蛋鸡饲粮钙磷比通过维生素D的α-羟化过程及钙、磷吸收相关基因的表达影响蛋品质

朱子均; 王梦瑶; 袁顺华; 李逍遥; 易雅; 郭辉; 曹满湖

doi:10.12418/CJAN2025.443

动物营养学报 >

2025 , Vol. 37 >Issue 8: 5463 - 5474

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.443

研究论文

蛋鸡饲粮钙磷比通过维生素D的α-羟化过程及钙、磷吸收相关基因的表达影响蛋品质

朱子均 ^,¹ ,
王梦瑶 ¹ ,
袁顺华 ¹ ,
李逍遥 ¹ ,
易雅 ¹ ,
郭辉 ² ,
曹满湖 ^,¹^,^*

展开

¹ 湖南农业大学动物科学技术学院,长沙 410128
² 广州亿如生物科技有限公司,广州 510700

^*曹满湖,教授,博士生导师,E-mail: caomanhu@hunau.edu.cn

朱子均(2000—),男,湖南长沙人,硕士研究生,研究方向为动物营养与饲料科学。E-mail: 2248875457@qq.com

Copy editor: 靳爽

收稿日期: 2024-12-27

网络出版日期: 2025-08-14

基金资助

国家重点研发计划(2021YFD1300204)

收起

Dietary Calcium/Phosphorus Ratio Affects Egg Quality through α-Hydroxylation Process of Vitamin D and Genes Expression Related to Calcium and Phosphorus Absorption in Laying Hens

ZHU Zijun ^,¹ ,
WANG Mengyao ¹ ,
YUAN Shunhua ¹ ,
LI Xiaoyao ¹ ,
YI Ya ¹ ,
GUO Hui ² ,
CAO Manhu ^,¹^,^*

Expand

¹ College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
² Guangzhou Yiru Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou 510700, China

^*professor, E-mail: caomanhu@hunau.edu.cn

Received date: 2024-12-27

Online published: 2025-08-14

Fold

摘要

本试验通过分析不同钙磷比饲粮对蛋鸡生产性能、蛋品质、胫骨质量、血清生化指标以及维生素D α-羟化和钙、磷吸收相关基因表达的影响,旨在探究饲粮钙磷比影响蛋品质的潜在作用机制。选用48周龄产蛋高峰期海兰褐蛋鸡108只,随机分为3组,每组6个重复,每个重复6只鸡。3组试验鸡分别饲喂正常钙磷比(3.6%钙、0.5%磷,钙磷比为7.2∶1)、低钙磷比(3.0%钙、0.5%磷,钙磷比为6.0∶1)和高钙磷比(4.2%钙、0.5%磷,钙磷比为8.4∶1)饲粮。预试期1周,正试期4周。结果表明:1)与正常钙磷比组和高钙磷比组相比,低钙磷比组蛋鸡产蛋率极显著降低(P<0.01),蛋壳厚度显著降低(P<0.05),血清1,25-二羟基维生素D₃[1,25-(OH)₂D₃]和甲状旁腺激素(PTH)含量均显著提高(P<0.05)。低钙磷比组蛋鸡十二指肠细胞膜维生素D受体(mVDR)、细胞核维生素D受体(nVDR)、钙结合蛋白-D28K(CABP-D28K)、质膜钙ATP酶1b(PMCA1b)、钠依赖Ⅱb型磷转运蛋白(Na/Pi-Ⅱb)和肝脏细胞色素P450家庭成员24A1(CYP24A1)的mRNA相对表达量均极显著高于正常钙磷比组和高钙磷比组(P<0.01),肝脏成纤维细胞生长因子23(FGF23)、克洛索蛋白(Klotho)的mRNA相对表达量极显著低于正常钙磷比组和高钙磷比组(P<0.01)。2)随着饲粮钙磷比的提高,蛋鸡蛋壳强度、平均蛋重、胫骨钙、磷含量和血清FGF23、Klotho含量均呈现出上升趋势,但差异不显著(P>0.05)。3)与正常钙磷比组相比,高钙磷比组蛋鸡蛋壳厚度、蛋壳强度、平均蛋重、产蛋率等均无显著变化(P>0.05),十二指肠mVDR、nVDR、CABP-D28K、PMCA1b、Na/Pi-Ⅱb和肝脏CYP24A1、FGF23、Klotho的mRNA相对表达量也均无显著变化(P>0.05)。综上所述,低钙磷比饲粮会降低蛋鸡蛋壳强度和蛋壳厚度,对蛋品质产生不利影响,蛋鸡体内指标的响应为:通过代偿性代谢机制下调肝脏FGF23、Klotho的表达,降低对CYP24A1的抑制作用,从而间接促进1,25-(OH)₂D₃的生成;同时,通过上调十二指肠钙、磷吸收相关基因nVDR、mVDR、CABP-D28K、PMCA1b、Na/Pi-Ⅱb的表达,促进钙、磷吸收。而这些指标在饲粮钙磷比高于正常营养需要时无响应。

