动物营养学报 >

2025 , Vol. 37 >Issue 7: 4796 - 4809

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.392

研究论文

不同添加剂对羊草青贮品质的影响

  • 闫雨婷 ,
  • 赵牧其尔 ,
  • 珠拉 ,
  • 闫星全 ,
  • 郝俊峰 ,
  • 格根图 , * ,
  • 贾玉山 ,
  • 王志军
展开
  • 内蒙古农业大学草业学院,农业农村部饲草栽培、加工与高效利用重点实验室,草地资源教育部重点实验室,呼和浩特 010019
* 格根图,教授,博士生导师,E-mail:

闫雨婷(2000—),女,黑龙江牡丹江人,博士研究生,从事牧草加工与利用研究。E-mail:

Copy editor: 菅景颖

收稿日期: 2024-10-27

  网络出版日期: 2025-07-12

基金资助

科技计划项目——羊草种质资源创制及丰产栽培与高效利用技术研究(RZ2300003633)

收起

Effects of Different Additives on Silage Quality of Leymus chinensis

  • YAN Yuting ,
  • ZHAO Muqier ,
  • ZHU La ,
  • YAN Xingquan ,
  • HAO Junfeng ,
  • GE Gentu , * ,
  • JIA Yushan ,
  • WANG Zhijun
Expand
  • Key Laboratory of Grassland Resources of the Ministry of Education, Key Laboratory of Forage Cultivation and the Processing and Highly Efficient Utilization of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, College of Grassland Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019, China
* professor, E-mail:

Received date: 2024-10-27

  Online published: 2025-07-12

Fold

摘要

本试验旨在研究不同添加剂对羊草青贮品质的影响。选取植物乳杆菌(LP处理)、布氏乳杆菌(LB处理)、植物乳杆菌与布氏乳杆菌混合菌(LPLB处理)、复合酶制剂(CE处理)作为添加剂对羊草进行为期60 d的青贮发酵,并设空白对照(CK处理),每个处理设置3个重复,针对羊草青贮饲料的营养成分、发酵品质、挥发性成分及微生物多样性进行分析。结果显示:从发酵品质来看,LP与LPLB处理的pH较低,显著低于CE和CK处理(P<0.05);LPLB处理的乳酸含量显著高于其他处理(P<0.05);LP处理的乙酸含量显著高于其他处理(P<0.05)。从营养成分来看,LPLB处理的粗蛋白质与可溶性碳水化合物含量显著高于其他处理(P<0.05);LPLB处理的酸性洗涤纤维含量显著低于除LP处理外的其他处理(P<0.05)。从挥发性成分来看,LP与LPLB处理的芳香族成分、氨类、烷烃芳香成分含量高于其他处理。从微生物多样性来看,CK处理中存在多种有害菌,而且在BugBase表型预测下,CK处理的预测结果最为复杂,各添加剂处理的结果趋于相似。由此可见,针对羊草进行青贮时,选择植物乳杆菌或植物乳杆菌与布氏乳杆菌混合菌作为添加剂能改善青贮品质。

关键词： 添加剂; 羊草; 青贮品质; 微生物

本文引用格式

闫雨婷 , 赵牧其尔 , 珠拉 , 闫星全 , 郝俊峰 , 格根图 , 贾玉山 , 王志军 . 不同添加剂对羊草青贮品质的影响[J]. 动物营养学报, 2025 , 37(7) : 4796 -4809 . DOI: 10.12418/CJAN2025.392

Abstract

This experiment aimed to investigate the effects of different additives on the silage quality of Leymus chinensis. Lactobacillus plantarum (LP treatment), Lactobacillus buchneri (LB treatment), Lactobacillus plantarum and Lactobacillus buchneri mixture (LPLB treatment), and complex enzyme preparation (CE treatment) were selected as additives for silage fermentation of Leymus chinensis for 60 days, with a blank control (CK treatment), and each treatment was set up with three replicates. The nutritional components, fermentation quality, volatile components, and microbial diversity of the Leymus chinensis silage were analyzed. The results showed that, in terms of fermentation quality, the pH of LP and LPLB treatments was lower, and it was significantly lower than that of CE and CK treatments (P<0.05); the lactic acid content of LPLB treatment was significantly higher than that of other treatments (P<0.05); the acetic acid content of LP treatment was significantly higher than that of other treatments (P<0.05). In terms of nutritional components, the crude protein and soluble carbohydrate contents of LPLB treatment were significantly higher than those of other treatments (P<0.05); the acid detergent fiber content of LPLB treatment was significantly lower than that of other treatments except LP treatment (P<0.05). In terms of volatile components, aromatic components, amines, and aliphatic aromatic components in LP and LPLB treatments were higher than those in other treatments. From the perspective of microbial diversity, there were many harmful bacteria in the CK treatment. Moreover, under BugBase phenotyping prediction, the prediction results of the CK treatment were the most complex, while the results of additive treatments tended to be similar. Thus, it is concluded that selecting Lactobacillus plantarum and Lactobacillus plantarum or Lactobacillus buchneri mixture as additive can improve the silage quality of Leymus chinensis.

