动物营养学报 >

2025 , Vol. 37 >Issue 8: 5657 - 5666

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.459

研究论文

野生黑鸢源巨大普里斯特氏菌的分离鉴定及安全性评价

  • 谢怀茹 , 1 ,
  • 石蕊 1 ,
  • 王旭翔 1 ,
  • 戴宗茂 1 ,
  • 林峻 2 ,
  • 靳茜 2 ,
  • 地丽热巴·地里夏提 2 ,
  • 阿依乔丽凡·沙汉 2 ,
  • 肖莹 1 ,
  • 麦多 1 ,
  • 王金泉 , 1, *
展开
  • 1 新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐 830052
  • 2 新疆维吾尔自治区草原生物灾害防控中心,乌鲁木齐 830099
*王金泉,教授,博士生导师,E-mail:

谢怀茹(2000—),女,甘肃天水人,硕士研究生,研究方向为动物生长发育调控及保健。E-mail:

Copy editor: 菅景颖

收稿日期: 2025-01-03

  网络出版日期: 2025-08-14

基金资助

国家自然科学基金项目(32160823)

中哈边境区域野生动物疫源疫病调查项目(2522HXKT2)

收起

Isolation, Identification and Safety Evaluation of a Wild Milvus migrans-Derived Priestia megaterium

  • XIE Huairu , 1 ,
  • SHI Rui 1 ,
  • WANG Xuxiang 1 ,
  • DAI Zongmao 1 ,
  • LIN Jun 2 ,
  • JIN Qian 2 ,
  • Dilireba Dilixati 2 ,
  • Ayijorifan Shahan 2 ,
  • XIAO Ying 1 ,
  • MAI Duo 1 ,
  • WANG Jinquan , 1, *
Expand
  • 1 College of Veterinary Medicine, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China
  • 2 Xinjiang Uygur Autonomous Region Grassland Biological Disaster Control Center, Urumqi 830099, China
*professor, E-mail:

Received date: 2025-01-03

  Online published: 2025-08-14

Fold

摘要

本试验旨在从野生黑鸢(Milvus migrans)粪便中分离出耐药较少、更安全且具有益生潜力的菌株。采集野生黑鸢的新鲜粪便样品,分离菌株后进行形态学观察、革兰氏染色镜检及生化鉴定,利用PCR扩增及16S rRNA测序对分离菌株进行种属鉴定,并对其进行体外益生潜力测定和体内安全性评估。结果显示:1)本试验从野生黑鸢粪便中分离到1株巨大普里斯特氏菌(Priestia megaterium),命名为巨大普里斯特氏菌YF9;2)该菌株在pH为2、4、6的条件下存活率分别为9.16%、65.98%、83.77%,在胆盐浓度为0.1%、0.2%、0.3%的条件下存活率分别为74.91%、59.95%、9.44%;3)该菌株在4 h后的自聚集率为55.43%,24 h后高达91.76%;4)该菌株的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除率为60.85%;5)该菌株仅对红霉素和克林霉素表现为中介,对其余12种抗生素均表现出敏感性,且无溶血活性;6)该菌株对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)有较好的抑制作用;7)灌胃该菌株后,小鼠没有死亡,形态、被毛、分泌物及排泄物均无异常,剖检过程中脏器无出血现象,眼观无异常;体重变化和血液学指标没有显著变化(P>0.05)。综上所述,本试验从野生黑鸢粪便中分离的巨大普里斯特氏菌YF9耐药较少、有良好的体外益生潜力和体内安全性,可作为动物微生态制剂的候选菌株。

关键词： 野生黑鸢; 巨大普里斯特氏菌; 分离鉴定; 安全性评价

本文引用格式

谢怀茹 , 石蕊 , 王旭翔 , 戴宗茂 , 林峻 , 靳茜 , 地丽热巴·地里夏提 , 阿依乔丽凡·沙汉 , 肖莹 , 麦多 , 王金泉 . 野生黑鸢源巨大普里斯特氏菌的分离鉴定及安全性评价[J]. 动物营养学报, 2025 , 37(8) : 5657 -5666 . DOI: 10.12418/CJAN2025.459

