蒸汽爆破竹粉纤维组分降解复合酶筛选及工艺优化

韩倩男; 李宁; 郑梓; 谢春艳; 刘正群; 闫峻; 刘静波; 穆淑琴; 孙超

doi:10.12418/CJAN2025.397

动物营养学报 >

2025 , Vol. 37 >Issue 7: 4863 - 4875

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.397

研究论文

蒸汽爆破竹粉纤维组分降解复合酶筛选及工艺优化

韩倩男 ^,¹^,² ,
李宁 ² ,
郑梓 ² ,
谢春艳 ² ,
刘正群 ^,²^,^* ,
闫峻 ² ,
刘静波 ³ ,
穆淑琴 ² ,
孙超 ^,¹^,^*

展开

¹ 西北农林科技大学动物科技学院,杨凌 712199
² 天津市农业科学院畜牧兽医研究所,天津市畜禽健康养殖工程技术中心,天津市畜禽分子育种与生物技术重点实验室,天津 300381
³ 西南科技大学生命科学与工程学院,绵阳 621010

* 刘正群,助理研究员,E-mail: liuzhengqun@foxmail.com;

孙超,教授,博士生导师,E-mail: sunchao2775@163.com

韩倩男(1999—),女,河南商丘人,硕士研究生,研究方向为非常规饲料资源开发。E-mail: hanqiannan66@163.com

Copy editor: 武海龙

收稿日期: 2024-12-19

网络出版日期: 2025-07-12

基金资助

天津市重点研发计划科技支撑重点项目(23YFZCSN00180)

天津市中央引导地方科技发展资金科技成果转移转化项目(24ZYCGSN00350)

天津市农业产学研用“揭榜挂帅”项目(GBGG202306)

天津市生猪产业技术体系创新团队(ITTPRS2021007)

天津市农业科学院财政种业创新研究项目(2024ZYCX012)

收起

Screen and Process Optimization of Compound Enzymes for Fiber Component Degradation of Steam Explosion Bamboo Powder

HAN Qiannan ^,¹^,² ,
LI Ning ² ,
ZHENG Zi ² ,
XIE Chunyan ² ,
LIU Zhengqun ^,²^,^* ,
YAN Jun ² ,
LIU Jingbo ³ ,
MU Shuqin ² ,
SUN Chao ^,¹^,^*

Expand

¹ College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712199, China
² Tianjin Key Laboratory of Animal Molecular Breeding and Biotechnology, Tianjin Engineering Research Center of Animal Healthy Farming, Institute of Animal Science and Veterinary, Tianjin Academy of Agricultural Sciences, Tianjin 300381, China
³ College of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China

* LIU Zhengqun, assistant professor, E-mail: liuzhengqun@foxmail.com;

SUN Chao, professor, E-mail: sunchao2775@163.com

Received date: 2024-12-19

Online published: 2025-07-12

Fold

摘要

本试验旨在通过单因素和正交试验确定适用于蒸汽爆破竹粉的复合酶,并采用响应面法对其酶解条件进行优化,以期提高蒸汽爆破竹粉还原性糖含量并降低其纤维素和半纤维素含量。试验首先从纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶6种单酶中选出酶解蒸汽爆破竹粉后还原性糖含量较高的3种,并对这3种酶进行添加量的筛选,确定各酶适宜添加量。然后以还原性糖含量、纤维素降解率和半纤维素降解率为评价指标,采用加权法计算出酶解效果,以3种单酶的不同添加量为试验因素,设计L₉(3⁴)3因素3水平的正交试验设计,探究复合酶的适宜添加量。最后采用响应面法对复合酶的酶解条件(时间、料水比、温度)进行优化。结果表明:1)纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶3种单酶酶解蒸汽爆破竹粉后还原性糖含量均提高了90%以上,酶解效果较好。2)正交试验结果得出复合酶适宜添加量为纤维素酶2.5%,β-葡萄糖苷酶2.0%,木聚糖酶1.2%,且3种酶的作用效果为纤维素酶>β-葡萄糖苷酶>木聚糖酶。3)复合酶在酶解时间74 h、料水比1:5 g/mL、温度46 ℃时,酶解效果最好,此时纤维素降解率为12.61%,半纤维素降解率为26.04%,还原性糖含量为176.41 mg/g,酶解效果为57.830 7,优化后酶解效果较优化前提高了20.96%。综上所述,本试验优化后的复合酶可以降低蒸汽爆破竹粉纤维组分含量,并提高还原性糖含量。

