动物营养学报 >

2025 , Vol. 37 >Issue 8: 5607 - 5616

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.455

研究论文

红三叶草异黄酮含量影响因素与提取条件优化

  • 熊展博 , 1 ,
  • 李可馨 1, 2 ,
  • 王典 3 ,
  • 郑楠 1 ,
  • 古再丽努尔 4 ,
  • 王加启 1 ,
  • 赵圣国 , 1, *
展开
  • 1 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,畜禽营养与饲养全国重点实验室,北京 100193
  • 2 青岛农业大学动物科技学院,青岛 266109
  • 3 国家乳业技术创新中心,呼和浩特 010000
  • 4 新疆畜牧科学院饲料研究所,新疆饲料生物技术重点实验室,乌鲁木齐 830011
*赵圣国,研究员,博士生导师,E-mail:

熊展博(1998—),男,湖北宜昌人,博士研究生,研究方向为反刍动物营养与饲料科学。E-mail:

Copy editor: 田艳明

收稿日期: 2024-11-30

  网络出版日期: 2025-08-14

基金资助

国家乳业技术创新中心(2023-JSGG-6)

畜禽营养与饲养全国重点实验室(2004DA125184G2406)

中国农业科学院科技创新工程(ASTIP-IAS12)

新疆维吾尔自治区科技支疆项目(2022E02142)

收起

Factors Influencing Isoflavone Content in Red Clover and Optimization of Extraction Conditions

  • XIONG Zhanbo , 1 ,
  • LI Kexin 1, 2 ,
  • WANG Dian 3 ,
  • ZHENG Nan 1 ,
  • Guzailinuer 4 ,
  • WANG Jiaqi 1 ,
  • ZHAO Shengguo , 1, *
Expand
  • 1 State Key Laboratory of Animal Nutrition and Feeding, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
  • 2 College of Animal Science and Technology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China
  • 3 National Center of Technology Innovation for Dairy, Hohhot 010000, China
  • 4 Xinjiang Key Laboratory of Feed Biotechnology, Feed Research Institute, Xinjiang Academy of Animal Sciences, Urumqi 830011, China
*professor, E-mail:

Received date: 2024-11-30

  Online published: 2025-08-14

Fold

摘要

本试验旨在探究红三叶草异黄酮含量的影响因素及最佳的热回流提取条件。通过选取4个不同品种红三叶草,分别对其叶部和茎部的异黄酮含量进行测定,以确定品种和植株部位对异黄酮含量的影响。采用Box-Behnken设计3因素3水平的响应面试验,以料液比、提取温度和提取时间为影响因素,红三叶草异黄酮得率作为考察依据,采用80%乙醇作为萃取溶剂,确定最佳的提取条件。结果表明:1)Xuanli品种红三叶草总异黄酮含量最高,为5.92 g/kg DM,显著高于其他3个品种(P<0.05);红三叶草叶部总异黄酮含量和质量百分比均显著高于茎部(P<0.05)。2)最佳提取条件为料液比1∶18(g∶mL)、提取温度90 ℃、提取时间1 h,此时异黄酮得率为93.71%。由此可知,红三叶草品种显著影响异黄酮含量,叶部异黄酮富集程度高于茎部。本试验成功筛选出了红三叶草异黄酮的最佳提取条件,为工业生产红三叶草异黄酮提供了有效数据支撑。

关键词： 红三叶草; 异黄酮; 提取优化; 响应面法

本文引用格式

熊展博 , 李可馨 , 王典 , 郑楠 , 古再丽努尔 , 王加启 , 赵圣国 . 红三叶草异黄酮含量影响因素与提取条件优化[J]. 动物营养学报, 2025 , 37(8) : 5607 -5616 . DOI: 10.12418/CJAN2025.455