Abstract

This experiment aimed to isolate strains with low antibiotic resistance, higher safety, and probiotic potential from the feces of wild Milvus migrans. Fresh fecal samples of wild Milvus migrans were collected. After isolating the strains, morphological observation, Gram staining microscopy and biochemical identification were carried out. PCR amplification and 16S rRNA sequencing were used to identify the species and genus of the isolated strains, and in vitro probiotic potential determination and in vivo safety evaluation were conducted on them. The results showed as follows: 1) one strain of Priestia megaterium was isolated from the feces of wild Milvus migrans in this experiment and named Priestia megaterium YF9. 2) The survival rates of this strain were 9.16%, 65.98% and 83.77% under the conditions of pH 2, 4, and 6, respectively, and 74.91%, 59.95% and 9.44% under the conditions of bile salt concentrations of 0.1%, 0.2% and 0.3%, respectively. 3) The auto-aggregation rate of this strain was 55.43% after 4 hours and as high as 91.76% after 24 hours. 4) The 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging rate of this strain was 60.85%. 5) This strain was only intermediate to erythromycin and clindamycin, showed sensitivity to the remaining 12 antibiotics, and had no hemolytic activity. 6) This strain had a good inhibitory effect on Staphylococcus aureus. 7) After intragastric administration of this strain, no mice died. There were no abnormalities in their morphology, hair, secretions, and excreta. No bleeding was observed in the organs during the autopsy, and no abnormalities were found macroscopically. There were no significant changes in body weight and hematological parameters (P>0.05). In conclusion, the Priestia megaterium YF9 isolated from the feces of wild Milvus migrans in this experiment has low antibiotic resistance, good in vitro probiotic potential, and in vivo safety, and can be used as a candidate strain for animal probiotic preparations.

Key words： Milvus migrans; Priestia megaterium; isolation and identification; safety evaluation

随着2019年我国农业农村部194号文件的发布,“饲料禁抗”时代到来,“替抗”产品的开发成为一种趋势,目前比较广泛使用的“替抗”产品有中草药、益生菌、噬菌体等。益生菌是活的微生物,其被摄入后可以增强宿主健康,并通过增强免疫系统、对传染病的抵抗力等机制发挥其作用[1]。
抗生素的长期使用,会使得细菌逐渐适应甚至获得性耐药。野生动物甚少使用抗生素,推测野生动物源菌株迫于抗生素压力的获得性耐药较少。黑鸢(Milvus migrans)为国家Ⅱ级重点保护野生动物,目前有关黑鸢肠道微生物的研究较少。因此,本研究拟从野生黑鸢粪便中分离出耐药少且具有益生特性的菌株,以进一步丰富我国野生动物源益生菌资源,并为研制安全髙效的饲用益生菌产品提供候选菌株。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 野生黑鸢粪便样品液制备

在新疆某野生动物救助站采集野生黑鸢新鲜粪便,用无菌棉签将2 g新鲜粪便放入5 mL无菌液体培养基(甘油与LB肉汤比例为1∶1)中混匀,冷链运回实验室。

1.1.2 主要试剂及供试菌株

LB肉汤、LB琼脂培养基和HBI芽孢杆菌生化鉴定条购自青岛海博生物技术有限公司;脱纤维绵羊血、牛胆盐购自北京索莱宝科技有限公司;细菌药敏片来源为杭州滨和微生物试剂有限公司;金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和沙门氏菌(Salmonella)为新疆农业大学动物医学学院临床产科实验室保存菌株。

1.1.3 试验动物

试验动物为购买于新疆医科大学实验动物中心的昆明小鼠,共28只(雌雄各占1/2),体重为(20±2) g。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的分离与纯化

吸取100 μL前期制备的野生黑鸢粪便样品液,加入0.9 mL生理盐水中涡旋混匀,水浴锅80 ℃加热处理20 min,沉淀后吸取上清液100 μL接种于LB肉汤过夜培养,之后用生理盐水梯度稀释获得10-5和10-6稀释度的菌液,分别吸取100 μL涂布于LB琼脂培养基培养16~24 h,挑取形态不同的单菌落接种于LB肉汤增菌培养,然后进行LB琼脂培养基划线,重复2~3次,纯化完成后与甘油混合保藏。

