动物营养学报 >

2025 , Vol. 37 >Issue 8: 5524 - 5534

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.448

研究论文

不同仿生参数条件下外源蛋白酶对豆粕体外养分消化率的影响

  • 吴诗樵 ,
  • 张连华 , * ,
  • 陈亮
展开
  • 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,畜禽营养与饲养全国重点实验室,北京 100193
*张连华,助理研究员,E-mail:

吴诗樵(1992—),男,江苏泰州人,硕士研究生,畜牧专业。E-mail:

Copy editor: 武海龙

收稿日期: 2024-12-23

  网络出版日期: 2025-08-14

基金资助

国家重点研发计划项目(2022YFD1300505)

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2024-YWF-ZYSQ-09)

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2024-YWF-ZX-05)

收起

Effects of Exogenous Protease on in Vitro Nutrient Digestibility of Soybean Meal under Different Bionic Parameter Conditions

  • WU Shiqiao ,
  • ZHANG Lianhua , * ,
  • CHEN Liang
Expand
  • National Key Laboratory of Animal Nutrition and Feeding, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
*assistant professor, E-mail:

Received date: 2024-12-23

  Online published: 2025-08-14

Fold

摘要

本试验旨在研究不同仿生参数条件下外源蛋白酶对豆粕体外养分消化率的影响。通过单胃动物仿生消化系统,采用正交试验设计,探究添加或不添加外源蛋白酶对不同添加量(1和2 g)的豆粕在胃和小肠模拟消化阶段养分消化率的影响,并研究不同模拟胃液消化时间、pH、体积、内源蛋白酶活性条件下外源蛋白酶的作用效果。结果表明:1)在胃和小肠模拟消化阶段,添加外源蛋白酶的豆粕干物质消化率(DMD)、总能消化率(GED)和酶水解物能值(EHGE)极显著高于未添加外源蛋白酶(P<0.01),且上样量1 g的豆粕GED和EHGE极显著高于上样量2 g(P<0.01)。2)豆粕DMD、GED和EHGE随胃液消化时间延长而极显著增加(P<0.01)。3)豆粕DMD、GED和EHGE随胃液pH升高而极显著降低(P<0.01)。4)豆粕DMD、GED和EHGE随胃液体积减少而极显著增加(P<0.01)。5)豆粕DMD、GED和EHGE随胃液内源蛋白酶活性增加而极显著增加(P<0.01)。6)不同模拟胃液消化时间、pH、内源蛋白酶活性条件下,添加外源蛋白酶的豆粕DMD、GED和EHGE极显著高于未添加外源蛋白酶(P<0.01)。由此可见,添加外源蛋白酶能提高豆粕体外养分消化率。

关键词： 外源蛋白酶; 豆粕; 仿生法; 养分消化率

本文引用格式

吴诗樵 , 张连华 , 陈亮 . 不同仿生参数条件下外源蛋白酶对豆粕体外养分消化率的影响[J]. 动物营养学报, 2025 , 37(8) : 5524 -5534 . DOI: 10.12418/CJAN2025.448

Abstract

This experiment was conducted to study the effects of exogenous protease on in vitro nutrient digestibility of soybean meal under different bionic parameter conditions. Through the bionic digestive system of monogastric animals, the orthogonal experimental design was adopted, the effects of add exogenous protease or not add exogenous protease on nutrient digestibility of soybean meal at different addition amount (1 and 2 g) in stomach and intestinal digestion simulated digestion stages were explored, and the effects of exogenous protease under different conditions of simulated gastric fluid digestion time, pH, volume and endogenous protease activity were studied. The results showed as follows: 1) in stomach and intestinal digestion simulated digestion stages, the dry matter digestibility (DMD), gross energy digestibility (GED) and enzymatic hydrolyzate gross energy (EHGE) of soybean meal add exogenous protease were significantly higher than those of not add exogenous protease (P<0.01), and the GED and EHGE of soybean meal of 1 g sample amount than were significantly higher than those of 2 g sample amount (P<0.01). 2) The DMD, GED and EHGE of soybean meal were significantly increased with gastric fluid digestion time increased (P<0.01). 3) The DMD, GED and EHGE of soybean meal were significantly decreased with gastric fluid pH increased (P<0.01). 4) The DMD, GED and EHGE of soybean meal were significantly increased with gastric fluid volume decreased (P<0.01). 5) The DMD, GED and EHGE of soybean meal were significantly increased with gastric fluid endogenous protease activity increased (P<0.01). 6) Under the conditions of simulated gastric fluid digestion time, pH and endogenous protease activity, the DMD, GED and EHGE of soybean meal add exogenous protease were significantly higher than those of not add exogenous protease (P<0.01). In conclusion, add exogenous protease can improve the in vitro nutrient digestibility of soybean meal.