关键词： 钙磷比; 蛋鸡; 维生素D; α-羟化; 钙、磷吸收; 蛋品质

本文引用格式

朱子均 , 王梦瑶 , 袁顺华 , 李逍遥 , 易雅 , 郭辉 , 曹满湖 . 蛋鸡饲粮钙磷比通过维生素D的α-羟化过程及钙、磷吸收相关基因的表达影响蛋品质[J]. 动物营养学报, 2025 , 37(8) : 5463 -5474 . DOI: 10.12418/CJAN2025.443

Abstract

This study aimed to investigate the potential mechanisms of dietary calcium/phosphorus (Ca/P) ratio on egg quality by analyzing its effects on the production performance, egg quality, tibia quality, serum biochemical indices and the expression of genes related to vitamin D α-hydroxylation, calcium and phosphorus absorption in laying hens. One hundred and eight 48-week-old Hy-Line brown laying hens at the peak laying period were selected and randomly divided into 3 groups with 6 replicates per group and 6 hens in each replicate. Hens in each group were fed diets with normal (3.6% Ca, 0.5% P, Ca/P=7.2∶1), low (3.0% Ca, 0.5% P, Ca/P=6.0∶1) and high (4.2% Ca, 0.5% P, Ca/P=8.4∶1) Ca/P ratios, respectively. The pre-experimental period lasted for 1 week, and the experimental period lasted for 4 weeks. The results showed as follows: 1) compared with the normal Ca/P ratio group and the high Ca/P ratio group, the laying rate of laying hens in the low Ca/P ratio group was extremely significantly decreased (P<0.01), the eggshell thickness was significantly decreased (P<0.05), and the contents of serum 1,25-dihydroxyvitamin D₃ [1,25-(OH)₂D₃] and parathyroid hormone (PTH) were significantly increased (P<0.05). The mRNA relative expression levels of membrane vitamin D receptor (mVDR), nuclear vitamin D receptor (nVDR), calcium-binding protein-D28K (CABP-D28K), plasma membrane calcium ATPase 1b (PMCA1b), sodium-dependent type Ⅱb phosphorus transporter (Na/Pi-Ⅱb) in duodenum, and cytochrome P450 family member 24A1 (CYP24A1) in liver in the low Ca/P ratio group were extremely significantly higher than those in the normal Ca/P ratio group and the high Ca/P ratio group (P<0.01), while the mRNA relative expression levels of fibroblast growth factor 23 (FGF23) and Klotho in liver were extremely significantly lower than those in the normal Ca/P ratio group and the high Ca/P ratio group (P<0.01). 2) With the increased in dietary Ca/P ratio, eggshell strength, average egg weight, tibia calcium and phosphorus contents, and serum FGF23 and Klotho contents showed upward trends, though the differences were not significant (P>0.05). 3) Compared with the normal Ca/P ratio group, the high Ca/P ratio group showed no significant changes in eggshell thickness, eggshell strength, average egg weight, laying rate (P>0.05), as well as the mRNA relative expression levels of mVDR, nVDR, CABP-D28K, PMCA1b, Na/Pi-Ⅱb in duodenum, and CYP24A1, FGF23 and Klotho in liver of laying hens (P>0.05). In conclusion, a low Ca/P ratio diet reduces eggshell strength and thickness, negatively affecting egg quality. The responses of indicators in laying hens are as follows: through a compensatory metabolic mechanism, the expression of FGF23 and Klotho in liver is downregulated, reducing the inhibitory effect on CYP24A1, thereby indirectly promoting the production of 1,25-(OH)₂D₃. Meanwhile, the expression of nVDR, mVDR, CABP-D28K, PMCA1b, Na/Pi-Ⅱb in duodenum related to calcium and phosphorus absorption is upregulated to enhance calcium and phosphorus absorption. However, these indicators show no response when the dietary Ca/P ratio exceeds normal nutritional requirements.

Key words： calcium/phosphorus ratio; laying hens; vitamin D; α-hydroxylation; calcium and phosphorus absorption; egg quality