1.2.2 分离菌株的形态学观察

将纯化完全的菌株在LB琼脂培养基划线,观察菌落形态,使用革兰氏染色试剂进行细菌染色,用油镜观察菌株形态并拍照记录。

1.2.3 分离菌株的生化鉴定

使用HBI芽孢杆菌生化鉴定条对分离菌株进行生化鉴定,鉴定结果与《伯杰氏系统细菌手册》对比。

1.2.4 分离菌株的16S rRNA基因序列分析

提取细菌DNA,使用细菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')进行目的基因PCR扩增。PCR扩增程序为95 ℃初始变性3 min;95 ℃变性30 s;57 ℃退火30 s;72 ℃延伸30 s;25个循环;72 ℃总延伸5 min。将PCR产物连接载体,送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,测序结果上传于NCBI网站进行序列比对,再用MEGA 11.0.13软件制作进化树分析种属。

1.2.5 分离菌株的耐酸、耐胆盐能力测定

耐酸能力测定:将冻存菌株活化增菌培养,分别加入到用盐酸预调的pH为2.0、4.0、6.0、7.0(对照)的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,放于摇床37 ℃、180 r/min处理4 h。吸取处理后的菌液100 μL采用梯度稀释法稀释至适合的倍数,后取100 μL进行平板涂布,每个pH进行3个重复,培养24 h后计数平板上的活菌数。相对存活率计算方法如下:
相对存活率(%)=(试验组活菌数/对照组活菌数)×100。
耐胆盐能力测定:将冻存菌株活化增菌培养,分别加入到胆盐浓度为0(对照)、0.1%、0.2%、0.3%的PBS中,后续试验方法与相对存活率的计算同耐酸能力测定。

1.2.6 分离菌株的自聚集性测定

自聚集性的测定参照Pełka等[2]的方法并略作调整:将菌株在LB肉汤中增菌培养16 h后,将菌液1 500×g离心10 min,用PBS洗涤1次,重悬于PBS中并使其在600 nm处的吸光度(A0)达到0.1~0.2。取上述菌悬浮液5 mL,在37 ℃下孵育24 h,并分别在4和24 h时取样测定其在600 nm处的吸光度(At)。自聚集率的计算公式如下:

自聚集率(%)=(1-At/A0)×100。

1.2.7 分离菌株的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力测定

参照董盼盼等[3]的检测方法,将冻存菌株活化增菌培养制作菌悬液,取1 mL菌悬液与1 mL DPPH溶液(用无水乙醇配制为0.2 mmol/L),置于2 mL离心管中,充分混匀后室温避光反应30 min。反应结束后以1 500×g离心10 min,在517 nm处测定上清液吸光度(As),并用等体积生理盐水替代样品测定吸光度(Ac)。测定前以等量的无水乙醇和生理盐水的混合液作为空白,进行零点校正。DPPH自由基清除率计算公式如下:

DPPH自由基清除率(%)=(1-As/Ac)×100。

1.2.8 分离菌株的药物敏感性试验

采用K-B纸片扩散法对菌株进行14种抗生素(青霉素、氨苄西林、亚胺培南、美罗培南、丁胺卡那、红霉素、庆大霉素、四环素、克林霉素、氯霉素、万古霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明)药敏试验。将冻存菌株活化增菌培养后,用PBS重悬成浓度为1×108 CFU/mL的菌悬液,取100 μL菌悬液进行平板涂布,用无菌镊子将药敏纸片贴于培养基表面,37 ℃培养24 h后,测量抑菌圈直径,判断敏感性。