Key words： exogenous protease; soybean meal; bionic method; nutrient digestibility

近年来,全球地缘政治冲突频发与供应链结构性矛盾加剧,引发饲料原料价格持续攀升,对畜禽养殖业成本控制形成严峻压力。在此背景下,饲料企业及养殖主体亟需通过技术创新实现降本增效,其中提升现有饲料资源(尤其是高成本蛋白质原料)的利用效率成为核心突破方向。我国畜禽饲粮以玉米-豆粕型及其复合杂粕型为主,但抗营养因子显著制约营养物质的消化利用率,限制蛋白质资源的高效开发。外源蛋白酶作为饲用酶制剂的关键组分,通过激活内源蛋白酶活性,降解抗营养因子(如胰蛋白酶抑制因子)含量及减少氮磷排放[1-3],已成为优化饲料效价的研究热点。然而,饲用酶潜在价值的商业化应用需以多维验证为基础:既需体外仿生模型量化酶解效率,亦需体内试验确证其对动物生长性能及环境效益的协同增益[4]。随着全球酶制剂市场扩张,建立快速、精准的饲用酶有效性评价体系迫在眉睫。
饲料生物学效价评定主要利用化学分析法、体内法和体外法。其中,体外法通过对动物消化道pH、消化酶种类及活性、养分吸收等参数的模拟,在体外建立一套与畜禽消化道内环境相近的操作程序,能够快速评定饲料的生物学效价。我国动物营养学国家重点实验室构建的单胃动物仿生消化系统,兼具高效性与可控优势,已实现食糜在家禽肠道中的全程仿生消化环境[5]。目前,现有研究多聚焦复合酶谱筛选,针对单一外源蛋白酶的体外评价体系仍待完善。基于此,本研究利用单胃动物仿生消化系统,探究不同仿生参数(胃液消化时间、pH、体积、内源蛋白酶活性)对外源蛋白酶调控豆粕干物质消化率(dry matter digestibility,DMD)、总能消化率(gross energy digestibility,GED)和酶水解物能值(enzymatic hydrolyzate gross energy,EHGE)的影响,以期为外源蛋白酶的快速评价、蛋白质饲料资源高效利用及酶制剂工艺优化提供方法论支撑与数据参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

外源蛋白酶(DP100)为白色颗粒状,于-20 ℃保存备用。蛋白酶活性参照GB/T 28715—2012,采用分光光度法测定,其实测活性为11 924.90 U/g。
饲料原料样品为豆粕,四分法取样并粉碎过60目筛,在豆粕中添加2 500 mg/kg的外源蛋白酶,充分混合后-20 ℃保存备用。

1.2 试验设计

本试验在不同模拟胃液消化时间、pH、体积、内源蛋白酶活性条件下,研究外源蛋白酶对豆粕体外养分消化率的影响。在仿生消化系统中,以鸡模拟消化流程测定DMD、GED和EHGE。试验共设5个部分,具体试验设计如下。
试验1:研究外源蛋白酶对不同添加量的豆粕在胃和小肠模拟消化阶段养分消化率的影响。采用2×2因子设计,在1和2 g豆粕原料中添加或不添加外源蛋白酶,分别模拟胃和小肠消化阶段,共4个组,每组5个重复,每个重复1根消化管。
试验2:研究不同模拟胃液消化时间条件下外源蛋白酶的作用效果。采用2×5因子设计,在1 g豆粕原料中不添加或添加外源蛋白酶,模拟胃液消化时间分别为0、30、60、120、240 min,共10个组,每组5个重复,每个重复1根消化管。
试验3:研究不同模拟胃液pH条件下外源蛋白酶的作用效果。采用2×3因子设计,在1 g豆粕原料中不添加或添加外源蛋白酶,模拟胃液pH分别为2.0、3.0、4.0,共6个组,每组5个重复,每个重复1根消化管。
试验4:研究不同模拟胃液体积条件下外源蛋白酶的作用效果。采用2×3因子设计,在1 g豆粕原料中不添加或添加外源蛋白酶,模拟胃液体积分别为20、15、10 mL,共6个组,每组5个重复,每个重复1根消化管。
试验5:研究不同模拟胃液内源蛋白酶活性条件下外源蛋白酶的作用效果。采用2×3因子设计,在1 g豆粕原料中不添加或添加外源蛋白酶,模拟胃液内源蛋白酶活性分别为1 550、2 067、3 100 U/mL,共6个组,每组5个重复,每个重复1根消化管。

1.3 试验方法

1.3.1 缓冲液的配制

仿生消化操作过程中透析袋的型号和前处理、模拟及胃肠液及缓冲液的配置和仪器运行参数等试验操作参照赵峰等[6]。
模拟胃液:称取387.5 kU的胃蛋白酶,溶解于250 mL、pH 2.0的盐酸缓冲溶液中(41 ℃下标定pH),缓慢搅拌至溶解,现配现用。
模拟小肠液:称取11.40 kU的淀粉酶、13.55 kU胰蛋白酶和3.11 kU糜蛋白酶,溶解于25 mL去离子水中,缓慢搅拌直至溶解,现配现用。
模拟胃缓冲液:称取2.17 g的氯化钠和1.57 g的氯化钾,溶解于2 000 mL的去离子水中,并在41 ℃下利用2 mol/L的盐酸溶液调节pH至2.0。
模拟小肠缓冲液:称取9.35 g的无水磷酸氢二钠、40.09 g的无水磷酸二氢钠、11.13 g的氯化钠和3.09 g的氯化钾,青霉素160万U,溶解于2 000 mL的去离子水中,并在41 ℃下利用1 mol/L的磷酸溶液或者1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至6.5。

1.3.2 单胃动物仿生消化系统模拟鸡消化过程主要步骤

单胃动物仿生消化系统模拟鸡消化操作按照以下程序进行:在消化管透析袋中加入样品以及20 mL的模拟胃液,并将消化管固定至消化平台上,连接好管道。在主界面上选择鸡的仿生消化程序后,开始胃阶段的消化。4.0 h后,胃阶段的消化停止,开始清洗。6.5 h后,将2.2 mL(实际进入模拟消化器内的模拟肠液为2 mL)的模拟小肠液准确移入小肠消化液储备室中,开始小肠阶段的消化。21.5 h后,小肠后段模拟消化结束,开始清洗。25.5 h后,清洗结束。消化结束后,将透析袋内的未消化残渣转移至干燥培养皿(己测绝干重)中,65 ℃烘干后再调节温度105 ℃烘至恒重。将烘干的消化残渣转移至破璃砂坩埚(已测绝干重)中,利用无水乙醇脱脂至滤出无色溶液为止。之后将上述培养皿和玻璃砂坩埚置于105 ℃烘箱内烘至恒重。将玻璃砂坩埚内的残渣样品转移至称样纸上,测定残渣能量,同时将带有部分剩余残渣的玻璃砂坩埚置于105 ℃烘箱内烘至恒重。