Abstract

The purpose of this experiment was to explore the influencing factors of isoflavone content in red clover and the best extraction conditions by thermal reflux. By selecting four different varieties of red clover, the isoflavone contents in their leaves and stems were analyzed respectively to determine the effects of varieties and plant parts on the isoflavone contents. Box-Behnken design was used to design a response surface experiment with three factors and three levels. The solid to liquid ratio, extraction temperature and extraction time were the factors affecting the extraction efficiency, the yield of isoflavones in red clover was taken as the investigation basis, and 80% ethanol was used as the extraction solvent to determine the best extraction conditions. The results showed as follows: 1) the Xuanli variety of red clover had the highest total isoflavone content, which was 5.92 g/kg DM, and significantly higher than that in the other three varieties (P<0.05); the total isoflavone content and mass percentage in leaves of red clover were significantly higher than those in stems (P<0.05). 2) The optimum extraction conditions were as follows: the solid to liquid ratio was 1∶18 (g∶mL), the extraction temperature was 90 ℃, and the extraction time was 1 h. Under these conditions, the isoflavone yield was 93.71%. It can be seen that the variety of red clover significantly affects the isoflavone content, and the isoflavone enrichment degree in leaves is higher than that in stems. This experiment successfully screened out the best extraction conditions of red clover isoflavones, which provided effective data support for industrial production of red clover isoflavones.

Key words： red clover; isoflavone; extraction optimization; response surface methodology

红三叶草(Trifolium pratense L.)是一种全球范围内重要的豆科牧草,被广泛用作反刍动物饲料[1]。由于其高消化率和高蛋白质含量,红三叶草具有很高的饲用价值[2-3]。此外,红三叶草中富含活性成分异黄酮,因其具有雌激素活性功能,被广泛开发成保健品用以治疗女性更年期症状[4-5]。在反刍动物中,作为红三叶草主要异黄酮之一的鹰嘴豆芽素A可以改善瘤胃纤维分解菌降解能力[6],增强乳酸代谢[7],缓解亚急性瘤胃酸中毒[8],显著提高奶山羊和奶牛产奶量、乳成分含量以及饲料利用率,提高动物生产性能[9-10]。此外,在体外发酵试验中发现其可以抑制尿素分解菌活性,提高微生物蛋白合成效率和氮利用率[11]。相关研究也表明,红三叶草异黄酮对泌乳奶牛激素调节、抗炎作用和免疫能力有积极影响[12]。2023年,红三叶草异黄酮作为一种新型植物源成分获批为新饲料添加剂。但红三叶草异黄酮含量受到多种因素影响,如红三叶草植株成熟度、植株部位、保存方式和土壤,尤其是品种对异黄酮含量影响较大[13]。目前,提取红三叶草提取异黄酮普遍采取溶剂提取和热回流提取等传统提取方法,因新提取技术如超声提取[14]、微波辅助[15]和生物酶解[16]等方法存在操作繁杂、成本高昂等问题,限制了其工业化生产[17-19]。Box-Behnken设计作为响应面法常用的试验设计方法,在保证试验次数较少的情况下,能有效解决多变量问题[20]。因此,本试验以红三叶草为研究对象,探究品种和植株部位对红三叶草异黄酮含量的影响,并通过热回流提取法利用响应面试验设计优化红三叶草提取异黄酮的工艺条件,为相关提取工艺的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试剂

4种红三叶草种子Reder、Xuanli、Agil、Suprt均购自百绿国际草业有限公司。大豆苷元标准品(含量≥98%,西格玛奥德里奇贸易有限公司),染料木素标准品(含量≥98%,西格玛奥德里奇贸易有限公司),刺芒柄花素标准品(含量≥98%,西格玛奥德里奇贸易有限公司),鹰嘴豆芽素A标准品(含量≥98%,西格玛奥德里奇贸易有限公司)。甲醇(色谱纯,国药集团化学试剂北京有限公司),乙腈(色谱纯,国药集团化学试剂北京有限公司),无水乙醇(分析纯,西格玛奥德里奇贸易有限公司),三氟乙酸(分析纯,西格玛奥德里奇贸易有限公司),双蒸水。

1.2 试验仪器和设备

恒温光照培养箱MGC-1000BP-2L(上海一恒科学仪器有限公司),样品粉碎机BF-04(北京莱万生物技术有限公司),电热恒温烘干箱DHG-9030AL(北京陆希科技有限公司),集热式恒温加热磁力搅拌器DF-101S(北京鑫益成科技有限公司),数显型旋转蒸发仪RV 10 digital V(广州艾卡仪器设备有限公司),恒温水浴锅JULABO PURA22(北京优莱博技术有限公司),Waters 2695高效液相色谱仪配有2998二极管阵列检测器(上海沃特世科技有限公司)。

