入胞抗菌肽对羔羊肠道屏障功能的影响

田宛鑫; 李红岩; 许万鑫; 何文浩; 张晨雪; 姜宁; 赵芳芳; 潘春媛; 李沐阳; 赵磊; 张爱忠

doi:10.12418/CJAN2025.436

动物营养学报 >

2025 , Vol. 37 >Issue 8: 5371 - 5381

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.436

研究论文

入胞抗菌肽对羔羊肠道屏障功能的影响

田宛鑫 ^,¹ ,
李红岩 ¹ ,
许万鑫 ¹ ,
何文浩 ¹ ,
张晨雪 ² ,
姜宁 ¹ ,
赵芳芳 ¹ ,
潘春媛 ¹ ,
李沐阳 ¹ ,
赵磊 ¹ ,
张爱忠 ^,¹^,^*

展开

¹ 黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江省寒区饲料资源高效利用与营养调控重点实验室,大庆 163319
² 内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特 010018

^*张爱忠,教授,博士生导师,E-mail: aizhzhang@sina.com

田宛鑫(1999—),女,辽宁铁岭人,硕士研究生,研究方向为动物营养与饲料科学。E-mail: 1633087628@qq.com

Copy editor: 菅景颖

收稿日期: 2025-01-09

网络出版日期: 2025-08-14

基金资助

国家自然科学基金项目(32072759)

黑龙江省肉牛协同创新与推广体系

收起

Effects of Intracellular Antimicrobial Peptide on Intestinal Barrier Function of Lambs

TIAN Wanxin ^,¹ ,
LI Hongyan ¹ ,
XU Wanxin ¹ ,
HE Wenhao ¹ ,
ZHANG Chenxue ² ,
JIANG Ning ¹ ,
ZHAO Fangfang ¹ ,
PAN Chunyuan ¹ ,
LI Muyang ¹ ,
ZHAO Lei ¹ ,
ZHANG Aizhong ^,¹^,^*

Expand

¹ Key Laboratory of Efficient Utilization of Feed Resources and Nutrition Manipulation in Cold Region of Heilongiiang Province, College of Anima Science and Veterinary Medicine, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China
² College of Veterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China

^*professor, E-mail: aizhzhang@sina.com

Received date: 2025-01-09

Online published: 2025-08-14

Fold

摘要

本研究旨在评估入胞抗菌肽对羔羊肠道屏障功能的影响。试验选用72日龄、体况相近的30只安装十二指肠瘘管的湖羊[平均体重:(18.29±0.49) kg],随机分为5组,包括对照组、阳性对照组、0.5 g/kg入胞抗菌肽组、1.0 g/kg入胞抗菌肽组、2.0 g/kg入胞抗菌肽组,每组6个重复,每个重复1只羊。预试期7 d,正试期35 d。3个添加入胞抗菌肽组每日07:00和17:00分别于十二指肠瘘管灌注0.5、1.0、2.0 g/kg入胞抗菌肽CPP-C3M4(将肽粉溶于5 mL无菌生理盐水,肽粉中抗菌肽含量为22.5 mg/g)。在正试期最后3 d进行攻毒试验,阳性对照组和3个添加入胞抗菌肽组于正试期第33天开始每日08:00通过十二指肠瘘管给每只羊灌注5 mL新鲜培养的鼠伤寒沙门氏菌(菌体浓度为1×10¹³ CFU/mL),连续灌注3 d。结果显示:1)入胞抗菌肽可以穿透羔羊空肠上皮细胞发挥作用。2)与阳性对照组相比,添加1.0和2.0 g/kg入胞抗菌肽能改善羔羊空肠形态结构,显著增加空肠绒毛高度和绒隐比(P<0.05),显著降低隐窝深度(P<0.05)。3)与阳性对照组相比,添加0.5、1.0、2.0 g/kg入胞抗菌肽均显著增加了羔羊空肠中杯状细胞数量和黏蛋白2(MUC2)mRNA相对表达量(P<0.05)。4)添加0.5、1.0、2.0 g/kg入胞抗菌肽均能显著抑制沙门氏菌刺激导致的羔羊血清中内毒素(ET)、D-乳酸(D-LA)含量和二胺氧化酶(DAO)活性升高(P<0.05);与0.5 g/kg入胞抗菌肽组相比,1.0和2.0 g/kg入胞抗菌肽组血清中ET、D-LA含量和DAO活性显著降低(P<0.05)。5)与阳性对照组相比,添加1.0和2.0 g/kg入胞抗菌肽显著提高了羔羊空肠中紧密连接蛋白基因闭锁蛋白(Occludin)、封闭蛋白-1(Claudin-1)、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)mRNA相对表达量(P<0.05)。综上所述,入胞抗菌肽可靶向作用于羔羊小肠上皮细胞,改善肠道屏障功能,维护肠道屏障完整性。从降低饲料成本的角度出发,推荐1.0 g/kg入胞抗菌肽作为饲料添加剂保护羔羊肠道健康。