钙和磷是蛋鸡体内极为重要的2种矿物元素,二者约占其总矿物元素含量的70%^[1]。蛋鸡在产蛋高峰期时需要大量的钙和足够的磷,以满足正常的新陈代谢和产蛋需求。钙磷比例失调会导致蛋鸡骨骼脆弱、生产性能下降^[2-3]。大量研究表明,钙、磷的吸收受到多种因素的影响,如动物日龄、饲粮钙和磷水平及钙磷比、维生素D、激素等,其中维生素D被认为是影响钙、磷吸收的核心因素^[4]。近十年来,医学领域的研究显示,维生素D和钙、磷的吸收及相关疾病,均与成纤维细胞生长因子23(fibroblast growth factor 23,FGF23)和抗衰因子克洛索蛋白(Klotho)密切相关^[5-6]。研究表明,FGF23可抑制1-α羟化酶基因的表达,减少1,25-二羟基维生素D₃[1,25-(OH)₂D₃]的活化与生成,最终通过抑制肾脏中钠依赖Ⅱa型磷转运蛋白(Na/Pi-Ⅱa)和钠依赖Ⅱc型磷转运蛋白(Na/Pi-Ⅱc)的表达,降低肾脏对钙、磷的重吸收并增加钙、磷排泄量,从而调节血液中钙磷平衡,维持机体钙、磷的正常代谢^[7-8]。然而,目前在蛋鸡生产上,关于饲粮钙、磷水平及其比例对蛋品质影响的机制研究尚不深入,蛋品质调控的理论基础仍显不足,且针对FGF23/Klotho轴对钙、磷吸收及蛋品质影响的研究较少。因此,本研究从维生素D的α-羟化及其调控因素FGF23、Klotho等着手,分析不同钙磷比饲粮对蛋鸡生产性能、蛋品质、胫骨质量、血清生化指标以及维生素D α-羟化和钙、磷吸收相关基因表达的影响,旨在探究饲粮钙磷比影响蛋品质的潜在作用机制,从而为蛋鸡生产中饲粮钙磷比的精准配制和蛋品质的调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本研究中所采用的所有动物试验方案均符合《实验动物福利伦理审查指南》(GB/T 35892—2018),并经湖南农业大学生物医学研究伦理委员会批准,批准编号为2024179。

1.2 试验设计与饲养管理

选取48周龄产蛋高峰期海兰褐蛋鸡108只,随机分为3组,每组6个重复,每个重复6只鸡,各组间蛋鸡产蛋率、蛋重、蛋品质等指标均无显著差异(P>0.05)。3组试验鸡分别饲喂正常钙磷比(3.6%钙、0.5%磷,钙磷比为7.2∶1)、低钙磷比(3.0%钙、0.5%磷,钙磷比为6.0∶1)和高钙磷比(4.2%钙、0.5%磷,钙磷比为8.4∶1)饲粮。试验期5周,其中预试期1周,正试期4周(依据蛋鸡肠道组织更新周期及从卵子成熟到1枚鸡蛋形成所需时间设定)。正常钙磷比饲粮参照NRC(1994)^[9]家禽营养需要配制,通过调整该饲粮中石粉和沸石粉添加比例,配制低钙磷比和高钙磷比饲粮,3种饲粮组成及营养水平见表1。

表1 试验饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) %

项目 Items	低钙磷比组 Low Ca/P ratio group	正常钙磷比组 Normal Ca/P ratio group	高钙磷比组 High Ca/P ratio group
原料Ingredients
玉米Corn	54.00	54.00	54.00
豆粕Soybean meal	30.00	30.00	30.00
大豆油Soybean oil	2.79	2.79	2.79
磷酸氢钙CaHPO₄	1.00	1.00	1.00
石粉Limestone	7.60	9.37	11.13
植酸酶Phytase	0.03	0.03	0.03
蛋氨酸Met	0.15	0.15	0.15
食盐NaCl	0.30	0.30	0.30
氯化胆碱Choline chloride	0.10	0.10	0.10
沸石粉Zeolite powder	3.53	1.76
多矿Multi-minerals1)	0.20	0.20	0.20
多维Multi-vitamins2)	0.30	0.30	0.30
合计Total	100.00	100.00	100.00
营养水平Nutrient levels3)
代谢能ME/(MJ/kg)	11.34	11.34	11.34
粗蛋白质CP	17.22	17.25	17.17
赖氨酸Lys	1.00	1.00	1.00
蛋氨酸Met	0.41	0.41	0.41
钙Ca	3.00	3.60	4.20
总磷TP	0.50	0.50	0.50

1)多矿为每千克饲粮提供Multi-minerals provided the following per kg of diets:Cu 10 mg,I 0.7 mg,Fe 110 mg,Zn 85 mg,Se 0.3 mg,Co 0.2 mg,Mn 120 mg。
2)多维为每千克饲粮提供Multi-vitamins provided the following per kg of diets:VA 8 000 IU,VB₆ 1.02 mg,VK₃ 1.04 mg,VE 13.33 mg,VB₁ 0.34 mg,VB₂ 1.67 mg,VD₃ 4 000 IU,VB₁₂ 500 mg,生物素 biotin 416.67 mg,D-泛酸 D-pantothenic acid 1.02 mg,叶酸 folic acid 0.17 mg,烟酸 nicotinic acid 10 mg。
3)粗蛋白质、钙和总磷为实测值,分别参考GB/T 6432—2018、GB/T 6436—2018和GB/T 6437—2018测定;其余为计算值,根据《中国饲料成分及营养价值表(2018年第29版)》计算得出。CP, Ca and TP were measured values, which were determined according to GB/T 6432—2018, GB/T 6436—2018 and GB/T 6437—2018, respectively; while the others were calculated values according to Tables of Feed Composition and Nutritive Values in China (29th edition, 2018).