1.3 不同品种红三叶草及其部位预处理

选取籽粒饱满、整齐一致的红三叶草(Reder、Xuanli、Agil、Suprt)草种,置于平板培养皿中,在恒温光照培养箱中以16 h光照、8 h黑暗并加去离子水催芽,24 h后清洗草种并换水,2 d后种皮开裂。将草种进行条播,条播行距20 cm,播种深度1.5~2.0 cm。播种出苗后,及时进行杂草清除和灌溉,追肥有机肥和适量磷肥。于盛花期进行刈割,每个品种红三叶草采样40株,其中20株全株65 ℃烘干至恒重(12 h),另外20株按茎、叶部位分别65 ℃烘干至恒重,研钵研磨为粉末后室温保存,用于后续异黄酮含量的测定。

1.4 红三叶草异黄酮提取流程

根据不同品种红三叶草异黄酮含量结果,筛选异黄酮含量最高的红三叶草品种,用于红三叶草异黄酮的提取。盛花期刈割后,准确称取20.0 g 65 ℃烘干研磨粉碎红三叶草于圆底烧瓶,每份样品进行3次重复,按照响应面设定条件下的料液比、提取温度和提取时间,加入80%乙醇进行热回流提取;提取完成后真空抽滤取滤液弃滤渣,然后将滤液通过旋蒸仪减压真空浓缩,回收溶剂,将提取物真空干燥后即得红三叶草浸膏;最后,加入10 mL甲醇复溶,取1 mL过0.22 μm尼龙滤膜过滤后待高效液相色谱(HPLC)测定红三叶草异黄酮含量。

1.5 红三叶草异黄酮得率的判定

红三叶草异黄酮得率按照以下公式计算:

红三叶草异黄酮得率(%)=100×(Wt×Nt)/(Wy×Ny)。

式中:Wt表示提取物重量(g);Nt表示提取物异黄酮含量(mg/g);Wy表示原料重量(g);Ny表示原料异黄酮含量(mg/g)。

1.6 响应面优化试验设计

采用Box-Behnken设计3因素3水平的响应面试验,将料液比、提取温度和提取时间作为自变量,红三叶草异黄酮得率作为响应值,试验设计因素及水平见表1。
表1 热回流提取Box-Behnken试验设计因素及水平

Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design for heat reflux extraction

水平
Levels		 因素Factors
料液比
Solid to liquid ratio (A)/(g∶mL)		 提取温度
Extraction temperature (B)/℃		 提取时间
Extraction time (C)/h
-1 1∶6 50 0.50
0 1∶12 75 1.25
1 1∶18 100 2.00

1.7 红三叶草异黄酮测定

1.7.1 色谱条件

色谱柱为XBridge C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A为25%乙腈水溶液(含0.05%三氟乙酸),流动相B为100%乙腈(含0.05%三氟乙酸);柱温为40 ℃,检测波长为270 mm,流速为1 mL/min,进样量为10 μL。流动相梯度洗脱程序见表2。
表2 流动相梯度洗脱程序

Table 2 Gradient elution procedure of mobile phases %

时间
Time/min		 流动相A
Mobile phase A		 流动相B
Mobile phase B
0.0 90 10
4.0 90 10
8.0 87 13
14.0 80 20
16.0 73 27
18.0 55 45
22.0 50 50
23.0 40 60
24.5 26 73
26.0 0 100
29.0 90 10

1.7.2 标准工作溶液的制备

分别准确称取大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素A标准品20.00 mg(误差≤0.05 mg)于100 mL棕色容量瓶中,加入甲醇超声10 min溶解并定容,配制成浓度为200 μg/mL的标准储备液,于-20 ℃以下保存。分别准确量取1 mL上述标准品储备液于10 mL离心管中,混匀后准确移取适量混合标准品溶液稀释,配制成浓度分别为1.562 5、3.125 0、6.250 0、12.500 0、25.000 0和50.000 0 μg/mL的系列标准工作溶液。