关键词： 入胞抗菌肽; 羔羊; 肠道屏障; 紧密连接蛋白; 沙门氏菌感染

本文引用格式

田宛鑫 , 李红岩 , 许万鑫 , 何文浩 , 张晨雪 , 姜宁 , 赵芳芳 , 潘春媛 , 李沐阳 , 赵磊 , 张爱忠 . 入胞抗菌肽对羔羊肠道屏障功能的影响[J]. 动物营养学报, 2025 , 37(8) : 5371 -5381 . DOI: 10.12418/CJAN2025.436

Abstract

The purpose of this study was to evaluate the effects of intracellular antibacterial peptide on the intestinal barrier function of lambs. Thirty 72-day-old Hu sheep with duodenal fistula and similar body condition [body weight: (18.29±0.49) kg] were selected and randomly divided into five groups, including control group, positive control group, 0.5 g/kg intracellular antimicrobial peptide group, 1.0 g/kg intracellular antimicrobial peptide group and 2.0 g/kg intracellular antimicrobial peptide group, each group had six replicates and 20 lambs in each replicate. The pre-trial lasted for 7 d and the formal trial lasted for 35 d. The three groups of adding intracellular antimicrobial peptide were administered at 07:00 and 17:00 daily with 0.5, 1.0 and 2.0 g/kg of intracellular antimicrobial peptide CPP-C3M4 (the peptide powder was dissolved in 5 mL of sterile saline, with antimicrobial peptide content of 22.5 mg/g). The challenge test was conducted in the last 3 days of the formal trial period. Each lamb in the positive control group and the three adding intracellular antimicrobial peptide groups received 5 mL of freshly cultured Salmonella typhimurium (with a bacterial concentration of 1×10¹³ CFU/mL) through the duodenal fistula at 08:00 daily from the 33rd day of the formal trial, and the perfusion continued for 3 days. The results showed as follows: 1) intracellular antimicrobial peptide could penetrate the jejunal epithelial cells of lambs to play a role. 2) Compared with the positive control group, adding 1.0 and 2.0 g/kg intracellular antimicrobial peptide could improve the morphological structure of the jejunum of lambs, significantly increase the jejunal villus height and villus height to crypt depth ratio, and reduce the crypt depth (P<0.05), and significantly decrease the jejunal crypt depth (P<0.05). 3) Compared with the positive control group, the number of goblet cells and the mRNA relative expression level of mucin 2 (MUC2) in the jejunum of lambs were significantly increased by adding 0.5, 1.0 and 2.0 g/kg intracellular antimicrobial peptide (P<0.05). 4) Adding 0.5, 1.0 and 2.0 g/kg intracellular antimicrobial peptide all cloud significantly inhibit the increase of endotoxin (ET), D-lactic acid (D-LA) contents and diamine oxidase (DAO) activity in serum of lambs stimulated by Salmonella (P<0.05); compared with the 0.5 g/kg intracellular antimicrobial peptide group, the contents of ET, D-LA and DAO activity in the 1.0 and 2.0 g/kg intracellular antimicrobial peptide groups were significantly decreased (P<0.05). 5) Compared with the positive control group, adding 1.0 and 2.0 g/kg intracellular antimicrobial peptide significantly increased the mRNA relative expression levels of tight junction protein genes in jejunum of lambs, such as Occludin, Claudin-1 and zonula occluden-1 (ZO-1) (P<0.05). In conclusion, intracellular antimicrobial peptide can target and act on the intestinal epithelial cells of lambs, improve the intestinal barrier function and maintain the integrity of intestinal barrier. From the point of view of reducing feed cost, 1.0 g/kg intracellular antimicrobial peptide is recommended as feed additive to protect lamb intestinal health.