Key words： additives; Leymus chinensis; silage quality; microorganisms

羊草[Leymus chinensis (Trin.) Tzvel.]隶属禾本科赖草属,是一种多年生根茎型草本植物,具有较高饲用价值[1-2]。羊草是北温带草地的重要建设群或优势种,适应性强,生态范围广,原产地从西伯利亚到朝鲜,在我国内东北平原、内蒙古草原等天然草原上,常以单一优势群落的形式分布[3-6]。作为家畜的重要饲料资源,羊草通常用于干草制备。然而,羊草干草的质量受天气的影响很大,且羊草的收获季节多集中于7—8月份,此期间多为雨季,调制方式及成本受到限制[6]。牧草干燥过程中降雨会造成大量的养分损失[7],而选择对牧草进行青贮能够有效保存营养成分,并且储存时占用空间小、保存时间长且饲喂时适口性好、消化率高[8-10]。此外,与干草相比,青贮饲料含有更高的可消化干物质、代谢能和粗蛋白质含量,这有助于家畜增重[11]。
青贮的作用机理是在密闭环境中,通过乳酸菌发酵产生乳酸,降低pH,有效抑制有害微生物活动,能最大限度地保留营养成分,延长贮藏时间[12]。但青贮添加剂种类繁多,对于不同饲料类型,不同发酵类型的添加剂对其青贮饲料品质具有不同效果[13-14]。因此,选择合理的添加剂以达到最佳青贮效果非常重要。作为乳杆菌属中研究最广泛的物种之一,植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)存在于各种环境微生境中,具有多功能性和代谢能力,被广泛认为是改善青贮饲料品质的添加剂,其通过显著提高乳酸含量和降低pH来改善发酵质量[15-17]。高龙等[18]的研究显示,布氏乳杆菌(Lactobacillus buhneri)和植物乳杆菌联合使用可显著抑制酵母菌和好氧菌数量,增加乳酸菌数量,改善杂交狼尾草青贮60 d后的发酵特性。复合酶制剂凭借其高效、无毒、无残留等优点受到业界的广泛关注,其中的蛋白酶等消化酶能有效增强畜禽的消化吸收功能,纤维素酶等能有效分解饲粮中的纤维成分;木聚糖酶等能有效降解植物性饲料中的抗营养成分[19-20]。本研究基于营养成分、发酵品质及挥发性成分的变化,对比4种添加剂改善羊草青贮品质的能力,以期为羊草青贮添加剂的应用提供理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用植物乳杆菌、布氏乳杆菌和植物乳杆菌与布氏乳杆菌混合菌的活菌数均为2×1011 CFU/g,复合酶制剂由木聚糖酶(≥18 000 U/g)、纤维素酶(≥50 U/g)、β-甘露聚糖酶(≥1 800 U/g)、β-葡聚糖酶(≥200 U/g)、果胶酶(≥200 U/g)、中温α-淀粉酶(≥1 500 U/g)、中性蛋白酶(1 000 U/g)组成。
羊草(中科1号)为2018年种植的多年生羊草,采样地点为内蒙古自治区乌兰浩特市呼和马场羊草种植点(北纬45°41'53″,东经121°50'30″),于2023年7月28日用手持镰刀收割,青贮前用切割机将收割的羊草切成1~2 cm长。羊草原料的pH和营养成分含量见表1。
表1 羊草原料的pH和营养成分含量

Table 1 pH and nutrient contents of Leymus chinensis material

项目
Item		 pH 干物质
DM/%FW		 粗蛋白质
CP/%DM		 粗脂肪
EE/%DM		 水溶性碳水
化合物
WSC/%DM		 中性洗涤纤维
NDF/
%DM		 酸性洗
涤纤维
ADF/%DM
羊草原料
Leymus chinensis material		 6.53 57.44 5.96 1.45 2.03 71.48 47.81

1.2 试验设计

采用单因素试验设计,设置5个处理,即LP(添加植物乳杆菌)、LB(添加布氏乳杆菌)、LPLB(添加植物乳杆菌与布氏乳杆菌混合菌)、CE(添加复合酶制剂)和CK(不添加任何添加剂的空白对照)处理,每个处理设置3个重复。将3 mg菌制剂或0.1 mg复合酶制剂溶解在20 mL蒸馏水中,并均匀地喷洒在600 g羊草原料上,完全混合并包装在3个30 cm×40 cm的聚乙烯袋中,使用真空包装机真空密封,室温条件下青贮60 d后开袋,取样分析相关指标。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 营养成分含量

羊草原料和羊草青贮饲料营养成分含量:采用GB/T 6435—2014中的105 ℃烘干法测定干物质含量;参照GB/T 6432—2018中的凯氏定氮法测定粗蛋白质含量;使用Ankom 2000型纤维分析仪按照所附说明书测定酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量;使用VELP SER148/6脂肪测试仪按照所附说明书测定粗脂肪含量;采用蔥酮-硫酸比色法[21]测定可溶性碳水化合物含量。