关键词： 蒸汽爆破竹粉; 复合酶; 正交优化; 响应面法

本文引用格式

韩倩男 , 李宁 , 郑梓 , 谢春艳 , 刘正群 , 闫峻 , 刘静波 , 穆淑琴 , 孙超 . 蒸汽爆破竹粉纤维组分降解复合酶筛选及工艺优化[J]. 动物营养学报, 2025 , 37(7) : 4863 -4875 . DOI: 10.12418/CJAN2025.397

Abstract

The objective of this experiment was to confirm the suitable compound enzymes for steam explosion bamboo powder by single factor and orthogonal test, and to optimize the enzymatic hydrolysis conditions by response surface method, in order to increase the reducing sugar content and decrease the cellulose and hemicellulose contents of steam explosion bamboo powder. Firstly, three enzymes with high reducing sugar content after enzymatic hydrolysis steam explosion bamboo powder were selected from six single enzymes, including cellulase, β-glucosidase, xylanase, glucanase, pectinase and mannanase, and the addition of these three enzymes were screened to determine the optimal addition of each enzyme. Then, the reducing sugar content, cellulose degradation rate and hemicellulose degradation rate were used as the evaluation indexes, and the enzymolysis effect was calculated by weighted method, taking the different addition of three single enzymes as the experimental factors, an orthogonal experimental design of L₉(3⁴) 3-factor 3-level was designed to explore the optimal addition of compound enzymes. Finally, the response surface method was used to optimize the enzymatic hydrolysis conditions (time, material-to-water ratio and temperature) of compound enzymes. The results showed as follows: 1) the reducing sugar content of the three single enzymes of cellulase, β-glucosidase and xylanase increased by more than 90% after enzymatic hydrolysis steam explosion bamboo powder, and the enzymolysis effect was good. 2) The orthogonal experiment results showed that the optimal addition of complex enzyme was 2.5% cellulase, 2.0% β-glucosidase and 1.2% xylanase, and the effect of the three enzymes was cellulase>β-glucosidase>xylanase. 3) The enzymolysis effect of composite enzyme got the best when the enzymatic hydrolysis time was 74 h, the material-to-water ratio was 1:5 g/mL, and the temperature was 46 ℃, at this time, the cellulose degradation rate was 12.61%, the hemicellulose degradation rate was 26.04%, the reducing sugar content was 176.41 mg/g, and the enzymolysis effect was 57.830 7, which the enzymolysi effect after optimization was 20.96% higher than that before optimization. In conclusion, the optimized compound enzyme in this experiment can reduce the content of fiber component and increase the reducing sugar content of steam explosion bamboo powder.

Key words： steam explosion bamboo powder; compound enzymes; orthogonal optimization; response surface method

竹粉是竹材加工过程中的副产物,是一种可再生的非常规饲料资源,其产量在全球范围内正持续增长。根据搜索结果,全球竹粉市场规模在2023年达到0.77亿美元,预计到2030年将增长至1.22亿美元,复合年增长率为6.8%^[1]。竹粉含有丰富的膳食纤维和生物活性物质,如纤维素、半纤维素、黄酮类化合物和植物甾醇等^[2]。黄酮类化合物和植物甾醇2种生物活性物质均具有抑菌、抗氧化等功能,其在畜禽生产中具有多方面的积极影响,包括提高生产性能和增强免疫功能等^[3-5]。然而,竹粉中的木质纤维素难以利用,这限制了其在饲料方面的应用^[6]。因此,可以采取适当的预处理方式破坏木质纤维素结构,将其降解为动物可以消化的小分子物质。

目前研究表明,木质纤维素可以利用物理法、化学法、生物法等进行处理。物理法处理效率高,适用于大规模处理;化学法成本低、效果好;生物法安全、环保、高效^[7-9]。关莹等^[10]研究发现,毛竹经过爆破预处理后,抽提物含量增加,半纤维素含量降低。廖荣俊等^[11]采用稀酸对竹粉进行预处理,半纤维素水解率达70%左右。李文华等^[12]研究表明,竹粉经纤维素酶和木聚糖酶酶解后,还原性糖和总糖得率分别提高了4.4倍和3.0倍。综上可知,3种预处理方式对木质纤维素均有降解效果,由此可以猜想,如果2种预处理方法联合使用,木质纤维素的降解效率可能会更高。