1.2.9 分离菌株的溶血试验

将冻存菌株活化增菌培养后,在LB-脱纤维绵羊血琼脂血平板上进行划线,37 ℃培养24 h,观察是否产生溶血现象。

1.2.10 分离菌株的抑菌试验

抑菌试验采用打孔法:将冻存菌株活化增菌培养后,用PBS洗涤沉淀,重悬成浓度为1×108 CFU/mL的菌悬液,将指示菌(沙门氏菌和金黄色葡萄球菌)增菌培养至浓度为1×108 CFU/mL后,将指示菌用棉签均匀涂布于LB琼脂培养基上,将培养基打孔,吸取100 μL菌悬液加入孔中,37 ℃培养24 h后测定其抑菌圈直径。抑菌圈直径大于孔径(8 mm)1 mm判定其具有抑菌性。

1.2.11 分离菌株的动物安全性试验

用PBS重悬菌液,将菌悬液浓度调为1×109 CFU/mL。将28只昆明小鼠分为2组,每组14只(雌雄各7只)。第1天,试验组小鼠灌胃菌悬液(0.2 mL/只),对照组小鼠灌胃PBS(0.2 mL/只),自由饮食,后续仅观察(连续观察7 d),每天记录体重变化,观察小鼠精神状态及被毛、排泄物状况。7 d后全部进行剖检,观察2组小鼠内脏是否出现病变,使用眼球采血法收集血液,存放于乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝管,进行血液学指标检测。

1.3 数据处理

试验数据用Excel 2019软件处理,GraphPad Prism 8.0.2作图,结果表示为平均值±标准差,P<0.05表示差异显著,P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 分离菌株的鉴定

2.1.1 形态学观察结果

分离菌株在LB琼脂培养基上划线培养后单菌落呈淡黄色圆形,表面湿润凸起(图1-A);显微镜观察显示该菌株为革兰氏阳性杆状细菌(图1-B)。
图1 分离菌株的形态

A:LB琼脂平板上的形态;B:革兰氏染色镜检图(1 000×)。

Fig.1 Morphology of isolated strains

A: morphology on LB agar plate; B: Gram staining microscopy image (1 000×).

2.1.2 生化鉴定结果

如表1所示,分离菌株的生化鉴定结果为V-P试验、柠檬酸盐、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、明胶液化、pH 5.7、7%氯化钠、淀粉水解呈阳性反应,丙酸盐、硝酸盐还原呈阴性反应,初步判断该分离菌株可能属于芽孢杆菌属。
表1 分离菌株的生化鉴定结果

Table 1 Biochemical identification result of isolated strain

项目Items 结果Results 项目Items 结果Results
V-P试验V-P test + 明胶液化Gelatin liquefaction +
柠檬酸盐Citrate + 7%氯化钠7% NaCl +
丙酸盐Propionate - pH 5.7生长pH 5.7 growth +
D-木糖D-xylose + 硝酸盐还原Nitrate reduction -
L-阿拉伯糖L-arabinose + 淀粉水解Starch hydrolysis +
D-甘露醇D-mannitol +

“+”表示阳性反应,“-”表示阴性反应。

“+” indicates positive reaction, and “-” indicates negative reaction.

2.1.3 16S rRNA基因序列分析

通过BLAST比对发现,分离菌株16S rRNA基因序列(图2)与已发布的巨大普里斯特氏菌(Priestia megaterium)ATCC菌株(NR 116873.1)的16S rRNA基因序列相似性较高,为99.7%。综合菌落形态、生化鉴定及16S rRNA测序分析结果,判定该分离菌株为巨大普里斯特氏菌,将其命名为巨大普里斯特氏菌YF9。下载BLAST比对结果中相似性较高的序列,用MEGA11.0.13软件进行核苷酸序列的比对,绘制系统发育进化树(图3)。
图2 分离菌株基因序列信息

Fig.2 Gene sequence information of isolated strain

图3 分离菌株和芽孢杆菌属关系进化树

Bacillus cereus:蜡样芽孢杆菌;Bacillus wiedmannii:威氏芽孢杆菌;Bacillus seohaeonensis:瑞源芽孢杆菌;Bacillus massiliigorillae:马赛大猩猩芽孢杆菌;Bacillus megaterium:巨大芽孢杆菌;Priestia megaterium:巨大普里斯特氏菌。