试验前对鸡舍进行薰蒸和消毒液双重消毒。采用笼养方式,鸡只自由采食和饮水,鸡舍温度控制在24 ℃左右,相对湿度控制在60%~70%,保证空气流通,定期打扫卫生。预试期与正试期饲养管理条件一致。

1.3 样品采集

试验第4周时,每个重复随机选取4枚鸡蛋用于蛋品质检测。饲养试验结束后,从每个重复中随机选取1只体重接近该重复平均体重且健康的鸡,经颈动脉取血后屠宰。采集的血液在805×g下离心15 min,取血清置于-20 ℃冰箱中保存,用于测定血清生化指标;剥离蛋鸡两侧胫骨,用锡纸将胫骨包裹后置于-80 ℃冰箱中保存,用于测定胫骨质量;截取肝脏组织和十二指肠肠段,使用载玻片刮取肠黏膜组织,先置于液氮中速冻,随后转移至-80 ℃冰箱中保存,用于测定相关基因的表达情况。

1.4 指标测定和方法

1.4.1 生产性能、蛋品质和胫骨质量

生产性能:试验期间每天记录产蛋量、蛋重和采食量,据此计算产蛋率、平均蛋重、平均日采食量和料蛋比,计算公式如下:

产蛋率(%)=100×产蛋总数/(蛋鸡只数×试验天数);

平均蛋重(g)=总蛋重/产蛋总数;

平均日采食量(g)=总耗料量/(蛋鸡只数×试验天数);

料蛋比=总耗料量/总蛋重。

蛋品质:采用蛋品质分析仪(EMT-5200型,Robotmation公司,日本)测定蛋壳厚度和蛋壳强度;采用游标卡尺测量鸡蛋的长度和宽度,通过计算长度与宽度的比值得出蛋形指数。

胫骨质量:蛋鸡屠宰后分离两侧胫骨,刮去筋膜后称重。完整胫骨经乙醚浸泡12 h,去除脂肪后,转入105 ℃烘箱内烘至恒重,在马弗炉中550 ℃灰化后,参照GB/T 6436—2018^[10]测定胫骨钙含量,参照GB/T 6437—2018^[11]测定胫骨磷含量。

1.4.2 血清生化指标

血清钙(货号:ml801143)、磷(货号:ml076827)、1,25-(OH)₂D₃(货号:ml059823)、FGF23(货号:ml061098)、Klotho(货号:ml057910)、甲状旁腺激素(PTH)(货号:ml002803)含量及碱性磷酸酶(AKP)(货号:ml060791)活性均采用上海酶联生物科技有限公司生产的试剂盒测定,具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.4.3 肝脏维生素D α-羟化及十二指肠钙、磷吸收相关基因的表达

用总RNA提取试剂抽提十二指肠黏膜和肝脏中的总RNA,测定浓度和纯度合格后进行反转录,将得到的cDNA用40倍稀释液进行稀释,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)仪进行相对定量分析。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因,用20 μL反应体系,上、下游引物分别为0.4 μL,cDNA模板2 μL,无酶水7.2 μL,预混酶10 μL。具体反应条件为:95 ℃预变性30 s,95 ℃变性15 s,60 ℃退火30 s,循环40次。反应结束后,运用2^-△△Ct法将得到的内参基因与目的基因的Ct值计算相对表达量。基因引物序列见表2。上述所有试剂以及引物序列的设计合成均来自武汉塞维尔生物科技有限公司。目的基因包括十二指肠细胞核维生素D受体(nVDR)、细胞膜维生素D受体(mVDR)、钙结合蛋白-D28K(CABP-D28K)、质膜钙ATP酶1b(PMCA1b)、钠依赖Ⅱb型磷转运蛋白(Na/Pi-Ⅱb)及肝脏FGF23、Klotho和细胞色素P450家庭成员24A1(CYP24A1)。