诸力等^[13]研究发现,竹子经蒸汽爆破预处理后,纤维素酶、β-葡萄糖苷酶及木聚糖酶水解后的单糖产率显著提高,表明蒸汽爆破预处理和碳水化合物分解酶联合使用可提高木质纤维原料的水解效率。但目前适用于蒸汽爆破竹粉的碳水化合物酶谱及其适宜水解条件却鲜有报道。因此,本试验以蒸汽爆破竹粉为原料,探究复合酶组成及其酶解条件对其纤维素、半纤维素以及还原性糖含量的影响,开发出适用于蒸汽爆破竹粉的酶解工艺,为竹粉饲料资源的高效利用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验原料

蒸汽爆破竹粉制备:取一定质量的竹屑废弃物,调节水分至50%,在爆破压力2 MPa、维压时间180 s条件下对竹屑废弃物进行蒸汽爆破预处理。预处理后烘干竹屑,均匀粉碎,过40目筛,用于后续试验。经测定,蒸汽爆破竹粉中还原性糖含量为65.92 mg/g,纤维素含量为43.90%,半纤维素含量为9.42%。

1.2 酶制剂

试验所用酶制剂为几种常见的纤维素酶和半纤维素酶,其中,纤维素酶(10 000 U/g)由武汉新华扬生物股份有限公司惠赠,β-葡萄糖苷酶(25 000 U/g)购自北京华迈科生物技术有限责任公司,葡聚糖酶(50 000 U/g)由金益农生物科技(天津)有限公司惠赠,木聚糖酶(100 000 U/g)、果胶酶(60 000 U/g)和甘露聚糖酶(50 000 U/g)均由天津洪孚饲料有限公司惠赠。

1.3 试验设计

本文试验设计的单因素试验和正交试验参照了张安荣^[14]论文的第3章,响应面法优化试验参照了朱龙博^[15]论文的第3章,并在他们的基础上有适当改进。

1.3.1 6种单酶对蒸汽爆破竹粉还原性糖含量的影响

将6种单酶按照2.5%的比例分别接种于装有5 g已灭菌蒸汽爆破竹粉的250 mL锥形瓶中,调整料水比1:10 g/mL,在50 ℃的恒温培养箱中酶解3 d,每个处理3个重复。酶解结束后,置于105 ℃烘干至恒重,粉碎过40目筛备用。以还原性糖含量为指标筛选酶解效果较好的单酶。

1.3.2 单酶添加量筛选

基于单酶的酶解效果,选择纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶3种单酶分别进行添加量优化。每种单酶设置5个梯度,纤维素酶0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%,β-葡萄糖苷酶0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%,木聚糖酶0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%。酶解基本参数为温度50 ℃,料水比1:10 g/mL,酶解时间3 d,每个处理3个重复。以酶解后的还原性糖含量、纤维素降解率和半纤维素降解率为指标,对单酶添加量进行筛选。

1.3.3 复合酶正交试验

采用L₉(3⁴)正交试验设计(表1),在3种单酶添加量筛选的基础上,探究纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶复合酶的酶解适宜添加量,以还原性糖含量和纤维素降解率及半纤维素降解率为观测指标,采用加权法计算出酶解效果,计算公式^[14]如下:

E=0.24S+0.32C+0.44H。

式中:E为酶解效果;S为还原性糖含量(mg/g);C为纤维素降解率(%);H为半纤维素降解率(%)。

表1 复合酶酶解蒸汽爆破竹粉L₉(3⁴)正交试验因素水平表

Table 1 Orthogonal test factor and level table of L₉(3⁴) of compound enzymes enzymatic hydrolysis of steam explosion bamboo powder%

水平 Levels	因素 Factors
水平 Levels	纤维素酶 Cellulase	β-葡萄糖苷酶 β-glucosidase	木聚糖酶 Xylanase
1	1.5	1.0	1.0
2	2.0	1.5	1.2
3	2.5	2.0	1.4

纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶各选出3个添加量,添加量依据各酶单因素试验中添加量结果,各酶对试验影响程度排序按照酶解效果大小进行排序。