1.3.2 发酵品质

青贮60 d后开袋后取10 g样品,加入90 mL蒸馏水,使用均质拍打仪匀速拍打2 min,过滤得到青贮饲料浸提液。使用酸度计测量pH,使用Agilent(型号:1100)高效液相色谱仪测定乳酸(lactic acid,LA)、乙酸(acetic acid,AA)、丙酸(propionic acid,PA)和丁酸(butyric acid,BA)的含量;采用苯酚-次氯酸盐比色法[22]测定氨态氮(ammonia nitrogen,NH3-N)的含量。

1.3.3 挥发性成分

顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱(HS-SPME-GC-MS)法:羊草青贮饲料在液氮中速冻并转移到-80 ℃冰箱中储存。将样品在液氮中研磨成粉末,并立即将2 g粉末转移至20 mL顶空小瓶中,并用垫圈和铝盖密封。色谱分析条件:HP-5 MS UI石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),色谱柱的初始温度为35 ℃,保持4 min,然后以5 ℃/min的速率将温度程序设定为200 ℃,保持5 min,然后通过15 ℃/min的程序将温度升高至250 ℃并保持4 min。进样口的温度为250 ℃,载气为高纯氦气(纯度≥99.99%),氦气流速为1 mL/min,柱前压力为87.57 kPa,进样方式为分流比为1:20的分流进样方式。质谱条件:离子源温度230 ℃,传输线温度280 ℃。采用NIST11和NIS11s数据库检索,核对标准质谱图,查阅相关文献资料[23],并利用匹配度对挥发性成分进行定性分析,初步得出其分子式及分子结构,并应用峰面积归一化法计算挥发性成分的相对含量。
电子鼻法:电子能量为70 eV的电子电离(EI),质量扫描范围为40~550 m/z,采集模式为全扫描模式,离子源真空度为7.2×10-7 mTorr,将顶空小瓶置于磁力加热搅拌器上以均匀加热。使用电子鼻(型号:AIRSENSE/PEN 3,Ensoul Technology Ltd.,德国),传感器性能见表2。准确地称量2 g样品到20 mL样品小瓶中,放置10 min,然后插入电子鼻探针以在尖端吸取空气并测量挥发性成分。电子鼻的设置参数为:载气流速和注射流速为300 mL/min,清洗时间为95 s,调零时间为5 s,样品制备时间为5 s,测量时间为100 s,样品间隔时间为1 s,每2 s记录1次来自每个传感器的信号,并使用电子鼻附带的Win Muster软件分析数据。所有样品在6次平行测量后取平均值,相对气味强度由样品中挥发性气体的阻力(G)与相应载气的阻力(G0)的比率作为时间的函数来反映。
表2 电子鼻传感器名称及对应物质

Table 2 Electronic nose sensor names and corresponding substances

序列号
No.		 传感器名称
Sensor names		 性能描述
Performance
description
1 W1C 芳香族成分
2 W5S 氮氧化合物
3 W3C 氨类
4 W6S 氢类
5 W5C 烷烃芳香族成分
6 W1S 甲基类
7 W1W 硫化物
8 W2S 醇类与醛酮类
9 W2W 有机硫化物
10 W3S 烷烃

1.3.4 微生物多样性

从青贮60 d的羊草样本中分离微生物总DNA并进行PCR扩增。用于扩增V3~V4高变异区的引物为338F(5'-ACTCCCTACGGGGGAGGCAGCAG-3')和806 R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。PCR产物用2%琼脂糖凝胶分离,用Axy Prep DNA 凝胶提取试剂盒纯化,在Tris-HCl中洗脱,然后用2%琼脂糖电泳分析纯度。采用QuantiFluorTM-ST进行定量,并按照Illumina MiSeq平台的标准操作程序,利用纯化的扩增片段创建PE2×300文库。测序采用Illumina MiSeq PE300平台(上海美吉生物医药科技有限公司)。

1.4 数据统计分析

利用Excel 2021对试验原始数据进行预处理,然后使用SAS 9.2软件对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA),并采用Duncan氏多重比较法检验组间差异。使用Origin 2024软件对数据进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同添加剂对羊草青贮饲料发酵品质的影响

由表3可知,不同添加剂对羊草青贮饲料中氨态氮含量以外其余发酵指标均有显著影响(P<0.05)。LP处理的pH显著低于其他处理(P<0.05),CE处理的pH较高,与CK处理接近,二者差异不显著(P>0.05)。LPLB处理的乳酸含量显著高于其他处理(P<0.05)。LP处理的乙酸含量显著高于其他处理(P<0.05),CK处理的乙酸含量也相对较高,显著高于LB、LPLB和CE处理(P<0.05)。CE处理的丙酸含量显著高于其他处理(P<0.05)。仅CK处理存在少量丁酸。氨态氮含量在各处理间均无显著差异(P>0.05)。
表3 不同添加剂对羊草青贮饲料发酵品质的影响