表2 基因引物序列

Table 2 Primer sequences of genes

基因 Genes	引物序列 Primer sequences (5'—3')	扩增长度 Amplification length/bp	GenBank登录号 GenBank accession number
细胞核维生素D受体 nVDR	F:GGAGCAGCAGAAAGTCATCG R:GCATCGGAGCCAAAGACATC	192	NM_205098.2
细胞膜维生素D受体 mVDR	F:TCCCCACCATCTATTTCGCTC R:CCTCCTTTGCCTTCTTCTTGG	168	NM_204110.4
钙结合蛋白-D28K CABP-D28K	F:GTACGATCAAGATGGCAATGGA R:AGGCCATGATGCTTTTCTTGTA	131	NM_205513.2
质膜钙ATP酶1b PMCA1b	F:ACAGGATGACAGTGGTCCAAGC R:ACCTTCTTTCTCAGGAGGCAGTA	158	NM_001168002.4
钠依赖Ⅱb型磷转运蛋白 Na/Pi-Ⅱb	F:GCTCCAGCACTTCTTCATCCATC R:GGCCCTTCTAAATTCATTCCTGTC	164	NM_204474.3
成纤维细胞生长因子23 FGF23	F:CAGCCAAGAGGACTGTGTGT R:ACTGGGAGTATGGTGGTGGA	146	XM_425663.6
克洛索蛋白 Klotho	F:TCACACTGGATAAAACCTCAACA R:TACTTCTTGTCTTCTTCGCTGA	179	XM_003641245.6
细胞色素P450家庭成员24A1 CYP24A1	F:TTCGGTTGGTATGGAGGAGC R:CAGTGGGTGAAGTAAGGAGCAT	83	NM_001277354.1
β-肌动蛋白 β-actin	F:TGCGTGACATCAAGGAGAAG R:TGCCAGGGTACATTGTGGTA	300	NM_205518.2

1.5 数据统计与分析

试验数据经Excel 2019初步处理后,采用SPSS 27.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),并用Duncan氏法进行多重比较检验,表格中结果以平均值和均值标准误(SEM)表示;采用GraphPad Prism 9.0软件以“平均值±标准误”绘制柱形图。P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 饲粮钙磷比对蛋鸡生产性能、蛋品质和胫骨指标的影响

由表3可知,饲粮钙磷比极显著影响蛋鸡产蛋率(P<0.01),显著影响蛋壳厚度(P<0.05),其中低钙磷比组蛋鸡产蛋率和蛋壳厚度最低。低钙磷比组蛋鸡蛋壳厚度为0.36 mm,较正常钙磷比组和高钙磷比组分别降低了0.01和0.02 mm(P<0.05)。随着饲粮钙磷比的提高,蛋壳强度呈上升趋势,但差异不显著(P>0.05)。各组间蛋鸡平均日采食量、平均蛋重和料蛋比均无显著差异(P>0.05)。饲粮钙磷比对蛋鸡胫骨重和胫骨钙、磷含量均无显著影响(P>0.05),但是随着饲粮钙磷比的提高,胫骨钙、磷含量均呈上升趋势。

表3 饲粮钙磷比对蛋鸡生产性能、蛋品质和胫骨质量的影响

Table 3 Effects of dietary Ca/P ratio on performance, egg quality and tibia quality of laying hens

项目 Items	低钙磷比组 Low Ca/P ratio group	正常钙磷比组 Normal Ca/P ratio group	高钙磷比组 High Ca/P ratio group	SEM	P值 P-value
生产性能Performance
平均日采食量Average daily feed intake/g	107.86	111.72	112.91	5.468	0.636
料蛋比Feed/egg	1.95	1.94	1.94	0.151	0.304
平均蛋重Average egg weight/g	55.67	57.22	58.24	2.487	0.596
产蛋率Laying rate/%	84.27^Bb	95.69^Aa	94.53^Aa	2.100	<0.001
蛋品质Egg quality
蛋壳厚度Eggshell thickness/mm	0.36^b	0.37^a	0.38^a	0.014	0.041
蛋壳强度Eggshell strength/(kg/cm²)	3.84	4.02	4.88	0.443	0.073
蛋形指数Egg shape index	1.24	1.31	1.24	0.032	0.125
胫骨质量Tibia quality
钙含量Ca content/%	11.28	11.72	12.33	0.523	0.175
磷含量P content/%	6.71	7.09	7.33	0.418	0.362
胫骨重Tibial weight/g	11.31	11.30	11.13	0.776	0.965

	同行数据肩标无字母或相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。
	In the same row, values with no letter or the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.

2.2 饲粮钙磷比对蛋鸡血清生化指标的影响

由表4可知,饲粮钙磷比显著影响蛋鸡血清1,25-(OH)₂D₃和PTH含量(P<0.05),低钙磷比组蛋鸡血清1,25-(OH)₂D₃较正常钙磷比组和高钙磷比组分别提高了7.37%、6.88%(P<0.05),血清PTH含量较正常钙磷比组和高钙磷比组分别提高了11.43%、7.98%(P<0.05)。各组间蛋鸡血清钙、磷、FGF23、Klotho含量以及ALP活性均无显著差异(P>0.05),但血清磷含量和ALP活性均随着饲粮钙磷比的提高呈下降趋势,而FGF23和Klotho含量则随着饲粮钙磷比的提高呈上升趋势。

表4 饲粮钙磷比对蛋鸡血清生化指标的影响

Table 4 Effects of dietary Ca/P ratio on serum biochemical indexes of laying hens