Key words： intracellular antibacterial peptide; lambs; intestinal barrier; tight junction protein; Salmonella infection

肠道组织是体内重要的“免疫-代谢-菌群”交互调控器官,其稳态的维持对于肠道生理功能的发挥以及抵抗病原微生物的侵入至关重要。肠道屏障和免疫功能在维持肠道健康方面发挥着重要作用。肠道黏膜免疫系统是动物体内最大的免疫细胞库,对于防御病原体和维持肠道稳态至关重要。腹泻是畜牧生产中常见的疾病,不仅会导致畜禽营养吸收不良、生产性能降低,还可能会导致免疫力下降,破坏肠道上皮细胞的完整性,增加感染其他疾病的风险^[1]。导致羔羊腹泻常见的致病菌有沙门氏菌、产气荚膜梭菌、大肠杆菌、轮状病毒等。沙门氏菌等胞内致病菌作为一类主要生存在宿主细胞内的病原菌,它们可以通过不同的机制逃避宿主的免疫系统,侵入宿主细胞并进行繁殖,破坏自噬,导致细胞损伤和功能障碍,从而引起感染和疾病^[2]。对于腹泻的常规预防和防治通常会采用抗生素等药物,但由于抗生素残留造成的严重环境污染,导致环境微生态失衡和食品安全等问题,其使用受到广泛限制^[3]。因此,迫切需要寻找具有有效生物活性的新型物质,用作抗生素的替代品,用于畜牧业。抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是一类具有广谱抗菌活性的小分子多肽,因其具有快速杀伤活性、低毒性和细胞选择性而被认为是有效的抗生素替代抗菌剂^[4]。抗菌肽不仅具有提高畜禽健康水平和生长性能的潜力^[5-6],在缓解腹泻方面也显示出了积极的效果^[7-8]。它们能够抑制或杀灭引起腹泻的病原微生物,如细菌、真菌、病毒和寄生虫等,从而减少畜禽的疾病发生和传播。然而,大部分广谱抗菌肽无法穿过哺乳动物细胞膜屏障,为了提高抗菌肽对导致羔羊腹泻的胞内致病菌——沙门氏菌的杀伤能力,本实验室将利用噬菌体展示技术筛选出的羊小肠上皮细胞特异性穿透肽作为载体^[9],偶联Cec Md衍生抗菌肽C3M4形成了入胞抗菌肽CPP-C3M4,拟通过入胞抗菌肽CPP-C3M4作为饲料添加剂来靶向、精准干预羔羊腹泻,以提高抗菌肽杀伤胞内致病菌的作用效率,为饲用抗菌肽的推广应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

入胞抗菌肽来源:本实验室利用噬菌体展示技术筛选出能够与羊小肠上皮细胞特异性结合的穿透肽,偶联有较好抗菌性及低溶血性的广谱Cec Md衍生抗菌肽C3M4,形成入胞抗菌肽CPP-C3M4^[10],并在此基础上连接增强绿色荧光蛋白(EGFP),将抗菌肽CPP-C3M4-EGFP毕赤酵母重组菌进行培养发酵,发酵菌液进行4 200×g离心15 min,去除菌体沉淀;使用实验室小型抽滤装置,将菌液过0.45 μm滤膜进行抽滤;将抽滤后不含菌体的发酵液加入微晶纤维素作为载体,利用YC-2100真空喷雾干燥机进行喷粉,得到入胞抗菌肽粉,该肽粉中抗菌肽含量为22.5 mg/g。