Table 3 Effects of different additives on fermentation quality of Leymus chinensis silage

处理
Treatments		 pH 乳酸
LA/
(g/kg DM)		 乙酸
AA/
(g/kg DM)		 丙酸
PA/
(g/kg DM)		 丁酸
BA/
(g/kg DM)		 氨态氮
NH3-N/
%FW
LP 4.12±0.04c 7.52±0.09b 2.88±0.08a 0.56±0.00b ND 0.44±0.04
LB 4.36±0.01b 4.99±0.03d 1.40±0.05c 0.48±0.00c ND 0.49±0.04
LPLB 4.16±0.03b 10.69±0.10a 1.10±0.02d 0.56±0.00b ND 0.45±0.00
CE 4.68±0.03a 5.46±0.19c 1.23±0.12c 1.19±0.04a ND 0.46±0.00
CK 4.62±0.02a 6.85±0.20b 2.60±0.11b 0.60±0.02b 0.08±0.09 0.46±0.01
P值 P-value <0.000 1 <0.000 1 <0.000 1 <0.000 1 0.253 1

ND:未检测到。同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

ND: Not detected. Data in the same column with different letter superscripts indicate significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 不同添加剂对羊草青贮饲料中营养成分含量的影响

由表4可知,不同添加剂对羊草青贮饲料中各营养成分含量均有显著影响(P<0.05)。LP处理的干物质含量显著低于其他处理(P<0.05)。LPLB处理的粗蛋白质与可溶性碳水化合物含量显著高于其他处理(P<0.05)。LP与CE处理的粗脂肪含量显著低于其他处理(P<0.05)。中性洗涤纤维含量以CK处理最低,显著低于其他处理(P<0.05)。LPLB处理的酸性洗涤纤维含量显著低于除LP处理外的其他处理(P<0.05)。
表4 不同添加剂对羊草青贮饲料中营养成分含量的影响

Table 4 Effects of different additives on nutrient contents of Leymus chinensis silage

处理
Treatments		 干物质
DM/%FW		 粗蛋白质
CP/%DM		 粗脂肪
EE/%DM		 水溶性碳
水化合物
WSC/%DM		 中性洗涤纤维
NDF/%DM		 酸性洗涤纤维
ADF/%DM
LP 49.93±0.89b 5.61±0.04d 1.86±0.04b 1.47±0.02d 69.27±0.14ab 43.45±0.17ab
LB 56.18±0.97a 6.17±0.04c 2.08±0.03a 1.95±0.03c 70.64±0.41a 44.40±0.28a
LPLB 53.04±1.49a 8.31±0.10a 2.02±0.08a 2.69±0.04a 67.80±1.26b 42.96±0.15b
CE 54.10±0.71a 6.78±0.02b 1.74±0.05b 2.40±0.03b 69.87±0.46ab 44.22±0.25a
CK 55.96±0.52a 5.61±0.02d 2.07±0.04a 1.28±0.03e 62.84±0.41c 45.02±0.54a
P值 P-value 0.009 0 <0.000 1 0.006 6 <0.000 1 0.000 3 0.004 3

2.3 不同添加剂对羊草青贮饲料中挥发性成分的影响

2.3.1 使用电子鼻法测定的挥发性成分

由图1可知,羊草青贮饲料中的主要挥发性成分有氮氧化合物、甲基类、硫化物、醇类与醛酮类及有机硫化物,其中以醇类与醛酮类物质最多。LP与LPLB处理的芳香族成分、氨类、烷烃芳香成分含量高于其他处理,但氮氧化合物、氢类、甲基类、硫化物、醇类与醛酮类、芳香族成分及有机硫化物含量低于其他处理。各处理中,LPLB处理的芳香族成分、氨类及烷烃芳香族成分含量最高;CE处理的氮氧化合物、有机硫化物含量最高;LB处理的硫化物、醇类与醛酮类及烷烃含量最高;CK处理的氢类和甲基类含量最高。
图1 不同添加剂处理羊草青贮饲料的电子鼻检测结果

Fig.1 Electronic nose detection results of Leymus chinensis silage treated with different additives

2.3.2 基于HS-SPME-GC-MS法测定挥发性成分

由表5可知,羊草青贮饲料中有烃类、酸类、酮类、酯类、杂环类及胺类等6类挥发性成分,其中以烃类与酯类的种类偏多,酯类的含量最高。
表5 不同添加剂对羊草青贮饲料挥发性成分的影响

Table 5 Effects of different additives on volatile components of Leymus chinensis silage

处理
Treatments		 成分分类
Component classification		 类型数量
Type number/个		 成分含量
Component content/%