Fig.3 Evolutionary tree of relationship between isolated strain and Bacillus

2.2 巨大普里斯特氏菌YF9的体外益生潜力测定结果

2.2.1 耐酸、耐胆盐能力

如图4所示,巨大普里斯特氏菌YF9在pH为2、4、6的条件下相对存活率分别为9.16%、65.98%、83.77%;如图5所示,巨大普里斯特氏菌YF9在胆盐浓度为0.1%、0.2%、0.3%的条件下相对存活率分别为74.91%、59.95%、9.44%。
图4 巨大普里斯特氏菌YF9在不同pH处理后的相对存活率

Fig.4 Relative survival rate of Priestia megaterium YF9 after treatment at different pH

图5 巨大普里斯特氏菌YF9在不同胆盐浓度处理后的相对存活率

Fig.5 Relative survival rate of Priestia megaterium YF9 after treatment at different bile salt concentration

2.2.2 自聚集能力

如图6所示,巨大普里斯特氏菌YF9在4 h后的自聚集率为55.43%,24 h后高达91.76%,具有较高的自聚集能力。
图6 巨大普里斯特氏菌YF9的自聚集率

Fig.6 Self-aggregation rate of Priestia megaterium YF9

2.2.3 DPPH自由基清除能力

由表2可知,巨大普里斯特氏菌YF9具有较强的DPPH自由基清除能力,对DPPH自由基清除率达到了60.85%。
表2 巨大普里斯特氏菌YF9的DPPH自由基清除率

Table 2 DPPH free radical scavenging rate of Priestia megaterium YF9 %

菌株编号Strain number DPPH自由基清除率DPPH radical scavenging rate
YF9 60.85±1.98

2.2.4 药物敏感性

选取14种常用抗生素对巨大普里斯特氏菌YF9进行药物敏感性试验,测量菌株对抗生素药敏片的抑菌圈直径,并根据美国NCCLS文件的每种药敏片的判定标准得出对不同抗生素敏感性的结果,结果表明,巨大普里斯特氏菌YF9对红霉素和克林霉素表现出中介,对其余12种抗生素均表现出敏感性(表3)。
表3 巨大普里斯特氏菌YF9的药物敏感性试验结果

Table 3 Antibiotic susceptibility test results of Priestia megaterium YF9

抗生素名称
Antibiotics names		 每片含量
Content per
piece/μg		 判定标准:抑菌圈直径
Judgment standard: antibacterial ring diameter/mm		 敏感性
Susceptibility
R I S
青霉素Penicillin 10 ≤14 15~19 ≥20 S
氨苄西林Ampicillin 10 ≤13 14~16 ≥17 S
亚胺培南Imipenem 10 ≤19 20~22 ≥23 S
美罗培南Meropenem 10 ≤19 20~22 ≥23 S
丁胺卡那Amikacin 30 ≤13 14~16 ≥17 S
红霉素Erythromycin 15 ≤13 14~22 ≥23 I
庆大霉素Gentamicin 10 ≤12 13~14 ≥15 S
四环素Tetracycline 30 ≤14 15~18 ≥19 S
克林霉素Clindamycin 2 ≤13 14~17 ≥18 I
氯霉素Chloramphenicol 30 ≤12 13~17 ≥18 S
万古霉素Vancomycin 30 ≤8 9~12 ≥13 S
环丙沙星Ciprofloxacin 30 ≤15 16~20 ≥21 S
左氧氟沙星Levofloxacin 10 ≤15 16~18 ≥19 S
复方新诺明Cotrimoxazole 25 ≤16 17~19 ≥20 S

R:耐药;I:中介;S:敏感。

R: resistance; I: intermediate; S: sensitive.

2.2.5 溶血活性

如图7所示,巨大普里斯特氏菌YF9在血平板上生长良好,菌落周围无溶血环,表明其无溶血活性,更具安全性。
图7 巨大普里斯特氏菌YF9在血琼脂平板上的形态

A:巨大普里斯特氏菌YF9;B:金黄色葡萄球菌(阳性对照)。

Fig.7 Morphology of Priestia megaterium YF9 on blood agar plate

A: Priestia megaterium YF9; B: Staphylococcus aureus (positive control).