1.3.4 复合酶酶解条件优化

确定复合酶适宜酶解时间:将复合酶按5.7%的添加量加入放有5 g蒸汽爆破竹粉的锥形瓶中进行酶解,料水比设定为1:10 g/mL,分别酶解6、12、24、48、72 h,以酶解后的还原性糖含量、纤维素降解率、半纤维素降解率、酶解效果为指标,筛选出复合酶适宜酶解时间。

确定复合酶适宜酶解温度:根据各种酶适宜温度区间选出5种水平,即40、45、50、55、60 ℃进行酶解,以酶解后的还原性糖含量、纤维素降解率、半纤维素降解率、酶解效果为指标,筛选出复合酶适宜酶解温度。

确定复合酶适宜酶解料水比:分别在料水比为1:1、1:3、1:5、1:8、1:10 g/mL的条件下进行酶解,以酶解后的还原性糖含量、纤维素降解率、半纤维素降解率、酶解效果为指标,筛选出复合酶适宜酶解料水比。

根据单因素试验结果,以酶解效果最高值所在水平为中间值,选择前后相近的2水平,对3种因素进行3因素3水平响应面优化(表2),得到适宜复合酶酶解条件。

表2 响应面试验设计因素及编码水平

Table 2 Response surface experimental design factors and coding levels

水平 Levels	因素 Factors
水平 Levels	时间 Time/h	温度 Temperature/℃	料水比 Material-to-water ratio/(g/mL)
-1	66	40	1:3
0	72	45	1:5
+1	78	50	1:7

1.4 指标测定及方法

干物质(dry matter,DM)含量采用GB/T 6435—2014的方法进行测定,中性洗涤纤维(neutral detergent fiber,NDF)含量采用GB/T 20806—2022的方法进行测定,酸性洗涤纤维(acid detergent fiber,ADF)含量采用NY/T 1459—2022的方法进行测定,酸性洗涤木质素(acid detergent lignin,ADL)含量采用GB/T 20805—2006的方法进行测定。还原性糖含量参照朱龙博^[15]的方法计算,纤维素和半纤维素含量计算公式^[16]如下:

纤维素=ADF-ADL;

半纤维素=NDF-ADF。

纤维素或半纤维素降解率计算公式如下:

Z=(X1×Y1)/(X2×Y2)×100。

式中:Z表示纤维素或半纤维素降解率(%);X1表示预处理后蒸汽爆破竹粉中纤维素或半纤维素含量(%);Y1表示预处理后蒸汽爆破竹粉的干物质总重(g);X2表示预处理前蒸汽爆破竹粉中纤维素或半纤维素含量(%);Y2表示预处理前蒸汽爆破竹粉的干物质总重(g)。

1.5 数据统计

采用Excel 2016软件对试验数据进行初步整理,采用SPSS 26.0软件中单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏多重比较方法分析数据显著性,采用Design-Expert 10.0软件进行响应面试验设计和数据分析,采用GraphPad Prism 8软件进行图形绘制。数据以平均值±标准差(mean±SD)表示,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 6种单酶对蒸汽爆破竹粉还原性糖含量的影响

如图1所示,6种单酶酶解蒸汽爆破竹粉后的还原性糖含量均显著高于对照组(P<0.05)。其中,纤维素酶效果最好,纤维素酶组还原性糖含量较对照组提升了136.44%;β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶次之,β-葡萄糖苷酶组还原性糖含量较对照组提升了97.35%,木聚糖酶组还原性糖含量较对照组提升了92.32%;葡聚糖酶组、果胶酶组、甘露聚糖酶组还原性糖含量虽然也高于对照组,但较对照组提升低于80%,不及前3种单酶效果好。因此,综合考虑,选择纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶3种单酶进行后续试验。

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图1 6种单酶对蒸汽爆破竹粉还原性糖含量的影响

数据柱标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下图同。

Fig.1 Effects of 6 single enzymes on reducing sugar content of steam explosion bamboo powder

Value columns with the same small letter mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 单酶添加量的筛选