沙门氏菌来源:试验使用的鼠伤寒沙门氏菌CMCC50115为黑龙江八一农垦大学动物科技学院动物营养研究所保存菌种。

1.2 试验动物与试验设计

试验选72日龄、体况相近的30只安装有永久性十二指肠瘘管绵羊(湖羊)作为试验动物,平均体重为(18.29±0.49) kg。按照体况相近原则随机分为5组,分别为对照组、阳性对照组、0.5 g/kg入胞抗菌肽组、1.0 g/kg入胞抗菌肽组、2.0 g/kg入胞抗菌肽组,每组6个重复,每个重复1只羊。饲养试验预试期7 d,正试期35 d,其中预试期和正试期前30 d在黑龙江八一农垦大学动物科技学院实验动物中心进行,正试期第31天转至哈药集团生物疫苗有限公司实验动物中心,于正试期第33~35天进行攻毒试验。试验动物伦理审批机构为黑龙江八一农垦大学,审查登记号为DWKJXY2022064。

基础饲粮参照《肉羊营养需要量》(NY/T 816—2021)配制,其组成及营养水平见表1。试验期间各组羔羊均饲喂基础饲粮,每日07:00和17:00饲喂,准确记录每只羔羊每日的投料量和剩料量,控制每日剩料量不超过投料量的5%,以保证羔羊的随意采食量。在此基础上,3个添加入胞抗菌肽组羔羊分别按照每千克饲粮(饲喂量根据每周平均采食量进行调整)0.5、1.0、2.0 g的添加量将所需入胞抗菌肽溶于5 mL无菌生理盐水,并通过十二指肠瘘管灌注,对照组及阳性对照组灌注等量无菌生理盐水。正试期第33~35天,阳性对照组及各入胞抗菌肽组羔羊每日08:00通过十二指肠瘘管灌注5 mL鼠伤寒沙门氏菌(根据前期预试验结果,确定菌体浓度为1×10¹³ CFU/mL)。正试期结束后将全部羔羊屠宰,宰前12 h禁食禁水。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

项目Items	含量Content
原料Ingredients
羊草Leymus chinensis	20.00
苜蓿Alfalfa	10.00
玉米Corn	49.00
豆粕Soybean meal	11.07
玉米蛋白粉Corn protein meal	1.00
花生仁粕Peanut meal	3.00
棉籽粕Cottonseed meal	1.00
菜籽粕Rapeseed meal	1.00
棕榈脂肪粉Palm fat powder	1.00
磷酸氢钙CaHPO4	1.20
石粉Limestone	0.60
食盐NaCl	0.33
蛋氨酸Met	0.10
维生素预混料Vitamin premix1)	0.20
微量元素预混料Trace element premix2)	0.50
合计Total	100.00
营养水平Nutrient levels3)
干物质DM	90.47
代谢能ME/(MJ/kg)	10.80
粗蛋白质CP	15.99
粗脂肪EE	3.90
中性洗涤纤维NDF	27.19
酸性洗涤纤维ADF	14.30
钙Ca	0.93
磷P	0.52
粗灰分Ash	4.23

1)维生素预混料为每千克饲粮提供Vitamin premix provided the following per kilogram of the diet:VA 11 000 IU,VD 5 000 IU,VE 50 mg,VB₁ 25 mg,VB₂50 mg,VB₆ 22 mg,VB₁₂ 0.3 mg,VB₅ 22 mg。
2)微量元素预混料为每千克饲粮提供 Trace element premix provided the following per kilogram of the diet:Fe 75 mg,Cu 14 mg,Mn 60 mg,Zn 85 mg,I 0.5 mg,Se 0.3 mg,Co 0.3 mg。
3)代谢能根据NY/T 816—2021计算得出,其余为实测值。ME was calculated according to NY/T 816—2021, while the others were measured values.