1.4 检测指标与方法

干物质含量参照GB/T 6435—2014的方法,采用烘干法测定;粗蛋白质含量参照GB/T 6432—2018的方法,采用凯氏定氮法测定;总能采用PARR6200氧弹量热仪测定;氨基酸含量参照GB/T 14924.10—2008的方法测定。豆粕原料营养成分分析见表1。
表1 豆粕原料营养成分分析(饲喂基础)

Table 1 Analysis of nutritional components of soybean meal (as-fed basis) %

项目Items 含量Content
干物质DM 92.41
粗蛋白质CP 45.55
总能GE/(MJ/kg) 18.15
精氨酸Arg 3.97
组氨酸His 1.54
异亮氨酸Ile 2.19
亮氨酸Leu 4.05
赖氨酸Lys 2.76
蛋氨酸Met 0.23
苯丙氨酸Phe 2.78
苏氨酸Thr 2.11
缬氨酸Val 2.20
丙氨酸Ala 2.35
天冬氨酸Asp 4.17
半胱氨酸Cys 1.54
谷氨酸Glu 2.32
甘氨酸Gly 2.19
脯氨酸Pro 2.65
丝氨酸Ser 2.79
酪氨酸Tyr 1.70

1.5 计算公式

豆粕DMD、GED和EHGE计算公式如下:

DMD(%)=(M1-M2)/M1×100;

GED(%)=(GE1-GE2)/GE1×100;

EHGE(MJ/kg)=(GE1-GE2)/(M1×1 000)。

式中:M1为上样量(g);M2为未消化残渣重(g);GE1为样品总能(MJ);GE2为未消化残渣总能(J)。

1.6 统计与分析

试验数据经Excel 2021整理后,用SAS 9.3软件进行方差分析,试验结果以“平均值±标准差”表示,以P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 外源蛋白酶对不同上样量的豆粕在胃和小肠模拟消化阶段养分消化的影响

2.1.1 模拟胃消化阶段

由表2可知,2组的豆粕DMD、GED和EHGE显著高于其他各组(P<0.05),且1、2组显著高于3、4组(P<0.05)。上样量1 g的豆粕DMD、GED和EHGE极显著高于上样量2 g(P<0.01),添加外源蛋白酶的豆粕DMD、GED和EHGE极显著高于未添加外源蛋白酶(P<0.01),上样量和外源蛋白酶之间互作效应极显著影响豆粕DMD、GED和EHGE(P<0.01)。
表2 模拟胃消化阶段外源蛋白酶对豆粕DMD、GED和EHGE的影响

Table 2 Effects of exogenous protease on DMD, GED and EHGE of soybean meal in simulated stomach digestion stage

项目
Items		 干物质消化率
DMD/%		 总能消化率
GED/%		 酶水解物能值
EHGE/(MJ/kg)
组别
Groups		 上样量
Sample amount/g		 外源蛋白酶
Exogenous protease
1
1		 - 42.46±0.19b 42.08±0.20b 8.27±0.04b
2 + 45.62±0.35a 45.32±0.40a 8.95±0.08a
3
2		 - 31.52±0.57c 28.31±0.70c 5.69±0.14c
4 + 31.34±0.45c 28.35±0.88c 5.70±0.18c
主效应Main effects

上样量
Sample amount/g		 1 44.04±1.68A 43.70±1.73A 8.61±0.37A
2 31.43±0.49B 28.33±0.75B 5.70±0.15B

外源蛋白酶
Exogenous protease		 - 36.99±5.78B 35.19±7.27B 6.98±1.36B
+ 38.48±7.54A 36.84±8.97A 7.33±1.72A

P值
P-value		 上样量Sample amount <0.001 <0.001 <0.001
外源蛋白酶Exogenous protease 0.005 0.006 0.004
上样量×外源蛋白酶
Sample amount×exogenous protease		 <0.001 <0.001 <0.001

同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01),相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。“-”表示未添加外源蛋白酶,“+”表示添加外源蛋白酶。下表同。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). “-” indicated not added exogenous protease, “+” indicated added exogenous protease. The same as below.

2.1.2 模拟小肠消化阶段

由表3可知,2组的豆粕DMD、GED和EHGE显著高于其他各组(P<0.05),4组的豆粕GED和EHGE显著高于1、3组(P<0.05)。上样量1 g的豆粕GED和EHGE极显著高于上样量2 g(P<0.01),添加外源蛋白酶的豆粕DMD、GED和EHGE极显著高于未添加外源蛋白酶(P<0.01),上样量和外源蛋白酶之间互作效应极显著影响豆粕DMD、GED和EHGE(P<0.01)。
表3 模拟小肠消化阶段外源蛋白酶对豆粕DMD、GED和EHGE的影响

Table 3 Effects of exogenous protease on DMD, GED and EHGE of soybean meal in simulated intestinal digestion stage