1.7.3 供试品溶液的制备

分别准确称取供试样品10 mg于50 mL棕色容量瓶中,加入甲醇超声10 min溶解并定容,配制成浓度为200 μg/mL的供试样品溶液。

1.7.4 HPLC检测

分别量取1 mL上述系列混合标准工作溶液、供试样品溶液,通过0.2 μm滤膜过滤,按照从低浓度到高浓度的顺序依次进样,进样量为10 μL,每个样品连续进样2次取平均值。经HPLC对供试品溶液进行分析,通过与标准工作溶液比对,采用面积归一化法确认供试品溶液HPLC纯度,以标准工作溶液的浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线,得到标准线性回归方程:大豆苷元标准曲线方程为Y=63 394X-4 363.8[决定系数(R2)=1.000 0],染料木素标准曲线方程为Y=64 799X-1 962.6(R2=0.999 9),刺芒柄花素标准曲线方程为Y=127 495X-12 903(R2=0.999 4),鹰嘴豆芽素A标准曲线方程为Y=67 320X-1 547.1(R2=0.999 9);并以此计算供试样品4个品种红三叶草的茎、叶中大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素A含量以及红三叶草异黄酮浸膏的异黄酮含量。

1.8 数据统计与响应面分析

采用Microsoft 365中的Excel对试验数据进行初步统计,然后采用SAS 9.4软件对品种对红三叶草异黄酮含量影响的数据进行单因素方差分析和Duncan氏法多重比较,对植株部位对红三叶草异黄酮含量影响的数据进行独立样本t检验,结果采用平均值和均值标准误(SEM)表示,P<0.05表示差异显著。采用Design Expert 13.0进行Box-Behnken试验设计和分析并作图。

2 结果与分析

2.1 品种对红三叶草异黄酮含量的影响

由表3可知,在异黄酮单体方面,4个品种的红三叶草主要含有刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素A。各品种红三叶草主要异黄酮(刺芒柄花素+鹰嘴豆芽素A)占总异黄酮质量百分比均超过84%,其中Xuanli品种的主要异黄酮占比最高,为92.79%;而Agil品种占比最低,为84.23%,且显著低于其他3个品种(P<0.05)。此外,4个品种的红三叶草总异黄酮含量存在显著差异(P<0.05),其中Xuanli品种最高,为5.92 g/kg DM,显著高于其他3个品种(P<0.05);其次为Reder品种,总异黄酮含量为4.72 g/kg DM;Suprt品种总异黄酮含量为4.62 g/kg DM;Agil品种总异黄酮含量最低,为2.72 g/kg DM,显著低于其他3个品种(P<0.05)。4个品种红三叶草间大豆苷元、刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素A含量存在显著差异(P<0.05),染料木素含量差异不显著(P>0.05),且Xuanli品种的主要异黄酮含量显著高于其他3个品种(P<0.05)。
表3 品种对红三叶草异黄酮含量的影响

Table 3 Effects of variety on isoflavone contents in red clover

项目
Items		 品种Variety 均值标准误
SEM		 P值
P-value
Xuanli Suprt Agil Reder
含量Content/(g/kg DM)
大豆苷元Dadzein 0.11ab 0.06b 0.13a 0.14a 0.011 0.034
染料木素Genistein 0.32 0.29 0.29 0.32 0.011 0.527
刺芒柄花素Formononetin 4.02a 1.98b 1.01c 1.97b 0.294 <0.001
鹰嘴豆芽素A Biochanin A 1.47b 2.28a 1.29b 2.29a 0.136 0.001
主要异黄酮Major isoflavones 5.49a 4.26b 2.30c 4.26b 0.320 <0.001
总异黄酮Total isoflavones 5.92a 4.62b 2.72c 4.72b 0.321 <0.001
占总异黄酮质量百分比Mass percentage of total isoflavones/%
大豆苷元Dadzein 1.82b 1.38b 5.13a 3.08ab 0.507 0.019
染料木素Genistein 5.39b 6.34b 10.64a 6.98b 0.577 <0.001
刺芒柄花素Formononetin 68.11a 42.97b 36.80c 41.48bc 3.227 <0.001
鹰嘴豆芽素A Biochanin A 24.68b 49.31a 47.43a 48.46a 2.734 <0.001
主要异黄酮Major isoflavones 92.79a 92.28a 84.23b 89.94a 1.032 0.001

主要异黄酮为刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素A之和。下表同。Main isoflavones were the sum of formononetin and biochanin A. The same as below.