如图2所示,随着纤维素酶添加量增加,纤维素降解率逐渐升高;纤维素酶添加量为2.0%、2.5%时纤维素降解率显著高于纤维素酶添加量为0.5%、1.0%、1.5%时(P<0.05)。随着纤维素酶添加量增加,还原性糖含量先升高后逐渐平稳;纤维素酶添加量为1.5%、2.0%、2.5%时还原性糖含量显著高于纤维素酶添加量为0、0.5%、1.0%时(P<0.05)。综合考虑酶解效果,选择1.5%、2.0%、2.5% 3个纤维素酶添加量进行后续优化。

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图2 单酶添加水平的筛选

Fig.2 Screening of single enzyme addition

随着β-葡萄糖苷酶添加量增加,纤维素降解率逐渐升高;β-葡萄糖苷酶添加量为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%时纤维素降解率显著高于β-葡萄糖苷酶添加量为0.5%时(P<0.05)。随着β-葡萄糖苷酶添加量增加,还原性糖含量先升高后趋于平稳;β-葡萄糖苷酶添加量为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%时还原性糖含量显著高于β-葡萄糖苷酶添加量为0、0.5%时(P<0.05)。综合考虑酶解效果,选择1.0%、1.5%、2.0% 3个β-葡萄糖苷酶添加量进行后续优化。

随着木聚糖酶添加量增加,半纤维素降解率先升高后逐渐平稳;木聚糖酶添加量为1.0%、1.2%、1.4%时半纤维素降解率显著高于木聚糖酶添加量为0.6%、0.8%时(P<0.05)。随着木聚糖酶添加量增加,还原性糖含量先升高后逐渐平稳;木聚糖酶添加量为0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%时还原性糖含量显著高于木聚糖酶添加量为0时(P<0.05)。综合考虑酶解效果,选择1.0%、1.2%、1.4% 3个木聚糖酶添加量进行后续优化。

2.3 复合酶正交试验结果

如表3所示,以加权法计算出的酶解效果为指标反映复合酶酶解蒸汽爆破竹粉的效果,最终确定各酶适宜添加量。3种酶各水平均值的极差大小顺序为纤维素酶>β-葡萄糖苷酶>木聚糖酶,即酶解解蒸汽爆破竹粉效果的影响排序为纤维素酶最大,β-葡萄糖苷酶次之,木聚糖酶影响最小。由正交试验设计极差分析结果可知,优水平下各酶添加量为:纤维素酶(3水平)、β-葡萄糖苷酶(3水平)、木聚糖酶(3水平),由于木聚糖酶的2水平和3水平差距不大,出于成本考虑,最终选用组合9,即2.5%纤维素酶、2.0% β-葡萄糖苷酶、1.2%木聚糖酶,作为后续试验复合酶添加量。

表3 L₉(3⁴)正交试验设计结果及极差分析

Table 3 L₉(3⁴) orthogonal experimental design results and range analysis

项目 Items	因素 Factors			酶解效果 Enzymolysis effect
项目 Items	纤维素酶 Cellulase	β-葡萄糖苷酶 β-glucosidase	木聚糖酶 Xylanase	酶解效果 Enzymolysis effect
1	1	1	1	39.567 6
2	1	2	2	42.930 0
3	1	3	3	44.389 0
4	2	1	2	43.584 0
5	2	2	3	44.388 0
6	2	3	1	44.228 0
7	3	1	3	45.679 0
8	3	2	1	45.693 0
9	3	3	2	47.811 0
k1	42.296	42.944	43.163
k2	44.067	44.337	44.775
k3	46.394	45.476	44.819
极差 Range	4.098	2.532	1.656
优水平 Excellent level	3	3	3
排序 Sort	纤维素酶>β-葡萄糖苷酶>木聚糖酶

2.4 复合酶酶解条件优化

2.4.1 单因素试验

如图3所示,随着酶解时间增加,蒸汽爆破竹粉纤维素降解率、半纤维素降解率、还原性糖含量以及酶解效果都呈现递增趋势,72 h达到最高值,出于成本考虑,不再大幅度增加时间梯度,因此选择66、72、78 h 3个酶解时间进行后续响应面优化。

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图3 复合酶酶解条件筛选

Fig.3 Screening of complex enzyme enzymolysis conditions

随着酶解温度升高,蒸汽爆破竹粉纤维素降解率、半纤维素降解率、还原性糖含量以及酶解效果均呈现先升高后降低的趋势;在40~45 ℃时升高,50~60 ℃时降低。综合考虑,选择40、45、50 ℃ 3个酶解温度进行后续响应面优化。