LP		 烃类 2 9.81
酸类 1 5.32
酮类 1 4.49
酯类 2 80.38



LB		 烃类 1 4.80
酸类 1 1.13
酯类 3 84.71
杂环类 1 5.18
胺类 2 4.18



LPLB		 烃类 1 12.78
酸类 2 44.71
酯类 1 26.14
杂环类 1 13.51
胺类 1 2.86



CE		 烃类 2 24.02
酸类 1 3.65
酮类 1 2.63
酯类 2 42.24
杂环类 1 4.01
胺类 2 23.45



CK		 烃类 4 13.91
酸类 1 11.28
酯类 4 54.65
杂环类 1 17.49
胺类 1 2.67
由表6可知,2-乙基-4,5-二甲基-1,2-氧杂环戊硼烷与苯甲酰基异硫氰酸酯在各处理中均被检测到,同时在各处理中也是含量较多的成分;二乙基硼酸仅在LPLB处理未被检测到,甲氧基乙酸酐仅在CE处理未被检测到;二乙基对苯二胺在LP、LPLB及CE处理均被检测到;3,6-二氢-2H-吡喃-4-硼酸在LP与CE处理被检测到;噻二唑在LB与LPLB处理被检测到;尿素在LB与CE处理被检测到;六硼烷仅在LP处理被检测到;异氰酸甲酯仅在LB处理被检测到;1,2-二甲基肼仅在LPLB处理被检测到;1,3-丁二烯亚基环己烷、O-乙基-S-2-二甲氨基乙基乙基硫代膦酸酯及2,5,6-三甲基苯并噻唑仅在CE处理被检测到;3-蒈烯、丙酸乙酯、丁酸乙酯及1-(2-二甲基氨基乙基)-1H-5-巯基-四氮唑仅在CK处理被检测到。
表6 不同添加剂处理羊草青贮饲料中挥发性成分含量

Table 6 Volatile component contents of Leymus chinensis silage treated with different additives

样品名称
Sample names		 A B C D E F G H I J K L M N O P Q R
LP1 5.79 2.62 4.48 3.81 63.35 4.82 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
LP2 5.63 2.53 4.51 3.77 61.28 4.97 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
LP3 5.91 2.49 4.50 3.82 63.86 4.77 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
LB1 4.58 0 1.08 0 75.19 1.80 3.68 4.94 1.34 2.65 0 0 0 0 0 0 0 0
LB2 4.73 0 1.12 0 75.32 1.75 3.71 4.87 1.40 2.62 0 0 0 0 0 0 0 0
LB3 4.51 0 1.09 0 74.82 1.83 3.62 4.93 1.29 2.71 0 0 0 0 0 0 0 0
LPLB1 5.19 0 0 0 14.82 3.34 0 10.62 1.16 0 5.49 0 0 0 0 0 0 0
LPLB2 5.20 0 0 0 15.03 3.36 0 10.68 1.19 0 5.56 0 0 0 0 0 0 0
LPLB3 15.16 0 0 0 14.97 3.28 0 10.58 1.23 0 5.61 0 0 0 0 0 0 0
CE1 12.90 0 2.73 1.97 0 6.96 0 0 8.47 9.09 0 5.08 24.66 3.00 0 0 0 0
CE2 12.88 0 2.81 2.03 0 7.01 0 0 8.51 9.14 0 5.13 24.61 3.02 0 0 0 0
CE3 12.96 0 2.69 1.94 0 6.94 0 0 8.46 9.05 0 5.07 24.58 2.99 0 0 0 0
CK1 2.02 0 9.36 0 27.31 6.96 0 0 0 0 0 0 0 0 1.84 1.58 9.49 14.51
CK2 2.14 0 9.42 0 27.47 6.71 0 0 0 0 0 0 0 0 1.79 1.63 9.64 14.62
CK3 2.01 0 9.30 0 27.19 6.94 0 0 0 0 0 0 0 0 1.81 1.55 9.51 14.42

LP1、LP2、LP3为LP处理的3个样本,LB1、LB2、LB3为LB处理的3个样本,LPLB1、LPLB2、LPLB3为LPLB处理的3个样本,CE1、CE2、CE3为CE处理的3个样本,CK1、CK2、CK3为CK处理的3个样本。LP1, LP2 and LP3 are 3 samples form LP treatment, LB1, LB2 and LB3 are 3 samples from LB treatment, LPLB1, LPLB2 and LPLB3 are 3 samples from LPLB treatment, CE1, CE2 and CE3 are 3 samples from CE treatment, and CK1, CK2 and CK3 are 3 samples from CK treatment.