同行数据肩标相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05),不同字母表示差异显著(P<0.05)。In the same row, values with the same letter or no letter superscripts indicated no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts indicated significant difference (P<0.05).

2.2 植株部位对红三叶草异黄酮含量的影响

由表4可知,大豆苷元和染料木素含量在叶部和茎部之间均无显著差异(P>0.05),这表明这2种异黄酮成分在红三叶草的叶和茎中分布较为均匀。相比之下,刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素A含量在2个部位之间差异显著(P<0.05),具体表现为这2种异黄酮含量在叶部均显著高于茎部(P<0.05)。叶部主要异黄酮含量平均值为6.17 g/kg DM,其中刺芒柄花素含量约为鹰嘴豆芽素A含量的1.23倍,但茎部刺芒柄花素含量与鹰嘴豆芽素A含量相近,表明红三叶草的叶中主要异黄酮成分更为富集。关于异黄酮质量百分比,叶部刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素A质量百分比也均显著高于茎部(P<0.05)。叶部刺芒柄花素质量百分比为60.75%,而茎部仅为39.25%;叶部鹰嘴豆芽素A质量百分比为60.48%,而茎部仅为39.52%。此外,叶部总异黄酮质量百分比为58.75%,而茎部为41.25%,2个部位之间差异显著显著(P<0.05)。结果进一步表明,红三叶草的叶部不仅在异黄酮含量上占优,其质量百分比也高于茎部。
表4 植株部位对红三叶草异黄酮含量的影响

Table 4 Effects of plant parts on isoflavone contents in red clover

项目
Items		 部位Parts 均值标准误
SEM		 P值
P-value
叶Leaves 茎Stems
含量Content/(g/kg DM)
大豆苷元Dadzein 0.12 0.10 0.019 0.501
染料木素Genistein 0.31 0.31 0.026 0.453
刺芒柄花素Formononetin 3.40 1.41 0.491 0.001
鹰嘴豆芽素A Biochanin A 2.76 1.21 0.319 <0.001
主要异黄酮Major isoflavones 6.17 2.62 0.659 <0.001
总异黄酮Total isoflavones 6.59 3.03 0.667 <0.001
异黄酮质量百分比Mass percentage of isoflavones/%
大豆苷元Dadzein 49.28 50.72 3.466 0.840
染料木素Genistein 41.87 58.13 1.848 <0.001
刺芒柄花素Formononetin 60.75 39.25 2.650 <0.001
鹰嘴豆芽素A Biochanin A 60.48 39.52 2.831 <0.001
主要异黄酮Major isoflavones 60.29 39.71 2.641 <0.001
总异黄酮Total isoflavones 58.75 41.25 2.422 <0.001

异黄酮质量百分比=100×(某部位异黄酮含量×某部位质量)/(叶部异黄酮含量×叶部质量+茎部异黄酮含量×茎部质量)。

Mass percentage of isoflavones=100×(isoflavone content in a certain part×mass of a certain part)/(isoflavone content in leaves×mass of leaves+isoflavone content in stems×mass of stems).

2.3 Box-Behnken模型拟合

2.3.1 热回流提取响应面模型和方差分析

以料液比(A)、提取温度(B)和提取时间(C)为考察因素,红三叶草异黄酮得率(R)为响应值,利用Design-Expert 13.0进行Box-Behnken设计,优化红三叶草异黄酮热回流提取试验方案及结果如表5所示,当料液比为1∶18(g∶mL)、提取温度为100 ℃、提取温度为1.25 h时,红三叶草异黄酮得率达到最大,为93.42%。
表5 热回流提取响应面试验设计及结果

Table 5 Design and results of response surface experiment for thermal reflux extraction