1.3 样品采集

羔羊屠宰前先颈静脉采血,采集的血液经4 ℃、1 699×g离心处理15 min,将获得的血清分装至无菌冻存管,于-20 ℃保存,以供后续指标测定。羔羊屠宰后收集空肠组织,并于-80 ℃保存以供后续研究。将部分空肠组织固定在4%多聚甲醛溶液中用于组织学观察,部分样品浸没在预冷的D-Hanks平衡盐溶液中用于原代羊小肠上皮细胞分离及胞内荧光观察。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 空肠上皮细胞荧光观察

参照张博夫^[11]的方法提取空肠上皮细胞。将空肠样品剪碎放入D-Hanks平衡盐溶液中冲洗干净后,置于50 mL无菌EP管中,加入适量胰酶,37 ℃消化10 min后弃掉上清(重复5次);将组织用D-Hanks平衡盐溶液清洗3次,放入新的无菌EP管中加入胰酶,37 ℃消化10 min后开始收集细胞;将消化液用200目细胞过滤网过滤后取1 mL于6孔板中,置于荧光显微镜下观察胞内荧光。

1.4.2 空肠组织形态观察及杯状细胞数量检测

参考王可鑫^[12]的染色及测量方法,对固定在4%的多聚甲醛溶液中的空肠组织的目的区域进行40和100倍成像,测量空肠绒毛高度、隐窝深度,计算绒隐比(绒毛高度/隐窝深度),并对空肠绒毛进行杯状细胞计数。

1.4.3 肠道通透性检测

采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(上海优选生物科技有限公司)测定血清中内毒素(ET)、D-乳酸(D-LA)含量和二胺氧化酶(DAO)活性,对羔羊空肠通透性进行评估。

1.4.4 空肠中屏障相关基因表达分析

采用实时荧光定量PCR技术对羔羊空肠中紧密连接蛋白[闭锁蛋白(Occludin)、封闭蛋白-1(Claudin-1)、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)]以及黏蛋白2(MUC2)mRNA表达情况进行检测。各基因的引物序列见表2。参考王可鑫^[12]的检测方法,荧光染料使用2×inNova Taq SYBR Green qPCR Mix。反应总体系为20 μL,反应条件: 95 ℃预变性,3 min,1个循环;95 ℃变性15 s,60 ℃退火和延伸30 s,40个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因,用2^-△△Ct法计算目的基因mRNA相对表达量。

表2 实时荧光定量PCR的引物序列

Table 2 Primer sequences for quantitative real-time PCR

基因 Genes	引物序列 Primer sequence (5'—3')	GenBank登录号 GenBank accession number
封闭蛋白-1 Claudin-1	F:GTCTTTGGGGGCGTGATCTT R:CCAGCCAATGAAGAGAGCCT	NM_001185016.1
闭锁小带蛋白-1 ZO-1	F:TGACGGTTGGTCTTTTGCTCT R:CACAGTTTGCGCCAACAAGA	XM_060401407.1
闭锁蛋白Occludin	F:ACGTTCGACCAATGCTGTCC R:AAGAGTGGAGGCAACACAGG	XM_015101257.4
黏蛋白2 MUC2	F:ACTGCCCTACACCAAGTTCG R:GAGAGGCCGTTGTAGGACAC	XM_060404192.1
甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH	F:TACTGGCAAAGTGGACATCG R:GATGACGAGCTTCCCGTTCT	XM_060411595.1

1.5 数据统计分析

试验数据经Excel 2016软件初步处理后,使用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),并采用Tukey法进行多重比较。试验结果采用平均值和均值标准误(SEM)表示,以P<0.05为差异显著,P>0.05为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 羔羊空肠上皮细胞荧光观察

由图1可以看出,入胞抗菌肽组羔羊空肠上皮细胞中有绿色荧光出现,而对照组和阳性对照组中没有绿色荧光出现。

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图1 羔羊空肠上皮细胞荧光图

A:对照组;B:阳性对照组;C:0.5 g/kg入胞抗菌肽组;D:1.0 g/kg入胞抗菌肽组;E:2.0 g/kg入胞抗菌肽组。图2同。

Fig.1 Fluorogram of jejunal epithelial cells of lambs (4×)

A: control group; B: positive control group; C: 0.5 g/kg intracellular antimicrobial peptide group; D: 1.0 g/kg intracellular antimicrobial peptide group; E: 2.0 g/kg intracellular antimicrobial peptide group. The same as Fig.2.