2.2.6 抑菌活性

如图8所示,巨大普里斯特氏菌YF9对沙门氏菌无抑制效果,但对金黄色葡萄球菌有较强的抑制效果,其抑菌圈直径为17.45 mm。
图8 巨大普里斯特氏菌YF9的抑菌效果

Fig.8 Bacteriostatic effect of Priestia megaterium YF9

2.3 巨大普里斯特氏菌YF9的安全性评价结果

2.3.1 体征观察及剖检结果

在动物安全性试验期间,2组小鼠菌没有发生死亡现象,形态未发生变化,被毛、分泌物及排泄物均无异常,剖检过程中脏器无出血现象,眼观无异常,见图9。
图9 灌胃巨大普里斯特氏菌YF9的小鼠体征及剖检观察

A:体征观察;B:对照组剖检观察;C:试验组剖检观察。

Fig.9 Observation on physical signs and autopsy of mice intragastric administration of Priestia megaterium YF9

A: observation of physical signs; B: autopsy observation of control group; C: autopsy observation of test group.

2.3.2 体重变化

由图10可知,2组小鼠的体重变化趋势一致,各时间体重无显著差异(P>0.05)
图10 灌胃巨大普里斯特氏菌YF9对小鼠体重的影响

Fig.10 Effects of gavage administration of Priestia megaterium YF9 on body weight of mice

2.3.3 血液学指标

从表4可以看出,2组小鼠血液学指标均无显著差异(P>0.05)。
表4 灌胃巨大普里斯特氏菌YF9对小鼠血液学指标的影响

Table 4 Effects of gavage of Priestia megaterium YF9 on hematological indicators of mice

项目Items 对照组Control group 试验组Test group P值P-value
白细胞数量WBC count/(×109个/L) 3.76±1.13 4.58±0.74 0.069
淋巴细胞数量LYM count/(×109个/L) 2.34±1.08 3.08±0.67 0.103
中性粒细胞数量GRA count/(×109个/L) 0.89±0.48 0.79±0.16 0.559
血红蛋白含量HGB content/(g/L) 134.41±10.38 134.38±14.76 0.996
红细胞数量RBC count/(×1012个/L) 7.92±0.58 7.90±0.72 0.952
血小板数量PLT count/(×109个/L) 912.29±411.88 741.89±223.74 0.270