项目
Items		 干物质消化率
DMD/%		 总能消化率
GED/%		 酶水解物能值
EHGE/(MJ/kg)
组别
Groups		 上样量
Sample amount/g		 外源蛋白酶
Exogenous protease
1
1		 - 47.34±0.36c 50.68±0.37c 9.95±0.07c
2 + 51.78±0.17a 55.91±0.56a 11.05±0.11a
3
2		 - 48.81±1.01b 48.77±0.64d 9.80±0.13c
4 + 49.68±0.83b 51.80±0.75b 10.41±0.15b
主效应Main effects

上样量
Sample amount/g		 1 49.56±2.35 53.30±2.80A 10.50±0.58A
2 49.24±0.99 50.29±1.73B 10.11±0.35B

外源蛋白酶
Exogenous protease		 - 48.08±1.05B 49.73±1.11B 9.88±0.13B
+ 50.73±1.24A 53.86±2.25A 10.73±0.36A

P值
P-value		 上样量Sample amount 0.325 0.004 0.005
外源蛋白酶Exogenous protease <0.001 <0.001 0.002
上样量×外源蛋白酶
Sample amount×exogenous protease		 0.004 0.004 0.006

2.2 不同模拟胃液消化时间条件下外源蛋白酶的作用效果

由表4可知,豆粕DMD、GED和EHGE随胃液消化时间延长而极显著增加(P<0.01),添加外源蛋白酶的豆粕DMD、GED和EHGE极显著高于未添加外源蛋白酶(P<0.01),胃液消化时间和外源蛋白酶之间互作效应极显著影响豆粕DMD、GED和EHGE(P<0.01)。
表4 不同模拟胃液消化时间条件下外源蛋白酶对豆粕DMD、GED和EHGE的影响

Table 4 Effects of exogenous protease on DMD, GED and EHGE of soybean meal under condition of different simulated gastric juice digestion time

项目
Items		 干物质消化率
DMD/%		 总能消化率
GED/%		 酶水解物能值
EHGE/(MJ/kg)
组别
Groups		 消化时间
Digestion time/min		 外源蛋白酶
Exogenous protease
1
0		 - 20.31±0.36i 15.17±0.22h 2.91±0.13g
2 + 21.62±0.63h 18.33±0.92g 3.63±0.18f
3
30		 - 33.21±0.69f 32.04±0.83f 6.26±0.16e
4 + 32.33±0.92g 31.37±0.90gf 6.22±0.20e
5
60		 - 33.77±0.53f 32.27±0.79f 6.59±0.38de
6 + 34.88±0.95e 34.17±1.25e 6.77±0.25d
7
120		 - 38.02±0.35d 37.20±0.25d 7.50±0.31c
8 + 43.92±0.19b 43.79±0.39b 8.86±0.91a
9
240		 - 42.34±0.19c 41.67±0.22c 8.14±0.04b
10 + 45.57±0.35a 45.43±0.40a 9.00±0.08a
主效应Main effects

消化时间
Digestion time/min		 0 21.03±0.85E 16.92±1.79E 3.27±0.41E
30 32.77±0.90D 31.70±0.93D 6.24±0.17D
60 34.46±0.96C 33.49±1.39C 6.68±0.32C
120 40.97±3.24B 40.50±3.63B 8.18±0.96B
240 43.95±1.72A 43.55±2.00A 8.57±0.46A

外源蛋白酶
Exogenous protease		 - 33.71±7.78B 31.89±9.42B 6.28±1.86B
+ 34.94±8.89A 33.82±10.04A 6.90±2.05A

P值
P-value		 消化时间Digestion time <0.001 <0.001 <0.001
外源蛋白酶Exogenous protease 0.007 0.005 0.006
消化时间×外源蛋白酶
Digestion time×exogenous protease		 0.005 0.004 0.007

2.3 不同模拟胃液pH条件下外源蛋白酶的作用效果

由表5可知,豆粕DMD、GED和EHGE随胃液pH升高而极显著降低(P<0.01),添加外源蛋白酶的豆粕DMD、GED和EHGE极显著高于未添加外源蛋白酶(P<0.01),胃液pH和外源蛋白酶之间互作效应显著影响豆粕GED和EHGE(P<0.05)。
表5 不同模拟胃液pH条件下外源蛋白酶对豆粕DMD、GED和EHGE的影响

Table 5 Effects of exogenous protease on DMD, GED and EHGE of soybean meal under condition of different simulated gastric juice pH

项目
Items		 干物质消化率
DMD/%		 总能消化率
GED/%		 酶水解物能值
EHGE/(MJ/kg)
组别
Groups		 pH 外源蛋白酶
Exogenous protease
1
2.0		 - 42.34±0.19d 41.67±0.21c 8.14±0.04d
2 + 45.57±0.35a 45.43±0.40a 9.00±0.08a
3
3.0		 - 41.89±0.72d 41.42±0.77cd 8.10±0.15d
4 + 44.11±0.38b 43.95±0.42b 8.71±0.08b
5
4.0		 - 40.90±0.33e 40.89±0.45d 7.99±0.09d
6 + 43.23±0.83c 43.46±0.80b 8.52±0.25c
主效应Main effects

pH		 2.0 43.95±1.72A 43.55±2.00A 8.57±0.46A
3.0 43.00±1.29B 42.69±1.46B 8.40±0.34B
4.0 41.94±1.35C 42.03±1.48C 8.26±0.33C

外源蛋白酶
Exogenous protease		 - 41.71±0.76B 41.33±0.59B 8.08±0.12B
+ 44.38±1.10A 44.34±1.00A 8.74±0.25A

