44]。本试验中,相比精粗分饲,饲喂颗粒型混合饲粮的断奶牦牛犊牛瘤胃内理研菌科RC9肠道群相对丰度降低。其原因可能是颗粒型混合饲粮在瘤胃内快速消化,影响了微生物的生长和活动,促进一些能够适应快速消化的微生物生长。
本研究通过非靶向代谢组学来观测牦牛瘤胃代谢物,结果显示饲喂模式的不同会影响瘤胃的代谢产物,相较于精粗分饲,饲喂颗粒型混合饲粮在瘤胃亚油酸代谢和精氨酸和脯氨酸代谢通路中产生显著影响。众所周知,亚油酸是一种反刍动物体内必需的多不饱和脂肪酸[45]。亚油酸代谢属于脂类代谢,是产生脂肪酸的重要途径[46],同时是反刍动物的重要能量来源,为动物供能[47];在反刍动物消化系统中,亚油酸通过氢化作用,被转化为饱和脂肪酸(硬脂酸),并进一步提高共轭亚油酸的生成效率[48],降低甲烷产量;有研究表明,亚油酸的提高有助于促进瘤胃微生物将亚油酸代谢转化为共轭亚油酸[49]。Wang等[50]研究表明,亚油酸的增加促进了共轭亚油酸的生成,提高了反刍动物对疾病的抵抗力和免疫功能以及脂质代谢。而精氨酸作为必需氨基酸,是合成蛋白质的原料,在反刍动物的生长阶段,充足的精氨酸供应能够促进蛋白质的合成;同时通过促进免疫细胞的活性和数量,从而增强动物的免疫反应,提高对疾病的抵抗力[51]。脯氨酸在蛋白质生物合成和应用过程中起着重要作用,能提高生物抗氧化和免疫能力,对全身蛋白质合成的需求比较重要[52]。脯氨酸是胶原蛋白合成的前体,脯氨酸的充足供应有助于促进胶原蛋白的合成,从而支持动物的生长和骨骼健康[53]。本试验中,相比精粗分饲,饲喂颗粒型混合饲粮的断奶牦牛犊牛在亚油酸代谢与精氨酸和脯氨酸代谢通路中呈上调趋势,说明颗粒型混合饲粮在一定程度可以促进断奶牦牛犊牛生长,提高对疾病的抵抗能力和促进消化道健康,进而提高断奶牦牛犊牛对饲料的消化率和利用率。
利用表型、微生物区系和代谢产物之间的联系来综合分析精粗分饲与颗粒型混合饲粮对断奶牦牛犊牛生长性能和瘤胃功能的影响,从代谢结果来看亚油酸代谢与精氨酸和脯氨酸上调能够协同促进能量代谢效率和免疫功能,同时共同作用于瘤胃微生物,促进瘤胃微生物的生长和MCP的合成,这与本研究微生物区系结果PMD组瘤胃拟杆菌门相对丰度高于SCF组一致,说明颗粒型混合饲粮能促进非纤维性碳水化合物和蛋白质的降解合成利用,为瘤胃发酵产生更多可发酵底物,进而提高瘤胃发酵效率,改善瘤胃环境,从而提高饲料的消化率和利用率,因此,饲喂颗粒型混合饲粮对反刍动物的整体健康和生长性能具有积极影响,有利于断奶牦牛犊牛更好的生长发育。

4 结论

相比精粗分饲,饲喂颗粒型混合饲粮能够改善断奶牦牛犊牛瘤胃发酵功能,促进瘤胃内能适应快速消化的微生物生长和MCP合成,提高瘤胃主要消化酶活性,从而提高饲料的消化率和利用率,有利于断奶牦牛犊牛更好的生长发育。

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