随着酶解料水比增加,纤维素降解率、半纤维素降解率均呈现先升高后降低的趋势,还原性糖含量和酶解效果均呈现先升高后趋于平稳的趋势;纤维素降解率、半纤维素降解率在酶解料水比为1:5 g/mL时达到最大值,还原性糖含量在酶解料水比为1:10 g/mL时达到最大值,酶解效果在料水比为1:5 g/mL后趋于平稳。综合考虑,选择1:3、1:5、1:7 g/mL 3个酶解料水比为进行后续响应面优化。

2.4.2 响应面法优化

按照响应面法设计出的3因素3水平的17组试验方案进行试验,结果如表4所示。利用Design Expert 13软件对试验结果进行回归拟合分析,建立出酶解效果(响应值,R)与时间(因素A)、温度(因素B)、料水比(因素C)3个因素之间的函数关系,拟得响应值与因素之间的多元二次回归方程:R=55.90+1.20A-0.424 7B+0.743 2C-0.270 4AB-0.724 0AC-0.427 1BC-1.47A²-2.51B²-2.63C²。

表4 响应面法优化结果

Table 4 Response surface method optimization results

编号 Numbers	时间 Time/ h(A)	温度 Temperature/ ℃(B)	料水比 Material- to-water ratio/ (g/mL)(C)	纤维素降解率 Cellulose degradation rate/%	半纤维素降解率 Hemicellulose degradation rate/%	还原性糖含量 Reducing sugar content/ (mg/g)	酶解效果 Enzymolysis effect
1	72	45	1:5	17.08	20.01	176.208	56.559 9
2	72	45	1:5	15.31	17.37	178.879	55.473 0
3	72	40	1:7	12.19	14.64	173.710	52.032 8
4	66	45	1:7	14.51	13.85	173.060	52.271 6
5	78	50	1:5	14.88	13.74	178.260	53.589 6
6	78	45	1:3	12.22	17.84	175.060	53.774 4
7	78	40	1:5	11.05	15.12	177.320	52.745 6
8	72	45	1:5	15.47	21.15	172.270	55.601 2
9	72	45	1:5	16.28	20.42	175.404	56.291 4
10	78	45	1:7	13.00	14.44	181.523	54.079 0
11	72	40	1:3	9.97	16.03	166.640	50.237 2
12	72	50	1:3	10.18	17.59	170.608	51.943 2
13	72	50	1:7	8.76	13.25	182.246	52.372 1
14	66	40	1:5	8.90	8.19	175.290	48.521 2
15	66	50	1:5	9.96	12.39	181.760	52.261 2
16	72	45	1:5	13.54	22.91	171.137	55.486 0
17	66	45	1:3	8.96	18.44	167.170	51.101 6

如表5所示,此回归模型F=29.16,P<0.000 1,说明此回归模型可靠性达到显著水平,且方程的决定系数(R²)=0.974 0、调整决定系数[

R (A d j) 2

]=0.940 6,表明97.40%的酶解效果可以被此模型解释,方程具有很高的可信度,能很好地描述试验结果。变异系数(CV)=1.02%,说明试验结果离散程度较低,并且变异失拟项P=0.384 6>0.05,说明模型能充分反映实际情况,可对试验结果进行分析与预测。

表5 回归模型方差分析

Table 5 Analysis of variance for regression models

项目 Items	平方和 Sum of squares	自由度 df	均方 Mean square	F值 F-value	P值 P-value
模型 Model	76.86	9	8.54	29.16	<0.000 1
A	10.24	1	10.24	34.97	0.000 6
B	0.626 2	1	0.626 2	2.14	0.187 1
C	3.93	1	3.93	13.41	0.008 0
AB	0.187 2	1	0.187 2	0.639 3	0.450 2
AC	2.10	1	2.10	7.16	0.031 7
BC	0.466 9	1	0.466 9	1.59	0.247 1
A²	9.11	1	9.11	31.12	0.000 8
B²	10.84	1	10.84	37.01	0.000 5
C²	29.16	1	29.16	99.58	<0.000 1
残差 Residual	2.05	7	0.292 8
失拟项 Lack of fit	1.02	3	0.339 9	1.32	0.384 6
纯误差 Pure error	1.03	4	0.257 5
总和 Sum	78.91	16
R²			0.974 0
$R (A d j) 2$			0.940 6
CV/%			1.02