P值
P-value		 pH 0.002 0.008 0.007
外源蛋白酶Exogenous protease <0.001 <0.001 <0.001
pH×外源蛋白酶
pH×exogenous protease		 0.072 0.031 0.038

2.4 不同模拟胃液体积条件下外源蛋白酶的作用效果

由表6可知,豆粕DMD、GED和EHGE随胃液体积减少而极显著增加(P<0.01),添加外源蛋白酶豆粕DMD、GED和EHGE极显著低于未添加外源蛋白酶(P<0.01),胃液体积和外源蛋白酶之间互作效应对豆粕DMD、GED和EHGE影响不显著(P>0.05)。
表6 不同模拟胃液体积条件下外源蛋白酶对豆粕DMD、GED和EHGE的影响

Table 6 Effects of exogenous protease on DMD, GED and EHGE of soybean meal under condition of different simulated gastric juice volume

项目
Items		 干物质消化率
DMD/%		 总能消化率
GED/%		 酶水解物能值
EHGE/(MJ/kg)
组别
Groups		 体积
Volume/mL		 外源蛋白酶
Exogenous protease
1
20		 - 45.27±0.66d 44.60±0.69c 8.72±0.13c
2 + 44.29±0.81e 43.48±0.86d 8.50±0.17d
3
15		 - 47.22±0.72bc 46.53±0.80b 9.10±0.16b
4 + 46.62±0.73c 45.93±0.90b 8.98±0.18b
5
10		 - 48.38±0.98a 47.69±0.96ab 9.32±0.19ab
6 + 47.70±0.27ab 46.78±0.36a 9.14±0.07a
主效应Main effects

体积
Volume/mL		 20 44.72±0.87C 43.98±0.95C 8.59±0.19C
15 46.92±0.76B 46.23±0.86B 9.04±0.17B
10 48.04±0.77A 47.24±0.83A 9.23±0.16A

外源蛋白酶
Exogenous protease		 - 47.08±1.49A 46.39±1.49A 9.07±0.29A
+ 46.20±1.59B 45.40±1.61B 8.87±0.31B

P值
P-value		 体积Volume 0.003 0.003 0.006
外源蛋白酶Exogenous protease 0.002 0.007 0.007
体积×外源蛋白酶
Volume×exogenous protease		 0.842 0.773 0.773

2.5 不同模拟胃液内源蛋白酶活性条件下外源蛋白酶的作用效果

由表7可知,豆粕DMD、GED和EHGE随胃液内源蛋白酶活性增加而极显著增加(P<0.01),添加外源蛋白酶豆粕DMD、GED和EHGE极显著高于未添加外源蛋白酶(P<0.01),胃液内源蛋白酶活性和外源蛋白酶之间的互作效应极显著影响豆粕DMD、GED和EHGE(P<0.01)。
表7 不同模拟胃液内源蛋白酶活性条件下外源蛋白酶对豆粕DMD、GED和EHGE的影响

Table 7 Effects of exogenous protease on DMD, GED and EHGE of soybean meal under condition of different simulated gastric juice endogenous protease activity

项目
Items		 干物质消化率
DMD/%		 总能消化率
GED/%		 酶水解物能值
EHGE/(MJ/kg)
组别
Groups		 内源蛋白酶活性
Endogenous protease
activity/(U/mL)		 外源蛋白酶
Exogenous protease
1
1 550		 - 42.34±0.19e 41.67±0.21d 8.14±0.04e
2 + 44.97±0.35c 44.06±0.41c 8.82±0.08c
3
2 067		 - 44.06±0.61d 44.06±0.99c 8.61±0.19d
4 + 45.01±0.30c 46.73±0.38b 9.23±0.07b
5
3 100		 - 47.90±0.67a 47.99±0.84a 9.38±0.16ab
6 + 46.77±0.56b 47.61±0.58a 9.40±0.11a
主效应Main effects

内源蛋白酶活性
Endogenous protease
activity/(U/mL)		 1 550 43.65±1.41C 43.16±1.61C 8.48±0.36C
2 067 44.53±0.68B 45.39±1.57B 8.92±0.35B
3 100 47.34±0.83A 47.80±0.71A 9.39±0.13A

外源蛋白酶
Exogenous protease		 - 44.76±2.46B 44.57±2.79B 8.71±0.55B
+ 45.58±0.95A 46.33±1.35A 9.15±0.27A

P值
P-value		 内源蛋白酶活性Endogenous protease activity <0.001 <0.001 <0.001
外源蛋白酶Exogenous protease <0.001 <0.010 0.002
内源蛋白酶活性×外源蛋白酶
Endogenous protease activity×exogenous protease		 0.005 0.005 0.007