A:2-乙基-4,5-二甲基-1,2-氧杂环戊硼烷 2-ethyl-4,5-dimethyl-1,2-oxaborolane;B:六硼烷 hexaborane;C:二乙基硼酸 diethyl-borinic acid;D:2-乙基-5-甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环烷-4-酮 2-ethyl-5-methyl-1,3,2-dioxaborolan-4-one;E:甲氧基乙酸乙酯 methoxy-acetic acid,ethyl ester;F:苯甲酰基异硫氰酸酯 benzoyl isothiocyanate;G:异氰酸甲酯 methane isocyanato;H:噻二唑 1,2,3-thiadiazole;I:二乙基对苯二胺 3,3a,4,5,6,6a-hexahydro-3a,4,4-trimethyl-3,5-methanocyclopentapyrazole;J:尿素 urea;K:1,2-二甲基肼 1,2-dimethyl-hydrazine;L:1,3-丁二烯亚基环己烷 1,3-butadienylidene-cyclohexane;M:O-乙基-S-2-二甲氨基乙基乙基硫代膦酸酯 O-ethyl S-2-dimethylaminoethyl ethylphosphonothiolate;N:3,4-二甲基苯基硫代异氰酸酯 3,4-dimethylbenzyl sothiocvanate;O:3-蒈烯 3-carene;P:丙酸乙酯propanoic acid,ethyl ester;Q:丁酸乙酯 butanoic acid,ethyl ester;R:1-(2-二甲基氨基乙基)-1H-5-巯基-四氮唑 1-[2-(dimethylamino)ethyl]-1,2-dihydro-5H-tetrazole-5-thione。

2.4 不同添加剂对羊草青贮饲料微生物组成的影响

2.4.1 不同添加剂对羊草青贮饲料微生物物种差异的影响

由图2可知,不同添加剂对羊草青贮饲料优势菌属(相对丰度前10的菌属)的相对丰度产生了显著影响(P<0.05)。慢生乳杆菌属(Lentilactobacillus)和乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)存在于除CK以外的所有处理中,且LP与LPLB处理中这2种乳酸菌的相对丰度均保持在一个较高水平;仅有CK处理存在肠杆菌属(Enterobactar)、哈夫尼亚-肥大杆菌属(Hafnia-Obesumbacterium)与肠球菌属(Enterococcus);LP处理的科萨克氏菌属(Kosakonia)相对丰度最高,CE与CK处理也有少量存在;鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)与乳酸乳球菌属(Lactococcus)均一定量存在于CK处理中,极少量存在于其他处理中。
图2 不同添加剂对羊草青贮饲料微生物物种差异的影响(相对丰度前10的菌属)

Fig.2 Effects of different additives on microbial species differences of Leymus chinensis silage (top 10 bacterial genera in relative abundance)

2.4.2 不同添加剂对羊草青贮饲料BugBase表型预测的影响

不同添加剂处理下的BugBase表型预测如图3所示。LP、LB及CE处理的表型预测结果相似,都是主要由4种表型构成,分别是革兰氏阴性(Gram negative)、潜在致病性(potentially pathogenic)、耐受性(stress tolerant)、厌氧(anaerobic);LPLB处理中除上述4种表型外,革兰氏阳性(Gram positive)占比也较大;CK处理中表型构成相对更为复杂,涵盖了所有类型。
图3 不同添加剂对羊草青贮饲料BugBase表型预测的影响

LP1、LP2、LP3为LP处理的3个样本,LB1、LB2、LB3为LB处理的3个样本,LPLB1、LPLB2、LPLB3为LPLB处理的3个样本,CE1、CE2、CE3为CE处理的3个样本,CK1、CK2、CK3为CK处理的3个样本。LP1, LP2 and LP3 are 3 samples form LP treatment, LB1, LB2 and LB3 are 3 samples from LB treatment, LPLB1, LPLB2 and LPLB3 are 3 samples from LPLB treatment, CE1, CE2 and CE3 are 3 samples from CE treatment, and CK1, CK2 and CK3 are 3 samples from CK treatment.

Contains mobile elements:可移动元件含量;Gram negative:革兰氏阴性;Potentially pathogenic:潜在致病性;Forms biofilms:形成生物被膜;facultatively anaerobic:兼性厌氧;Stress tolerant:耐受性;Gram positive:革兰氏阳性;Aerobic:需氧;Anaerobic:厌氧。

Fig.3 Effects of different additives on BugBase phenotype prediction of Leymus chinensis silage

2.4.3 羊草青贮饲料中挥发性成分与微生物的关联分析

如图4所示,1-(2-二甲基氨基乙基)-1H-5-巯基-四氮唑、丁酸乙酯、丙酸乙酯及3-蒈烯均Lentilactobacillus、Lactiplantibacillus呈极显著负相关(P<0.01),与Enterobacter、Hafnia-Obesumbacterium、Enterococcus呈极显著正相关(P<0.001);苯甲酰基异硫氰酸酯与二乙基硼酸均与Sphingomonas、Enterococcus呈显著正相关(P<0.05);2-乙基-4,5-二甲基-1,2-氧杂环戊硼烷与Enterobacter、Hafnia-Obesumbacterium呈极显著负相关(P<0.01);2-乙基-4,5-二甲基-1,2-氧杂环戊硼烷和尿素均与Lentilactobacillus呈显著正相关(P<0.05)。
图4 羊草青贮饲料中挥发性成分与微生物的关联分析

*:显著相关 significant correlation (P<0.05);**:极显著相关 extremely significant correlation (P<0.01);***:极显著相关extremely significant correlation (P<0.001)。