A:时间 time;B:料水比 material-to-water ratio;C:温度 temperature;R²:决定系数 coefficient of determination; $R (A d j) 2$ :调整决定系数 adjusted coefficient of determination;CV:变异系数 coefficient of variation。

如图4所示,通过响应面模型分析,复合酶酶解蒸汽爆破竹粉的最佳工艺条件为:时间74.367 h、料水比1:5.215 g/mL、温度45.483 ℃。在此工艺条件下,蒸汽爆破竹粉酶解效果的模型预测值为56.194 0。为方便试验操作,调整试验参数为:时间74 h、料水比1:5 g/mL、温度46 ℃,试验验证结果蒸汽爆破竹粉酶解效果为57.830 7,与预测值接近。

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图4 复合酶酶解时间、料水比及温度交互作用等高线图及相应响应面图

Fig.4 Contour plots of time, material-to-water ratio and temperature interaction of complex enzyme enzymolysis and corresponding response surfaces

3 讨论

竹屑因其木质纤维素含量过高导致动物难以消化利用,限制了其作为能量饲料在畜禽饲料领域的应用。木质纤维素是由纤维素、半纤维素、木质素3种生物大分子紧密结合形成的一个复合体。研究表明,通过物理预处理、化学预处理、生物预处理3种方式可以有效打开木质纤维素的交联结构,使其降解为动物可以消化的小分子多糖等物质^[17-21]。本试验利用纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶3种酶对蒸汽爆破竹粉进行酶解处理,降低了蒸汽爆破竹粉内的纤维素及半纤维素含量,并提高了还原性糖的含量。

纤维素酶是一种能够水解纤维素中β-1,4-糖苷键的复合酶,它广泛存在于植物和微生物中,但实际生产中主要来源于微生物,包括真菌和细菌^[22]。纤维素酶可以将植物细胞壁中的纤维素降解为可发酵糖,动物消化道内的微生物利用可发酵糖生长并合成可被动物所利用的营养成分,从而提高饲料的利用率,促进动物生长^[23]。冯鹏等^[24]研究发现,添加纤维素酶能够降低青贮玉米秸秆的纤维素、NDF和ADF含量。本研究与冯鹏等^[24]研究一致,添加纤维素酶可有效促进蒸汽爆破竹粉的纤维素向还原性糖的转变,从而促进蒸汽爆破竹粉的动物饲料化利用。β-葡萄糖苷酶是纤维素酶中的一种,它能够水解葡萄糖苷化合物,将其转化为葡萄糖和相应的醛或酮^[25]。β-葡萄糖苷酶在纤维素降解、半乳糖代谢以及多糖分解等生理过程中起着重要作用。本试验中,单独添加纤维素酶或β-葡萄糖苷酶均可以降低蒸汽爆破竹粉内的纤维素含量,且还原性糖含量较酶解前最高提升148.50%和99.52%。木聚糖是半纤维素的一种重要组成成分,广泛存在于各种植物资源中。而木聚糖酶可通过水解木聚糖,破坏细胞壁结构,降低胃肠道食糜的黏性,并提高内源性消化酶的活性,从而促进动物生长和提高饲料转化效率。Liu等^[26]研究表明,在燕麦青贮饲料中接种木聚糖酶,可使NDF、ADF、纤维素和半纤维素含量降低,乳酸和乙酸含量增加,并增加可用代谢糖含量。本试验结果与上述研究结果相近,单独添加木聚糖酶后蒸汽爆破竹粉20.21%的半纤维素得到有效降解,且还原性糖含量相较未添加木聚糖酶组提升了97.28%。