3 讨论

在仿生消化系统中,恒温控制、缓冲液流速等参数固定且可重复[6-8],外源蛋白酶作用效果受消化液体积、pH、酶活性、底物浓度等因素影响较大[9-11]。

3.1 外源蛋白酶对不同上样量的豆粕在胃和小肠模拟消化阶段养分消化的影响

在肉仔鸡饲粮中添加外源蛋白酶,能够降低饲粮中不可消化氨基酸的比例,从而有效提升肉仔鸡对蛋白质和氨基酸的消化率[12]。在试验1中,在胃模拟消化阶段,添加外源蛋白酶提高了豆粕DMD、GED和EHGE,这一结果与王永花[13]的试验结论一致。在小肠模拟消化阶段,添加外源蛋白酶同样能提高豆粕DMD、GED和EHGE。这可能是因为外源蛋白酶能够减少抗营养因子含量,增强消化酶活性,进而促进营养物质的吸收。
在小肠模拟消化阶段,上样量1 g的豆粕GED和EHGE显著高于上样量2 g。同时,小肠模拟消化阶段外源蛋白酶的作用效果低于胃模拟消化阶段。一方面,蛋白酶作为具有生物活性的蛋白质,其三维结构的活性中心易受破坏而失活。胃内pH在2.5~3.0,对酶的破坏极大,且大部分饲用酶为中性,需经过胃部才能到达小肠发挥作用。苗华彪等[14]对8种饲用蛋白酶的过胃能力进行评估,用人工胃液处理2 h后,半数酶活性在12%以下,4 h后仅有2种酶活性仍在50%以上。结果表明,大部分中性、碱性蛋白酶在通过胃液时,其活性会发生不可逆失活,且失活程度与耐受时间相关。白燕[15]采用pH为3.0的缓冲液处理中性蛋白酶、碱性蛋白酶和角蛋白酶61 min,发现中性蛋白酶的剩余酶活性(复性)为0,碱性蛋白酶为0.48%,角蛋白酶最高也仅为37.68%。另一方面,经过胃消化后,上样量为2 g的豆粕在小肠消化阶段所含底物量充足,能够相对增加酶促反应,从而提高消化率。
此外,单独测定小肠模拟消化阶段效果时,发现其消化率提升更高,且更接近胃肠道全段消化率,这可能是由于外源蛋白酶对胰蛋白酶活性的增强效果优于胃蛋白酶。耿丹等[16]研究结果显示,在肉鸡饲粮中添加复合酶制剂能够提高42日龄肉鸡小肠的淀粉酶和蛋白酶活性。艾晓杰等[17]在雏鹅饲粮中添加0.1%的粗酶制剂后,十二指肠、空肠、回肠食糜淀粉酶活性均显著高于对照组。奚刚等[18]研究结果表明,在丝毛乌骨鸡饲粮中添加中性外源蛋白酶后,37和67日龄时,加酶组鸡胃蛋白酶活性比对照组分别提高了5.39%和5.27%,差异不显著;但小肠上段的胰蛋白酶活性比对照组分别提高了13.41%和9.27%,差异显著。这些研究结果说明,外源蛋白酶主要在鸡小肠消化阶段发挥主导作用。不过,在实际生产中,酶制剂如何顺利通过胃酸环境进入小肠发挥作用,仍有待进一步研究。此外,本试验关于外源蛋白酶在1和2 g豆粕上样量时的添加效果,再次证明了外源蛋白酶在1 g豆粕上样量时的促消化能力更强,效果更佳。

3.2 不同模拟胃液消化时间条件下外源蛋白酶的作用效果

试验2结果表明,豆粕DMD、GED和EHGE随胃液消化时间延长而极显著增长。在初始阶段(30~60 min),DMD仅提升2.55%,可能与酶-底物结合尚未达到稳态有关;随着消化时间延长至60~120 min,DMD增速显著提升9.04%,此时外源蛋白酶与豆粕中抗营养因子充分接触,释放更多酶切位点;而当消化时间超过120 min后,DMD增速趋缓,最终在240 min达到平台期。这种动力学特征符合米氏方程的预测,即反应初期底物充足,速率由酶活性主导;后期则受产物反馈抑制(如多肽链空间位阻效应)限制[16]。左建军[19]的研究也证实,豆粕磷体外消化率在240 min时达到最大值,与本研究结果一致。

3.3 不同模拟胃液pH条件下外源蛋白酶的作用效果

畜禽消化道pH是影响蛋白酶活性的主要因素之一,消化道pH能够影响酶构象,改变酶活性;同时影响底物解离,降低酶的催化效率[20]。在以往的研究中,均以达到最大消化率或透析率时所选初始pH作为体外模拟胃液的酸度参考标准[21]。而试验3根据前期的试验研究,以胃蛋白酶为主配制鸡模拟胃液,并调节不同的pH进行消化,结果表明,当模拟胃液pH从2.0升至4.0时,豆粕DMD、GED和EHGE显著下降;添加外源蛋白酶的豆粕DMD、GED和EHGE显著高于未添加外源蛋白酶,这与计成等[22]研究结果一致,说明本试验所用外源蛋白酶具有宽泛的pH适应性,且pH为2.0时,豆粕DMD、GED和EHGE达最大值。席鹏彬等[23]在测定菜籽粕的粗蛋白质消化率时,同样采用了pH 2.0的胃缓冲液进行试验。这一特性对实际生产尤为重要,因肉鸡胃液pH随日龄波动(2.5~3.5),宽pH适应性可保障酶效稳定性。

3.4 不同模拟胃液体积条件下外源蛋白酶的作用效果

试验4结果表明,胃液体积从20 mL缩减至10 mL时,豆粕DMD、GED和EHGE极显著增加,添加外源蛋白酶的豆粕DMD、GED和EHGE极显著低于未添加外源蛋白酶。原因可能是体积缩减通过提高酶-底物碰撞频率加速反应。此外,本试验保持内源蛋白酶即胃蛋白酶的活性不变,外源蛋白酶活性随胃液体积减少而升高,外源蛋白酶作用于豆粕上的效率增加,同样使得消化率提高。但添加外源蛋白酶豆粕DMD、GED和EHGE极显著低于未添加外源蛋白酶,可能是外源蛋白酶与内源蛋白酶在有限体系中产生底物竞争,导致协同效应降低。张铁鹰[24]建立的体外模型进一步证实,当液固比<1∶10时,酶自聚集现象加剧,有效活性下降22%。