A:2-乙基-4,5-二甲基-1,2-氧杂环戊硼烷 2-ethyl-4,5-dimethyl-1,2-oxaborolane;B:六硼烷 hexaborane;C:二乙基硼酸 diethyl-borinic acid;D:2-乙基-5-甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环烷-4-酮 2-ethyl-5-methyl-1,3,2-dioxaborolan-4-one;E:甲氧基乙酸乙酯 methoxy-acetic acid,ethyl ester;F:苯甲酰基异硫氰酸酯 benzoyl isothiocyanate;G:异氰酸甲酯 methane isocyanato;H:噻二唑 1,2,3-thiadiazole;I:二乙基对苯二胺 3,3a,4,5,6,6a-hexahydro-3a,4,4-trimethyl-3,5-methanocyclopentapyrazole;J:尿素 urea;K:1,2-二甲基肼 1,2-dimethyl-hydrazine;L:1,3-丁二烯亚基环己烷 1,3-butadienylidene-cyclohexane;M:O-乙基-S-2-二甲氨基乙基乙基硫代膦酸酯 O-ethyl S-2-dimethylaminoethyl ethylphosphonothiolate;N:3,4-二甲基苯基硫代异氰酸酯 3,4-dimethylbenzyl sothiocvanate;O:3-蒈烯 3-carene;P:丙酸乙酯propanoic acid,ethyl ester;Q:丁酸乙酯 butanoic acid,ethyl ester;R:1-(2-二甲基氨基乙基)-1H-5-巯基-四氮唑 1-[2-(dimethylamino)ethyl]-1,2-dihydro-5H-tetrazole-5-thione。

Fig.4 Analysis of the association between volatile components and microorganisms in Leymus chinensis silage

3 讨论

3.1 不同添加剂对羊草青贮饲料发酵品质及营养成分含量的影响

评定青贮饲料的发酵品质可通过pH、有机酸和氨态氮含量来评价[24-25]。在本研究中,各处理羊草的pH在青贮后均下降,LP与LPLB处理下降更为明显,这是由于添加乳酸菌使以乳酸为主的有机酸在青贮饲料中大量积累[26],因此这2个处理的羊草青贮饲料中乳酸含量较高。Rabelo等[27]提出布氏乳杆菌促进乳酸向乙酸的转化,本试验结果与此不一致,可能是由于不同的青贮饲料成分及其代谢产生的有机酸类型不同。丁酸仅存在于CK处理中,这是由于原料含糖量不足,乳酸菌无法有效发酵产酸,pH无法降至4.2以下,丁酸菌便会占据优势,作为青贮发酵中有害菌分解转化青贮饲料中乙酸和糖的产物,丁酸含量高代表有害菌活性强,不利于青贮发酵[18,28-29]。氨态氮含量可以反映青贮饲料中蛋白质和氨基酸的降解情况[30],本试验中,各处理间氨态氮含量无显著差异。
营养成分含量是直观评价饲料品质优劣的重要指标,其中以干物质含量为主要评定指标,减少干物质的损失对提高饲料品质有重要意义[31-32]。本试验中,各处理的干物质含量趋于相近,以LB处理的干物质含量最高,这是因为布氏乳杆菌通过抑制微生物活性有效地减少了青贮过程中干物质的损失[33]。LPLB处理的粗蛋白质含量最高,表明其营养价值相对较高[34]。粗脂肪含量在青贮后均呈增加趋势,这种增加是由于碳水化合物被乳酸菌和酵母菌分解成脂溶性物质,如乳酸和挥发性脂肪酸,最终反映在粗脂肪含量上[35]。与直接青贮相比,添加乳酸菌提高了水溶性碳水化合物含量,且各添加剂处理的水溶性碳水化合物含量也有所不同,说明不同乳酸菌间碳源利用能力存在差异[36]。本试验中,羊草青贮后各处理的酸性洗涤木质素含量均下降,与Kung等[37]和琚泽亮等[38]的研究结果一致;中性洗涤纤维含量在青贮前后的差异不明显,这是由于中性洗涤纤维的消化率与饲料本身的组成高度相关,不同的青贮原料、不同种类的乳酸菌、发酵时间的差异都会导致这一结果,这与Duvnjak等[39]的研究结果相似。

3.2 不同添加剂对羊草青贮饲料中挥发性成分影响

电子鼻是一种模拟嗅觉系统的仿生学检验仪器,可以看作是人鼻的延伸,主要用来检测和分析待检测样品中挥发性成分的信息,其优点在于能够客观反映出接收到的信息[40]。本试验检测了羊草青贮饲料中的10大类物质,其中以醇类与醛酮类物质最多,这在对其他植物的研究中也有体现[41]。
挥发性成分是植物风味特性呈现的物质基础[42]。本研究发现,酯类、氮氧化合物和酸类是羊草青贮饲料中主要的挥发性化学物质,这与Liu等[43]的研究结果较为不同,可能与青贮方式的不同有关。此外,本研究中检测到的挥发性成分总量较少,这可能是由于采样期处于植物成熟期,此时植物水分含量下降,气味减弱[44]。各处理中均检测到2-乙基-4,5-二甲基-1,2-氧杂环戊硼烷和苯甲酰基异硫氰酸酯,2-乙基-4,5-二甲基-1,2-氧杂环戊硼烷作为一种医学上的材料,在临床基因沉默治疗应用中有巨大潜力[45],噻二唑在LB与LPLB处理被检测到,3-蒈烯仅在CK处理检测到,噻二唑及3-蒈烯都有抑菌消炎作用[46-47]。