试验序号
Experimental No.		 料液比
Solid to liquid ratio (A)/
(g∶mL)		 提取温度
Extraction temperature
(B)/℃		 提取时间
Extraction time
(C)/h		 红三叶草异黄酮得率
Yield of isoflavones in
red clover (R)/%
1 1∶12 100 0.50 55.43
2 1∶6 75 0.50 64.81
3 1∶18 75 2.00 87.93
4 1∶6 50 1.25 66.34
5 1∶18 100 1.25 93.42
6 1∶12 75 1.25 84.62
7 1∶18 75 0.50 59.00
8 1∶6 100 1.25 42.57
9 1∶12 100 2.00 53.33
10 1∶18 50 1.25 38.20
11 1∶12 50 0.50 47.81
12 1∶12 75 1.25 85.05
13 1∶12 75 1.25 80.79
14 1∶6 75 2.00 67.58
15 1∶12 50 2.00 63.02
16 1∶12 75 1.25 86.75
17 1∶12 75 1.25 85.46
利用Design-Expert 13.0对数据进行方差分析,结果如表6所示,该模型极显著(P<0.01),失拟项显著(P<0.05),说明该模型的拟合程度较好。从显著性方面分析,料液比(A)和提取时间(C)对红三叶草异黄酮得率有显著影响(P<0.05),料液比(A)与提取温度(B)的交互作用对红三叶草异黄酮得率有极显著影响(P<0.01),料液比(A)与提取时间(C)的交互作用对红三叶草异黄酮得率有显著影响(P<0.05),提取温度(B)和提取时间(C)与红三叶草异黄酮得率存在极显著二次关系(P<0.01)。根据各因素的P值可得,各因素对红三叶草异黄酮得率的影响大小顺序依次为:提取时间>料液比>提取温度。
表6 热回流提取响应面试验方差分析

Table 6 Analysis of variance of response surface experiment for thermal reflux extraction

方差来源
Variance
sources		 平方和
Sum of
squares		 自由度
Degree of
freedom		 均方
Mean square		 F值
F-value		 P值
P-value		 显著性
Significance
模型Model 4 650.54 9 516.73 17.06 0.000 6 **
A 173.45 1 173.45 5.73 0.048 0 *
B 107.90 1 107.90 3.56 0.101 1 ND
C 250.99 1 250.99 8.29 0.023 7 *
AB 1 559.86 1 1 559.86 51.49 0.000 2 **
AC 171.09 1 171.09 5.65 0.049 1 *
BC 74.91 1 74.91 2.47 0.159 8 ND
A2 94.38 1 94.38 3.12 0.120 9 ND
B2 1 628.59 1 1 628.59 53.76 0.000 2 **
C2 418.49 1 418.49 13.81 0.007 5 **
残差Residual 212.05 7 30.29
失拟项Lack of fit 191.99 3 64.00 12.76 0.016 2 *
误差项Pure error 20.06 4 5.01
总和Sum 4 862.59 16

A:料液比 solid to liquid ratio;B:提取温度 extraction temperature;C:提取时间 extraction time。

ND表示差异不显著(P>0.05),*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)。ND indicated no significant difference (P>0.05), * indicated significant difference (P<0.05), and ** indicated extremely significant difference (P<0.01).

2.3.2 热回流提取响应面交互作用分析

响应值与各因素交互作用构成等高线和响应面,等高线形状反映2因素之间交互作用的强弱,圆形表示交互作用不明显,椭圆形形变越强则交互作用越明显[21]。图1反映料液比(A)与提取温度(B)的交互作用对红三叶草异黄酮得率的影响,图2反映料液比(A)与提取时间(C)的交互作用对红三叶草异黄酮得率的影响,图3反映提取温度(B)与提取时间(C)的交互作用对红三叶草异黄酮得率的影响,结合方差分析可知,料液比与提取温度的交互作用对红三叶草异黄酮影响最大,其次为料液比与提取时间的交互作用,提取温度与提取时间的交互作用对红三叶草异黄酮得率影响最小。
图1 料液比与提取温度交互作用对红三叶草异黄酮得率影响的响应面图和等高线图

a:响应面图response surface plot;b:等高线图 contour plot。

Fig.1 Response surface plot and contour plot of interaction between solid to liquid ratio and extraction temperature on yield of isoflavones in red clover

图2 料液比与提取时间交互作用对红三叶草异黄酮得率影响的响应面图和等高线图

a:响应面图response surface plot;b:等高线图 contour plot。

Fig.2 Response surface plot and contour plot of interaction between solid to liquid ratio and extraction time on yield of isoflavones in red clover