3.5 不同模拟胃液内源蛋白酶活性条件下外源蛋白酶的作用效果

酶促反应中,酶与底物浓度均能影响反应速率。一方面改变了酶与底物的接触面积,另一方面改变酶活性也影响了底物的解离效率。试验5结果表明,豆粕DMD、GED和EHGE随内源蛋白酶活性增加而极显著增加。这可能是高活性内源蛋白酶通过预消化产生更多外源酶作用位点。但过量外源酶可引发竞争性抑制,其与内源蛋白酶的底物结合能导致催化效率下降。马俊孝等[25]利用酸和蛋白酶处理木聚糖酶后发现,木聚糖酶参与活性最高为39.2%,最低为6.9%。而李卫芬等[26]证实,胃蛋白酶预处理会破坏外源酶结构(木聚糖酶活性降低至24.49%)。王雄等[12]通过单胃动物仿生消化系统来模拟饲粮在肉鸡的胃肠道中的消化过程,以此体外模型评价蛋白酶的降解效率,发现随着蛋白酶添加量的增加,肉鸡基础饲粮体外DMD、GED等呈现先升高后降低的趋势,可能是因为蛋白酶添加适量能提高内源蛋白酶活性,添加比例过高则会抑制内源蛋白酶活性。

4 结论

不同模拟胃液消化时间、pH、内源蛋白酶活性条件下,外源蛋白酶均能提高豆粕DMD、GED和EHGE。胃仿生参数对外源蛋白酶活性具有调控作用:最适条件为胃液pH 2.0,消化时间240 min,体积10 mL,内源蛋白酶活性3 100 U/mL。

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序
[1]
张顺芬, 钟儒清, 张碧峰, 等. 不同外源酶组合对棕榈粕原料体外养分消化率和酶水解物能值的影响[J]. 动物营养学报, 2020, 32(12):5916-5924.

DOI

ZHANG S F, ZHONG R Q, ZHANG B F, et al. Effects of different combinations of exogenous enzymes on in vitro nutrient digestibility and enzymatic hydrolyzate gross energy of palm kernel meal ingredients[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2020, 32(12):5916-5924. (in Chinese)

[2]
ANGEL C R, SAYLOR W, VIEIRA S L, et al. Effects of a monocomponent protease on performance and protein utilization in 7- to 22-day-old broiler chickens[J]. Poultry Science, 2011, 90(10):2281-2286.

DOI PMID

[3]
金俭. 饲用酶制剂在断奶仔猪日粮中的应用研究[D]. 硕士学位论文. 长沙: 湖南农业大学, 2005.

JIN J. Utilization of feed enzymes in weaned piglet diet[D]. Master’s Thesis. Changsha: Hunan Agricultural University, 2005. (in Chinese)

[4]
李敬, 宫官, 王润之. 外源酶制剂的潜在营养价值及其在实际生产中的应用[J]. 中国猪业, 2020, 15(5):56-59,62.

LI J, GONG G, WANG R Z. Potential nutritional value of exogenous enzyme preparations and their practical applications in production[J]. China Swine Industry, 2020, 15(5):56-59,62. (in Chinese)

[5]
张宏福, 赵峰, 张子仪. 仿生消化法评定猪饲料生物学效价的研究进展[J]. 饲料与畜牧:新饲料, 2011(3):5-9.

ZHANG H F, ZHAO F, ZHANG Z Y. Research progress on evaluating the biological value of pig feed using bionic digestion methods[J]. Feed and Livestock:New Feed, 2011(3):5-9. (in Chinese)

[6]
赵峰, 张宏福, 张子仪. 单胃动物仿生消化系统操作手册[M]. 2版. 北京: 中国农业科学院, 2011.

ZHAO F, ZHANG H F, ZHANG Z Y. Operation manual of monogastric animal bionic digestive system[M]. 2nd ed. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2011. (in Chinese)

[7]
赵江涛. 豆粕鸭代谢能值的酶学评定方法研究[D]. 硕士学位论文. 北京: 中国农业科学院, 2008.

ZHAO J T. Study on predicting the metabolizable energy of soybean meal in ducks with enzymatic method[D]. Master’s Thesis. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2008. (in Chinese)

[8]
郑卫宽. 用仿生消化仪测定棉粕鸭真代谢能值的研究[D]. 硕士学位论文. 北京: 中国农业科学院, 2009.

ZHENG W K. Study on the true metabolizable energy in ducks with bionic digestion system[D]. Master’s Thesis. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2009. (in Chinese)

[9]
VALDES E V, LEESON S. Measurement of metabolizable energy in poultry feeds by an in vitro system[J]. Poultry Science, 1992, 71(9):1493-1503.

[10]
CHIANG C C, CROOM J, CHUANG S T, et al. Development of a dynamic system simulating pig gastric digestion[J]. Asian-Australian Journal of Animal Science, 2008, 21(10):1522-1528.

[11]
CIZEK L J. Total water content of laboratory animals with special reference to volume of fluid within the lumen of the gastrointestinal tract[J]. The American Journal of Physiology, 1954, 179(1):104-110.

[12]
王雄, 唐小懿, 陈凤鸣, 等. 外源蛋白酶对肉鸡饲粮体外降解效率的影响[J]. 动物营养学报, 2018, 30(8):3184-3188.

WANG X, TANG X Y, CHEN F M, et al. Effects of exogenous protease on in vitro degradation efficiency of broiler diets[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2018, 30(8):3184-3188. (in Chinese)

[13]
王永花. 木聚糖酶制剂在鸡胃肠道作用模式研究[D]. 硕士学位论文. 南京: 南京农业大学, 2006.