项目 Items	低钙磷比组 Low Ca/P ratio group	正常钙磷比组 Normal Ca/P ratio group	高钙磷比组 High Ca/P ratio group	SEM	P值 P-value
钙含量Ca content/(mmol/L)	2.46	2.47	2.24	0.413	0.706
磷含量P content/(mmol/L)	1.52	1.51	1.49	0.177	0.985
碱性磷酸酶ALP/(U/L)	723.33	583.67	532.26	84.282	0.096
1,25-二羟基维生素D₃ 1,25-(OH)₂D₃/(ng/mL)	23.30^a	21.70^b	21.80^b	0.332	0.034
甲状旁腺激素PTH/(ng/L)	35.98^a	32.29^b	33.32^b	1.326	0.039
成纤维细胞生长因子23 FGF23/(pg/mL)	199.64	210.28	221.64	11.293	0.189
克洛索蛋白Klotho/(pg/mL)	515.08	536.74	551.65	38.271	0.136

2.3 饲粮钙磷比对蛋鸡肝脏维生素D α-羟化和十二指肠钙、磷吸收相关基因表达的影响

2.3.1 肝脏维生素D α-羟化相关基因

由图1可知,低钙磷比组蛋鸡肝脏FGF23和Klotho的mRNA相对表达量最低,极显著低于正常钙磷比组和高钙磷比组(P<0.01),正常钙磷比组和高钙磷比组间差异不显著(P>0.05)。低钙磷比组蛋鸡肝脏CYP24A1的mRNA相对表达量极显著高于正常钙磷比组和高钙磷比组(P<0.01),正常钙磷比组和高钙磷比组之间差异不显著(P>0.05)。

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图1 饲粮钙磷比对蛋鸡肝脏维生素D α-羟化相关基因表达的影响

数据柱形标注相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下图同。

Fig.1 Effects of dietary Ca/P ratio on expression of genes related to vitamin D α-hydroxylation in liver of laying hens

Value columns with the same small letter mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05), and with different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.

2.3.2 十二指肠磷吸收相关基因

由图2可见,饲粮钙磷比极显著影响蛋鸡十二指肠nVDR、mVDR和Na/Pi-Ⅱb的mRNA相对表达量(P<0.01),低钙磷比组十二指肠nVDR、mVDR和Na/Pi-Ⅱb的mRNA相对表达量极显著高于正常钙磷比组和高钙磷比组(P<0.01),但正常钙磷比组和高钙磷比组之间差异不显著(P>0.05)。十二指肠nVDR、mVDR和Na/Pi-Ⅱb的mRNA相对表达量均随饲粮钙磷比的增加呈下降趋势。

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图2 饲粮钙磷比对十二指肠磷吸收相关基因表达的影响

Fig.2 Effects of dietary Ca/P ratio on expression of genes related to phosphorus absorption in duodenum of laying hens

2.3.3 十二指肠钙吸收相关基因

由图3可知,饲粮钙磷比极显著影响蛋鸡十二指肠CABP-D28K和PMCA1b的mRNA相对表达量(P<0.01),低钙磷比组十二指肠CABP-D28K和PMCA1b的mRNA相对表达量(P<0.01)。但正常钙磷比组和高钙磷比组间差异不显著(P>0.05),其中以高钙磷比组表达水平最低。

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图3 饲粮钙磷比对蛋鸡十二指肠钙吸收相关基因表达的影响

Fig.3 Effects of dietary Ca/P ratio on expression of genes related to calcium absorption in duodenum of laying hens

3 讨论

钙和磷的缺乏、过量以及比例不平衡,均会对蛋鸡生产性能的发挥和蛋品质产生重要影响^[12-13]。李龙等^[14]研究表明,饲粮钙磷比为8.25∶1时,黄羽肉种鸡产蛋率较钙磷比为6.75∶1和7∶1时显著提高。章世元等^[15]研究显示,饲粮钙磷比为7∶1时,蛋鸡蛋壳质量最优。孙飞^[16]研究发现,饲粮中钙和有效磷水平分别为3.50%和0.35%,钙磷比为10∶1时,蛋鸡蛋品质显著优于饲粮钙磷比为8∶1和12∶1时。本研究结果显示,饲粮钙磷比极显著影响产蛋高峰期蛋鸡的产蛋率,显著影响蛋壳厚度,当饲粮钙磷比为6∶1时,蛋鸡产蛋率和蛋壳厚度达到最低,但其他蛋品质和胫骨质量指标无显著变化,这与前人研究结果部分相似。