2.2 入胞抗菌肽对羔羊空肠组织形态的影响

由图2可以看出,对照组羔羊的空肠黏膜形态结构完好,绒毛排列有序;而沙门氏菌感染导致空肠绒毛排列紊乱,绒毛长度不一,呈现出绒毛缩短、略微肿胀和脱落的现象;与阳性对照组相比,补充不同水平入胞抗菌肽组的空肠绒毛形态较为完整且排列整齐,肿胀现象有所缓解,上皮脱落程度较轻。由表3可知,与对照组相比,阳性对照组羔羊空肠绒毛高度、绒隐比均显著降低(P<0.05),隐窝深度无显著变化(P>0.05);与阳对照组相比,1.0和2.0 g/kg入胞抗菌肽组空肠绒毛高度显著增加(P<0.05);3个不同剂量的入胞抗菌肽均能显著缓解由沙门氏菌感染导致的隐窝深度升高和绒隐比的降低(P<0.05),其中1.0和2.0 g/kg入胞抗菌肽组空肠绒隐比还显著高于对照组(P<0.05)。

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图2 羔羊空肠组织切片

Fig.2 Jejunal tissue sections of lambs (40×)

表3 入胞抗菌肽对羔羊空肠组织形态的影响

Table 3 Effects of intracellular antimicrobial peptide on jejunal tissue morphology of lambs

项目 Items	对照组 Control group	阳性对照组 Positive control group	0.5 g/kg入胞抗菌肽组 0.5 g/kg intracellular antimicrobial peptide group	1.0 g/kg入胞抗菌肽组 1.0 g/kg intracellular antimicrobial peptide group	2.0 g/kg入胞抗菌肽组 2.0 g/kg intracellular antimicrobial peptide group	均值标准误 SEM	P值 P-value
绒毛高度VH/μm	687.49^a	504.51^b	573.59^b	662.92^a	697.65^a	21.046	<0.001
隐窝深度CD/μm	368.56^ab	387.01^a	341.96^b	213.91^c	243.63^c	18.804	<0.001
绒隐比VH/CD	1.87^b	1.30^c	1.68^b	3.10^a	2.87^a	0.188	<0.001

	同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
	In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

**2.3 入胞抗菌肽对羔羊空肠中杯状细胞数量和MUC2基因表达的影响**

如图3、图4可知,与对照组相比,阳性对照组羔羊空肠中杯状细胞数量和MUC2 mRNA相对表达量显著减少(P<0.05);与阳对照组相比,3个添加入胞抗菌肽组羔羊空肠中杯状细胞数量和MUC2 mRNA相对表达量显著增加(P<0.05)。

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图3 入胞抗菌肽对羔羊空肠中杯状细胞数量的影响

数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下图同。

Fig.3 Effects of intracellular antimicrobial peptide on number of goblet cells in jejunum of lambs

Data column with different lowercase letters indicated significant difference (P<0.05). The same as below.