单一消化酶酶解操作简单、易于实施,且成本较低,但处理效果通常不尽如人意。单酶处理效果通常不如复合酶,因为单酶只能针对特定的底物或反应,而复合酶可以同时作用于多个底物,提供更全面的处理效果。复合酶含有多种酶,可以同时降解食物或饲料中多种需降解的抗营养因子及多种养分,最大限度地提高了食品的营养价值。复合酶因其协同增效作用和减少单一酶添加量的优势,应用越来越广泛。复合酶通常包含多种不同的酶,这些酶各自针对特定的底物,不同酶之间可能存在协同作用,即一种酶的活性可以增强另一种酶的活性,或者一种酶的产物可以作为另一种酶的底物。这种协同作用可以提高复合酶的整体效果。蔡灵燕等^[27]利用果胶酶、β-葡萄糖苷酶、纤维素酶3种酶协同酶解玉米秸秆,结果表明3种酶复合处理能明显提高酶解产糖量。正交试验设计是研究多因素多水平的一种试验设计方法,它通过选取具有代表性的试验点来评估多个因素对试验结果的影响。在筛选复合酶的组成及含量方面,正交试验同样适用。正交试验可以减少试验次数,节省了试验成本和时间,提高资源的使用效率,能够同时考虑多个因素和多个水平,通过较少的试验次数评估多个因素对结果的影响。李卫等^[28]根据单一酶试验结果,以多糖得率为指标,进行正交试验筛选最佳复合酶配比,复合酶处理后的多糖得率比单酶处理提升了10%左右。本试验中,与单酶酶解相比,利用正交试验筛选后的复合酶酶解后的纤维素降解率和半纤维素降解率均得到提高。

温度、时间、料水比均是影响酶解效果的重要因素,它们通过影响酶的活性、酶与底物的接触效率以及酶解的彻底程度等,从而共同决定了酶解的效果。消化酶的活性受酶解反应温度的影响,消化酶在其适宜温度下活性最高,能够最大程度地促进酶促反应的发生,催化其底物水解。温度过低会降低酶的催化效率,而温度过高则可能导致酶失活或变性,从而降低酶解效果。酶解时间的长短直接影响底物水解的彻底程度。酶解时间过短,底物无法完全水解,导致酶解不充分;酶解时间过长,则可能导致产物分解,同样影响酶解效果;此外,酶解时间过长还会影响产品的生产周期。料水比会影响酶解体系中底物和酶的浓度。料水比过高或过低都会影响酶与底物的接触效率,进而影响酶解效果。响应面优化方法是一种用于多变量建模和优化的数学统计技术,它可以建立因变量与多个自变量之间的数学关系模型,通过绘画响应面图形,可以直观地判断各变量效应之间的交互作用。目前,响应面优化法被广泛运用于工艺优化方面的研究。皮诗宇等^[29]利用碱性蛋白酶对芝麻粕蛋白进行水解,以芝麻粕蛋白溶出率为考察指标对酶解工艺条件(料水比、酶解温度、酶解时间)进行优化,优化后芝麻粕蛋白溶出率提高了18.58%。叶云芳等^[30]运用响应面分析法,以小麦胚芽中还原性糖含量为评价指标,对α-淀粉酶酶解小麦胚芽中淀粉的最佳工艺进行了研究,在优化条件下,酶解产物的还原性糖含量达(14.75±0.36)%,较优化前显著提升。本试验中,利用响应面方法优化了复合酶最佳酶解条件为:酶解时间74 h、酶解温度46 ℃、料水比1:5 g/mL,此时酶解效果为57.830 7,与优化前对比提升了20.96%。

综上所述,复合酶可有效降解蒸汽爆破竹粉的纤维素和半纤维素,从而提升还原性糖含量,促进了蒸汽爆破竹粉的饲料资源化利用。酶解后的竹粉可以作为动物饲料的成分,提供可发酵糖和其他营养成分。然而,高水分含量可能影响饲料的稳定性和适口性。因此,需要对竹粉进行适当的处理,以确保其在饲料中的有效应用。酶解后的竹粉可以通过离心、过滤或蒸发等方法进行脱水处理,以降低水分含量。脱水后的竹粉可以进一步通过热风干燥、真空干燥或喷雾干燥等方法进行干燥处理,以达到所需的干物质含量。干燥处理不仅可以减少水分含量,还可以提高竹粉的稳定性和储存性。本试验下一步可以通过复合酶与益生菌进行菌酶联用,以最大限度地降低竹粉内的抗营养因子含量,为竹粉饲料开发利用提供理论支持。

4 结论

适用于酶解蒸汽爆破竹粉的复合酶为纤维素酶+β-葡萄糖苷酶+木聚糖酶;3种酶的适宜添加量为纤维素酶2.5%、β-葡萄糖苷酶2%、木聚糖酶添加量1.2%;适宜酶解条件为时间74 h、料水比1:5 g/mL、温度46 ℃。

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原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序

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