对于蛋鸡胫骨质量的测定结果,本研究发现胫骨钙、磷含量随着饲粮钙磷比的提高而上升,这符合前人已证明的钙磷代谢特点,以及其在肠-肾-骨骼间维持血液钙、磷动态平衡的原理^[17]。当饲粮中的钙、磷在肠道中被吸收后,一部分会进入血液或沉积于骨骼,以维持血液和骨骼中钙、磷的平衡;另一部分则通过肾脏的重吸收,其中部分重新进入血液或骨骼,剩余部分则以尿液的形式排出体外。当饲粮中钙、磷不足或钙磷比例失衡时,骨骼中沉积的钙、磷会被释放出来,以在一定程度上缓解血液中钙、磷的失衡。因此,骨骼中钙、磷的沉积至关重要,短期内饲粮钙、磷的缺乏,可通过骨骼中钙、磷的释放来达到平衡,从而保障动物机体的正常功能和生产活动^[18-19]。本研究中,低钙磷比组蛋鸡血清钙、磷含量未降低,而胫骨中钙、磷含量下降,这可能与饲粮中钙、磷的缺乏,引起了胫骨中钙、磷释放有关,也可能与动物在某种营养素缺乏时引起的代偿性代谢有关^[20-21]。代偿性代谢原理为:当某种营养素缺乏时,动物机体会自行调动体内相关的调控因素,提高该营养素的利用率,以缓解机体内该营养物质短暂性的失衡^[22]。在这方面,前人已有一些研究。Sinclair-Black等^[23]综述到,当饲粮中钙、磷不足时,蛋鸡会通过增加骨骼中钙、磷的释放来维持体内矿物质平衡。同时,肾脏也会调节磷的排泄,以维持正常生理功能。Santos等^[24]研究发现,蛋鸡在钙摄入不足时,会通过刺激PTH并抑制降钙素(CT)分泌来调节血钙含量。Rousseau等^[25]研究发现,仔鸡在面对磷缺乏时能够发展出适应性机制,通过提高体内Na/Pi-Ⅱb和Na/Pi-Ⅱc等转运蛋白的表达来提高磷的利用率。同时,代偿性代谢原理同样体现在小肠中钙、磷吸收相关基因的表达上。本研究结果显示,低钙磷比组蛋鸡十二指肠nVDR、mVDR和肝脏CYP24A1的mRNA相对表达量极显著高于正常钙磷比组和高钙磷比组,十二指肠CABP-D28K、PMCA1b和Na/Pi-Ⅱb的mRNA相对表达量也以低钙磷比组最高。然而,尽管代偿性代谢可调控蛋鸡体内钙、磷相关血液指标和基因表达,但蛋壳强度和蛋壳厚度仍出现下降。这表明,代偿性机制仅为机体的短期反应调控,无法弥补长期营养素缺乏对生产性能的负面影响。

维生素D本身不具备生物活性,其必须经过肝脏和肾脏的2次α-羟化作用,转化为具有活性的1,25-(OH)₂D₃后,才能发挥调节钙磷代谢及维持血液中钙、磷平衡的作用^[26]。关于饲粮钙磷比对蛋品质影响的深入机制研究显示,当饲粮钙磷比低于正常营养需要时,蛋鸡肝脏FGF23和Klotho的mRNA相对表达量极显著降低,血清中FGF23、Klotho含量呈降低趋势,而1,25-(OH)₂D₃含量显著提高。这表明FGF23/Klotho轴和维生素D的α-羟化过程呈负相关,即当FGF23和Klotho含量降低时,维生素D经α-羟化过程转化为1,25-(OH)₂D₃的量增加。上述作用仅在饲粮钙磷比低于正常营养需要时发生,而在饲粮钙磷比高于正常营养需要时,FGF23/Klotho轴对维生素D转化为1,25-(OH)₂D₃的过程没有显著影响。该结果与已有研究所表明的FGF23/Klotho轴和维生素D代谢之间的关系一致。医学领域研究表明,注射FGF23会抑制小鼠体内1α-羟化酶基因的表达,降低1,25-(OH)₂D₃的生成与活化^[27]。本研究中,正常钙磷比组和高钙磷比组蛋鸡血清FGF23、Klotho含量均高于低钙磷比组,1,25-(OH)₂D₃含量均显著低于低钙磷比组,表明蛋鸡中FGF23/Klotho轴和维生素D代谢之间的关系与小鼠中的一致。这一结果也与Vervloet等^[28]和Wilkens等^[29]的研究结果相符。这两项研究均表明,低钙摄入会减少机体FGF23的分泌,提高血清中1,25-(OH)₂D₃的含量,其原理在于:机体通过调节肠道对钙的吸收,维持正常的血清钙含量,同时增加PTH的分泌,进而提高肾脏中α羟化酶的活性,促进1,25-(OH)₂D₃合成。本研究中血清1,25-(OH)₂D₃含量呈现的变化,也与上述原理一致。

1,25-(OH)₂D₃在促进肠道上皮细胞对钙的吸收过程中,需要与nVDR和mVDR这2种维生素D受体(VDR)结合。nVDR主要位于肠细胞核内,通过调节基因表达影响钙吸收;mVDR主要位于肠细胞膜,能够快速响应维生素D信号,调节细胞膜上钙通道的活动^[30-31]。汪晓娜^[32]研究表明,饲粮钙含量与肉鸡小肠nVDR和mVDR的mRNA相对表达量呈负相关,低钙饲粮会刺激VDR转录,VDR与维生素D结合后能够提高肠道对钙的吸收效率,而高钙饲粮则会抑制这种调节作用,这与本研究结果一致。可能是由于在钙、磷供应不足的情况下,动物机体提高了1,25-(OH)₂D₃含量和VDR的表达水平,两者结合后分别激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶C(PKC)信号传导途径,从而提高肠道对钙、磷的吸收效率,以维持血液中钙、磷的稳定。本研究结果显示,低钙磷比组蛋鸡血清钙、磷含量相较于正常钙磷比组并未降低,也验证了上述机制。