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**图4 入胞抗菌肽对羔羊空肠中MUC2基因表达的影响**

Fig.4 Effects of intracellular antimicrobial peptide on expression of MUC2 gene in jejunum of lambs

2.4 入胞抗菌肽对羔羊肠道通透性的影响

由图5可知,羔羊血清中ET、D-LA含量和DAO活性在沙门氏菌刺激下显著升高(P<0.05);添加入胞抗菌肽可显著降低感染沙门氏菌羔羊血清中ET、D-LA含量和DAO活性(P<0.05);1.0和2.0 g/kg入胞抗菌肽组羔羊血清中ET、D-LA含量和DAO活性与0.5 g/kg入胞抗菌肽组相比显著降低(P<0.05),1.0和2.0 g/kg入胞抗菌肽组间差异不显著(P>0.05)。

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图5 入胞抗菌肽对羔羊肠道通透性的影响

Fig.5 Effects of intracellular antimicrobial peptide on intestinal permeability of lambs

2.5 入胞抗菌肽对羔羊空肠中紧密连接蛋白基因表达的影响

由图6可知,与对照组相比,经沙门氏菌刺激后,阳性对照组羔羊空肠中紧密连接蛋白基因Claudin-1、ZO-1和Occludin mRNA相对表达量显著降低(P<0.05);相较于阳性对照组,1.0和2.0 g/kg入胞抗菌肽组空肠中Claudin-1、ZO-1和Occludin mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)。

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图6 入胞抗菌肽对羔羊空肠中紧密连接蛋白基因表达的影响

Fig.6 Effects of intracellular antibacterial peptide on expression of tight junction protein genes in jejunum of lambs

3 讨论

与传统的光谱抗菌肽不同,特异性靶向抗菌肽(STAMPs)由于其独特的膜溶解机制,细菌很难对其产生耐药性,并且STAMPs可以维持正常的生态平衡,为机体提供长期保护^[13]。膜破坏肽/肽模拟物(MDPs)等抗菌剂,需要通过细胞膜的物理破坏才能呈现通用的杀伤机制^[14]。本研究通过荧光显微镜对空肠组织进行观察发现,3个添加入胞抗菌肽组空肠上皮细胞中均有绿色荧光出现,说明入胞抗菌肽具有穿透细胞膜的能力,可以提高抗菌肽杀伤沙门氏菌等胞内致病菌的效率^[9]。这种靶向性是入胞抗菌肽区别于传统光谱抗菌肽的关键特点,它允许抗菌肽穿透细胞膜,直接在细胞内部发挥作用,从而提高对胞内致病菌的杀伤效率。

肠道绒毛和隐窝的结构和功能状态对于评估肠道健康至关重要,它们的变化可以反映肠道的消化吸收能力、屏障功能和免疫状态^[15]。在本研究中,与对照组相比,阳性对照组羔羊空肠绒毛高度、绒隐比均显著降低,而隐窝深度显著升高,这可能是由于沙门氏菌感染导致了肠道损伤^[16];而相较于阳性对照组,添加入胞抗菌肽组羔羊空肠绒毛高度和绒隐比显著升高,隐窝深度降低,表明入胞抗菌肽有助于保护肠道形态结构,减轻炎症和损伤,从而保护肠道上皮细胞的完整性,这与其具有穿透小肠上皮细胞直接作用于胞内致病菌的能力密切相关。与本研究结果与张海文^[17]的研究结果一致,张海文^[17]对存在细胞内作用机制的抗菌肽C-BF进行研究,结果提示抗菌肽C-BF可明显改善葡聚糖硫酸钠(DSS)导致的结肠上皮形态破坏,且抗菌肽预处理组对单个上皮细胞的正常生长同样具有保护作用。