WANG Y H. Study on the action mode of xylanase in the gastro-intestional tract of broiler chicken[D]. Master’s Thesis. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2006. (in Chinese)

[14]
苗华彪, 胡懋, 吴倩. 体外法评估饲用蛋白酶酶学性质、稳定性和酶解效果[J]. 饲料研究, 2020, 43(12):80-84.

MIAO H B, HU M, WU Q. Evaluation of enzymatic properties,stability and enzymatic hydrolysis of feed protease by in vitro[J]. Feed Research, 2020, 43(12):80-84. (in Chinese)

[15]
白燕. 饲用蛋白酶体外评价及其在肉仔鸡日粮中的应用研究[D]. 硕士学位论文. 呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2015.

BAI Y. Protease evaluation by the in vitro method and application in broiler diet[D]. Master’s Thesis. Hohhot: Inner Mongolia Agricultural University, 2015. (in Chinese)

[16]
耿丹, 张映, 赵燕, 等. 粗酶制剂对肉仔鸡消化酶活性的影响[J]. 山西农业科学, 2003, 31(4):81-83.

GENG D, ZHANG Y, ZHAO Y, et al. Effect on the activity of digestive enzyme in the pancreas and small intestine’s enzymes of chicken broilers by adding crude enzyme preparation[J]. Journal of Shanxi Agricultural Sciences, 2003, 31(4):81-83. (in Chinese)

[17]
艾晓杰, 韩正康. 粗酶制剂对雏鹅胰腺及小肠食糜消化酶活性和pH值的影响[J]. 吉林农业大学学报, 2001, 23(3):103-106.

AI X J, HAN Z K. Effects of crude enzyme preparation on enzyme activities and pH of pancreata and intestinal digesta in gosling[J]. Journal of Jilin Agricultural University, 2001, 23(3):103-106. (in Chinese)

[18]
奚刚, 许梓荣. 中性蛋白酶制剂对丝毛乌骨鸡氮利用率及内源性蛋白质消化酶活性的影响[J]. 浙江农业大学学报, 1998, 24(4):399-404.

XI G, XU Z R. Effects of neutral proteinase on nitrogen utilization and activities of endogenous protein digestive enzyme in Gallus gallus domesticus brisson[J]. Journal of Zhejiang Agricultural University, 1998, 24(4):399-404. (in Chinese)

[19]
左建军. 非常规植物饲料钙和磷真消化率及预测模型研究[D]. 硕士学位论文. 广州: 华南农业大学, 2005.

ZUO J J. True fecal phosphorus and calcium digestibility and predicted model of truly digestible phosphorus in unconventional plant-feedstuffs for growing pigs[D]. Master’s Thesis. Guangzhou: South China Agricultural University, 2005. (in Chinese)

[20]
COPELAND R C. Enzymes:a practical introduction to structure,mechanism,and data analysis[M]. 2nd ed. New York: Wiley, 2000.

[21]
WAGUESPACK A M, POWELL S, BIDNER T D, et al. Effect of incremental levels of L-lysine and determination of limiting amino acids in low crude protein corn-soybean meal diets for broilers[J]. Poultry Science, 2009, 88(6):1216-1226.

[22]
计成, 戎易, SCHENERMANN S E, 等. 应用体外胃蛋白酶法测定饲料可利用氨基酸的研究[J]. 农业生物技术学报, 1994, 2(2):103-109.

JI C, RONG Y, SCHENERMANN S E, et al. Measurent of availability of amino acids in poultry feedstuff by pepsin in vitro[J]. Journal of Agricultural Biotechnology, 1994, 2(2):103-109. (in Chinese)

[23]
席鹏彬, 李德发, 郑春田. 体外透析两步酶解法测定菜粕粗蛋白消化适宜酶促反应条件的建立[J]. 中国农业大学学报, 2003, 8(5):88-92.

XI P B, LI D F, ZHENG C T. Enzymatic conditions of an in vitro method using dialysis tube to study digestion of protein in rapeseed meal[J]. Journal of China Agricultural University, 2003, 8(5):88-92. (in Chinese)

[24]
张铁鹰. 植酸酶体外消化评定技术的研究[D]. 博士学位论文. 北京: 中国农业科学院, 2002.

ZHANG T Y. Technique of phytase evaluation by digestion in vitro[D]. Ph.D.Thesis. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2002. (in Chinese)

[25]
马俊孝, 张景燕, 孙作为, 等. 木聚糖酶、甘露聚糖酶体外酶解数据库的研究[J]. 饲料工业, 2009, 30(18):9-11.

MA J X, ZHANG J Y, SUN Z W, et al. Research on the database of degradation of xylanase and mannanase in vitro[J]. Feed Industry, 2009, 30(18):9-11. (in Chinese)

[26]
李卫芬, 孙建义, 许梓荣, 等. 木聚糖酶的稳定性研究[J]. 云南农业大学学报, 1999(3):250-253.

LI W F, SUN J Y, XU Z R, et al. Studies on stability of xylanase[J]. Journal of Yunnan Agricultural University, 1999(3):250-253. (in Chinese)

Options
文章导航

/

〈 〉

    联系我们

  • 地址：北京市海淀区圆明园西路2号
    　　　中国农业大学动科动医大楼153室
  • 邮编：100193
  • 电话：010－62817823
  • 网址：http://www.chinajan.com
  • E-mail：cjan@chinajan.com
京公网安备 11010802041926号    京ICP备17050989号-2