图3 提取温度与提取时间交互作用对红三叶草异黄酮得率影响的响应面图和等高线图

a:响应面图response surface plot;b:等高线图 contour plot。

Fig.3 Response surface plot and contour plot of interaction between extraction temperature and extraction time on yield of isoflavones in red clover

2.3.3 热回流提取响应面验证试验

按照响应面软件优化给出的数据,可知预测的最优提取条件为料液比1∶18(g∶mL)、提取温度90 ℃、提取时间1 h;在此操作条件下重复3次试验,测得红三叶草异黄酮得率平均值为93.71%(表7),与响应面数据模型预测值95.65%偏差不大,表明该模型可较好预测红三叶草异黄酮得率。
表7 热回流提取响应面验证试验

Table 7 Response surface validation experiment for thermal reflux extraction %

项目
Item		 试验序号Experimental No. 平均值
Average value
1 2 3
红三叶草异黄酮得率Yield of isoflavones in red clover 94.72 92.88 93.52 93.71

3 讨论

3.1 品种和植株部位对红三叶草异黄酮含量的影响

红三叶草异黄酮含量受环境、生长周期、品种、保存方式以及植株部位等多因素的综合影响,本试验从主要影响因素品种和植株部位进行研究,对4个品种的2个主要部位叶和茎进行红三叶草异黄酮含量差异的比较。结果发现,Xuanli品种的刺芒柄花素含量高于鹰嘴豆芽素A,其余3个品种的异黄酮单体含量均是鹰嘴豆芽素A更高,并且4个品种的总异黄酮含量存在显著差异,说明不同品种对异黄酮单体和总异黄酮含量的变化作用显著[22]。但4种品种中刺芒柄花素和鹰嘴豆素A含量之和远高于其他异黄酮,作为红三叶草主要异黄酮,植物体内次生代谢产物含量取决于植物积累此物质的能力[23],由此说明红三叶草积累主要异黄酮的能力远高于其他异黄酮。筛选出异黄酮含量高的品种对红三叶草品种选育工作和提高异黄酮提取产量具有理论指导意义。
此外,本试验发现,植株部位异黄酮含量存在显著差异,叶部异黄酮含量高于茎部,且刺芒柄花素含量约为鹰嘴豆芽素A含量的1.23倍。McMurray等[24]研究同样发现,不同红三叶草样本的叶部刺芒柄花素含量较高。Wu等[25]研究发现,在4种不同环境中生长的红三叶草总异黄酮含量均在叶部最高,高于茎部。Tsao等[26]对13个不同品种的红三叶草叶片、花、叶柄和茎的异黄酮含量进行测定,发现鹰嘴豆芽素A和刺芒柄花素是所有品种和所有部位的主要异黄酮,并且叶部的异黄酮含量最高,其次是茎、叶柄和花。由此说明,不同红三叶草品种中异黄酮最富集的部位均是叶部,这与本试验得到的结果一致。

3.2 红三叶草异黄酮提取响应面优化

本试验以传统热回流提取为基础对红三叶草异黄酮的提取条件进行优化。由于提取过程中红三叶草异黄酮含量的影响因素较多,分别选择3个影响最大的因素,以红三叶草异黄酮得率为响应值,设计响应面,筛选节约生产成本、提高生物质利用率的最佳试验方案。经验证,新鲜红三叶草经65 ℃烘干12 h后,红三叶草最佳热回流提取条件为1∶18 (g∶mL)料液比、90 ℃提取1 h,在此条件下异黄酮得率为93.71%,且试验数据均经过多次试验验证。

4 结论

红三叶草异黄酮含量受多种因素影响,本试验从主要影响因素品种和部位进行研究发现,品种显著影响异黄酮含量,叶部异黄酮含量高于茎部。结合Box-Behnken设计优化红三叶草异黄酮的热回流提取条件,其最佳提取条件为料液比1∶18(g∶mL)、提取温度90 ℃、提取时间1 h,在此条件下异黄酮得率为93.71%,为工业生产红三叶草异黄酮提供了有效数据支撑。

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