3.3 不同添加剂对羊草青贮饲料微生物多样性的影响

微生物组成和结构是青贮饲料品质特性的重要影响因素之一,可以评价饲草青贮饲料发酵质量好坏[48],Lentilactobacillus和Lactiplantibacillus这2中乳酸菌存在于除CK处理以外的其他处理中,这说明4种添加剂能明显改善羊草的青贮品质。在不同的添加剂处理下,青贮发酵结束后,乳酸菌是各处理羊草青贮饲料中占比最大的细菌,且LP与LPLB处理的2种乳酸菌的相对丰度均保持在较高水平。与各添加剂处理相比,CK处理的微生物组成更加丰富,这是由于青贮60 d后,CK处理较其他处理的pH下降幅度小,乳酸发酵过程缓慢,导致杂菌生长较多,在青贮过程中与乳酸菌竞争底物,最终影响发酵进程[49]。Enterobactar是人类肠传染病重要的致病菌之一[50-51];Hafnia-Obesumbacierium中的哈夫尼菌属于条件致病菌,但致病机理及其在感染中的作用尚不明确[52-53]。本试验中,不同添加剂处理下的羊草青贮饲料中微生物群落组成各有差异,但整体来说以LPLB处理最具优势。
微生物群落组成的差异会引起其表型的变化,BugBase是一个用于表型预测的工具,可以将测量数据的总变异按照变异来源分为处理效应和误差效应,从而确定可控因素对研究结果影响力的大小。利用BugBase表型预测功能预测到的表型有革兰氏阳性、革兰氏阴性、生物膜形成、潜在致病性、可移动元件含量、需氧、厌氧、兼性厌氧、耐受性,它的核心作用是基于微生物群落数据推测这些微生物的代谢和功能潜力,从而揭示复杂微生物群体(如肠道微生物群、土壤微生物群等)的功能,并探索它们在不同生物环境下的潜在影响。例如,根据胃肠道中革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的比例,可以采用更具针对性的抗生素治疗[54];确定粪便样品中厌氧菌和病原体的含量可以帮助预测肠胃道的健康等[55-56]。本研究中预测到表型较为主要的有革兰氏阴性、潜在致病性、耐受性及厌氧。革兰氏阴性菌对多种抗生素具有较强的抗药性,并且能够产生内毒素[57],说明羊草青贮后可能会产生对家畜健康不利的微生物。耐受性说明了在经过青贮发酵过程中,微生物能够承受各种不利环境条件,如温度、pH、渗透压等,并保持生理功能。厌氧菌必须在大幅度降低氧分压的条件下才能生长,这从侧面反映出青贮发酵的特点,氧气的减少是关键步骤之一。

3.4 羊草青贮饲料中挥发性成分与微生物的关联分析

相关性分析可用于评估2个或多个变量之间是否存在某种统计关联。研究表明,微生物释放出大量的挥发性次级代谢产物[58]。丁酸乙酯、丙酸乙酯是在酿酒中所常见的物质[59],在其浓度低的时候,会产生果香,浓度过高的时候,则会产生强烈的刺鼻气味和味道,乳杆菌属因其特殊的益生作用被广泛应用于食品、动物饲料以及医疗保健等领域,因此丁酸乙酯、丙酸乙酯与Lentilactobacillus、Lactiplantibacillus呈极显著负相关。Enterobacter可以引起感染,包括肠道感染和肠外感染等,Sphingomonas随着水传播会引起流行病学的传播[60],丁酸乙酯和丙酸乙酯产生过多可能使肠道菌群的失衡和代谢[61],因此其与Enterobacter、Sphingomonas呈极显著负相关;2-乙基-4,5-二甲基-1,2-恶硼烷与尿素均用于化学合成领域,尿素与乳酸菌之间的关联性主要体现在乳酸菌可能通过调节肠道环境和代谢活动间接影响尿素的生成和排泄。

4 结论

本研究结果表明,4种添加剂(植物乳杆菌、布氏乳杆菌、植物乳杆菌与布氏乳杆菌混合菌、复合酶制剂)在一定程度上对羊草青贮饲料的发酵品质均有改善作用,其中复合酶制剂的改善效果不明显,布氏乳杆菌在不同品质指标中作用不稳定,植物乳杆菌与植物乳杆菌与布氏乳杆菌混合菌均对羊草青贮饲料的发酵品质有明显提升作用,同时降低了营养成分的损失。综合分析得出,在对羊草进行青贮时添加植物乳杆菌或植物乳杆菌与布氏乳杆菌混合菌可获得较佳的效果。

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