杯状细胞及其分泌的黏液(主要由黏蛋白和黏多糖组成)在肠道屏障和黏膜免疫中发挥着重要作用,它们不仅构成了肠道的物理屏障,防止病原体侵入黏膜引起肠道炎症,而且在维持肠道免疫和黏膜稳态方面发挥积极作用,是胃肠道抵抗外界侵害的第1道防线^[18-19]。MUC2是小肠黏液的主要组成部分,与水、无机盐、抗菌肽等共同组成黏液层^[20]。Nyström等^[21]研究表明,杯状细胞数量有助于促进黏膜屏障的形成,保护肠上皮细胞免受微生物的侵害,对于维持结肠黏膜屏障功能至关重要。刘胜胜^[22]为提高抗菌肽在生物体内的利用度,利用纳米载体修饰抗菌肽,靶向进入结肠组织,发现其能够显著改善由DSS引起的小鼠结肠黏膜屏障的缺失,还可以通过上调ZO-1、Occludin等紧密连接蛋白和MUC2的表达来修复结肠黏膜屏障。本研究中,与对照组相比,阳性对照组羔羊由于沙门氏菌感染导致肠道上皮细胞损伤,杯状细胞功能出现障碍,黏液分泌减少,羔羊空肠中杯状细胞数量和MUC2 mRNA相对表达量显著减少,进而影响了肠道屏障功能。而经入胞抗菌肽预防的羔羊,沙门氏菌刺激后空肠中杯状细胞数量和MUC2 mRNA相对表达量相较于阳性对照组显著增加,同样表明入胞抗菌肽有助于维持杯状细胞数量,增强肠道的保护和免疫功能。这进一步证实了杯状细胞在肠道健康中的核心作用,以及入胞抗菌肽在恢复和增加杯状细胞数量、增强肠道保护和免疫功能方面的潜力。

肠道通透性是评估肠道屏障功能的重要指标,过高的通透性可能导致有害物质进入血液,引发炎症反应^[23]。紧密连接蛋白是许多致病细菌和病毒的靶标^[24],其作为肠道屏障功能的关键组成部分,可以调节肠上皮细胞通透性,维持肠道上皮的完整性,防止病原体和有害物质的侵入,破坏肠道黏膜的完整性,引发炎症反应和肠道疾病^[25-26]。刘倚帆^[27]对动物源抗菌肽进行分子改良,并利用猪小肠上皮细胞为模型研究其对猪肠道上皮屏障功能的保护作用,该研究发现一些抗菌肽存在细胞内作用机制,结果提示抗菌肽可能通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路促进小肠上皮细胞中紧密连接蛋白的表达,以维持紧密连接结构完整性,进而保护肠道上皮屏障,显著缓解肠道炎症和改善肠道物理屏障功能。张海文^[17]对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠道进行了研究,进一步确认了抗菌肽可通过改善紧密连接蛋白的表达维持肠道物理屏障功能正常。Xu等^[28]将肠道靶向工程颗粒疫苗(EPV)用于STAMPs递送,进一步研究结果表明,EPV@STAMP增加了结肠组织中紧密连接蛋白(Occludin、ZO-1)的表达,并且发现EPV@STAMP比单独的STAMPs表现出更强的对结肠感染的保护作用,这可能是靶向作用提高了抗菌肽的利用率,实现了黏膜修复、增强肠道屏障完整性以抵抗细菌入侵。这些研究结果均强调了紧密连接蛋白在维持肠道通透性及屏障功能中的重要作用,并为针对肠道疾病的治疗提供了新的视角。病原菌如沙门氏菌会破坏黏膜屏障结构、功能及完整性,造成共生菌、ET等被动通过上皮,引发全身性反应^[29],紧密连接蛋白构成的复合物结构能够有效封闭细胞间隙,阻止病原体、ET的侵入^[30]。本研究中,沙门氏菌刺激导致羔羊肠道通透性增加,抑制了紧密连接蛋白基因的表达,破坏了肠道黏膜的完整性;而与阳性对照组相比,经入胞抗菌肽保护的羔羊肠道通透性显著降低,紧密连接蛋白基因的表达也均有不同程度的升高,且1.0和2.0 g/kg入胞抗菌肽效果更明显。入胞抗菌肽可能通过靶向杀菌机制调节这些基因的表达,减少细胞旁通作用,从而降低肠道通透性,阻止沙门氏菌进入体循环,保护肠道屏障功能。

4 结论

入胞抗菌肽可靶向作用于羔羊小肠上皮细胞,改善肠道屏障功能,维护肠道屏障完整性。从降低饲料成本的角度出发,选择1.0 g/kg入胞抗菌肽作为饲料添加剂保护羔羊肠道健康更合适。

参考文献

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