大量研究表明,在家禽小肠钙、磷吸收过程中,转运蛋白Na/Pi-Ⅱb通过其独特的结构和钠依赖性转运机制,能够有效地调节体内磷的平衡。Nie等^[33]研究表明,低钙磷比饲粮能够显著提高蛋鸡肠道Na/Pi-Ⅱb的mRNA相对表达量,从而增强对钙、磷的吸收。Zhang等^[34]研究发现,nVDR和mVDR的活性能直接影响肉鸡十二指肠Na/Pi-Ⅱb的mRNA相对表达量,低钙磷饲粮可通过上调nVDR和mVDR的表达,进一步增强Na/Pi-Ⅱb的表达。Vervloet等^[28]研究表眀,FGF23可抑制25-羟化酶及其受体基因CYP24A1的表达,减少1,25-(OH)₂D₃的生成和活化,最终抑制肠道Na/Pi-Ⅱb的表达,限制肠道磷吸收并促进磷排泄。本研究表明,低钙磷比饲粮极显著提高了蛋鸡肝脏CYP24A1和十二指肠Na/Pi-Ⅱb的mRNA相对表达量。同时,血清1,25-(OH)₂D₃含量的增加及十二指肠nVDR、mVDR的mRNA相对表达量提高进一步刺激了Na/Pi-Ⅱb的表达,从而促进肠道对钙、磷的吸收;而高钙磷比饲粮则会诱导FGF23表达,抑制CYP24A1表达,导致维生素D的羟化过程受阻,从而降低了1,25-(OH)₂D₃的生成,进而下调nVDR、mVDR和Na/Pi-Ⅱb的表达,这与前人研究结果类似。

CABP-D28K和PMCA1b与小肠细胞跨膜吸收钙密切相关。CABP-D28K主要存在于小肠细胞质中,负责将Ca²⁺从细胞顶模运输至基底膜^[35]。Zheng等^[36]研究发现,CABP-D28K的表达受VDR的调节,VDR能够诱导CABP-D28K的转录。饲粮钙磷比也会影响CABP-D28K的表达,低钙磷比饲粮会显著提高肉鸡十二指肠CABP-D28K的mRNA相对表达量^[32]。本试验结果与上述研究相似,与高钙磷比组相比,低钙磷比组蛋鸡十二指肠CABP-D28K的mRNA相对表达量极显著提高,这是由于钙摄入不足时,细胞会通过提高CABP-D28K的表达,增强其对Ca²⁺的结合能力,从而维持细胞内钙的稳态。同时。低钙磷比饲粮还会促进VDR的转录,进一步诱导CABP-D28K的合成;而高钙磷比饲粮则会限制VDR的转录和CABP-D28K合成,阻止过多的Ca²⁺从细胞顶模运输到基底膜^[37-38],这与本研究中高钙磷比饲粮对蛋鸡蛋品质、血清生化指标以及VDR基因表达未产生显著影响的结果一致。PMCA1b主要在肠细胞中表达,其作用是将细胞内的钙离子排出^[31]。Rousseau等^[25]研究表明,低钙磷比饲粮促进了肉鸡十二指肠PMCA1b的表达。Glendenning等^[39]在大鼠试验中发现,PTH通过刺激肾脏合成1,25-(OH)₂D₃,间接上调PMCA1b的表达,并增强其钙泵活性。这与本研究结果类似,低钙磷比饲粮提高了蛋鸡十二指肠PMCA1b基因的mRNA相对表达量。此外,当血钙含量下降时,PTH的分泌会增加,进一步促进PMCA1b的表达,从而增强肠细胞排出Ca²⁺的能力,维持血钙稳定;而高钙磷比饲粮则会抑制PMCA1b的表达,减少Ca²⁺从肠细胞向血液中输送^[32,39]。本研究结果显示,低钙磷比组蛋鸡血清PTH含量显著提高,与上述研究结果相符。

4 结论

低钙磷比饲粮会降低蛋鸡蛋壳强度和蛋壳厚度,对蛋品质产生不利影响,蛋鸡体内指标的响应为:通过代偿性代谢机制下调肝脏中FGF23、Klotho的表达,降低对CYP24A1的抑制作用,从而间接促进1,25-(OH)₂D₃的生成;同时,通过上调十二指肠钙、磷吸收相关基因nVDR、mVDR、CABP-D28K、PMCA1b、Na/Pi-Ⅱb的表达,促进钙、磷吸收。然而,当饲粮钙磷比高于正常营养需要时,上述指标未出现显著变化。

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