3 讨论

3.1 巨大普里斯特氏菌YF9的体外益生潜力

本研究从野生黑鸢的新鲜粪便中分离得到1株具有芽孢杆菌属细菌特征的菌株,但经分子生物学鉴定,其与巨大普里斯特氏菌ATCC菌株(NR 116873.1)的16S rRNA基因序列相似性较高,达到了99.7%,因此确定此菌株为巨大普里斯特氏菌,该菌株在分类学上原属于芽孢杆菌属,曾用名巨大芽孢杆菌,2020年基于基因组学分析被重新归类至新建立的普里斯特氏菌属,更名为巨大普里斯特氏菌[4],由于其稳定性和非致病性,广泛用于人类食品工业和畜禽饲料添加剂[5]。本试验对从野生黑鸢新鲜粪便中分离出的巨大普里斯特氏菌YF9进行了体外益生潜力测定和体内安全性评价,目的是提供野生黑鸢源巨大普里斯特氏菌的益生潜力基本信息,进一步丰富我国野生动物源益生菌资源。
由于益生菌需要进入宿主体内发挥作用,所以候选菌株应当对胃酸和肠道胆盐环境有一定的耐受能力,动物胃液pH通常在3.0左右,小肠中的胆盐浓度通常在0.1%~0.3%[6]。本研究分离到的巨大普里斯特氏菌在pH为4时相对存活率为65.98%,在pH为6时相对存活率高达83.77%,在胆盐浓度为0.1%、0.2%条件下存活率分别为74.91%、59.95%。考虑到该菌株在pH为2以及在胆盐浓度为0.3%时存活率较低,故建议其作为益生菌时选择进食后3 h投喂,以避开胃酸和胆盐的“高峰攻击期”:一方面,进食后3 h胃内食物逐渐排空,胃酸浓度从空腹时的1.5~2.0逐渐升至4.0~5.0,酸性环境对益生菌破坏减弱;另一方面,进食后1~2 h为肝脏分泌胆汁高峰,小肠胆盐浓度达0.3%~0.5%,3 h后胆汁分泌减少,胆盐被消耗或重吸收,浓度降至0.1%~0.2%,对益生菌的损伤降低。
自聚集能力的测定是为了确保菌株可以在肠道中达到高细胞密度,从而通过在肠黏膜和上皮细胞上形成保护屏障来促进黏附机制,暂时定居肠道。益生菌相关研究中,贝莱斯芽孢杆菌SL在12 h后的自聚集率为86%[7],枯草芽孢杆菌YB1220在24 h后的自聚集率达到50.1%[8],传统发酵绿橄榄中分离的10株乳杆菌在5 h后的自聚集率在10%~41%[9],油橄榄中分离的1株乳酸菌在24 h后的自聚集率为88.5%[10]。本研究中,巨大普里斯特氏菌YF9在4 h后的自聚集率为55.43%,24 h后的自聚集率高达91.76%,具有较高的自聚集能力。
DPPH是一种非常稳定的自由基,其溶液呈深紫色,由于DPPH自由基清除能力测定的可行性和低成本性,经常用于评估食品中化学物质的抗氧化活性[11]。本研究中分离得到的巨大普里斯特氏菌YF9的DPPH自由基清除率为60.85%,说明其具有较强DPPH自由基清除能力。新型复合益生菌可以增强动物机体抗氧化能力[12],其抗氧化能力与其次级代谢产物有关[13],故推测巨大普里斯特氏菌YF9可能会产生某些代谢产物,增强其抗氧化能力。
由于益生菌的耐药基因可能会转移到某些病原体上,导致病原体耐药性提高[14],菌株药物敏感性是评估菌株安全性的重要指标。本研究选取14种常用抗生素对巨大普里斯特氏菌YF9进行药物敏感性测定,结果显示巨大普里斯特氏菌YF9对其中12种抗生素表现为敏感,仅对红霉素和克林霉素2种抗生素表现为中介,没有表现出耐药,表明其安全性较高。类似研究从细毛羊(非野生动物源)粪便中分离出了1株巨大普里斯特氏菌[15],对青霉素和克林霉素耐药。本试验中,野生黑鸢源巨大普里斯特氏菌YF9对青霉素敏感,对克林霉素表现为中介。本研究使用14种常见抗生素,发现巨大普里斯特氏菌YF9只对其中2种抗生素表现为中介,并无耐药表现,表明该菌株的耐药少,推测与菌株来源于野生动物有关,因为野生动物甚少使用抗生素。
候选益生菌有益生潜力的重要评估条件之一是不能具有溶血活性,本试验分离的巨大普里斯特氏菌YF9未出现溶血现象,证明该菌株较为安全,这一结果与大黄蜂源巨大普里斯特氏菌[5]和羊源巨大芽孢杆菌[15]无溶血活性的结果一致。此外,抑菌试验结果显示野生黑鸢源巨大普里斯特氏菌YF9对金黄色葡萄球菌有较好的抑制能力。

3.2 巨大普里斯特氏菌YF9的体内安全性

候选益生菌株在投入生产前需要确定其安全性,急性口服毒性试验是评价益生菌是否安全的最基本的试验[16]。王楠等[17]通过给小鼠口服2株人源益生链球菌进行急性毒性试验,发现小鼠生理状态正常,未发现死亡和急性中毒体征,解剖后各内脏器官均无异常,各试验组脏器指数与对照组无统计学差异,证明其无急性毒性作用,具有良好的安全性。在本研究中,通过急性毒性试验评估野生黑鸢源巨大普里斯特氏菌YF9的安全性,试验期间对照组和试验组小鼠并没有任何死亡现象,且小鼠形态、被毛、分泌物及排泄物均无异常,剖检过程中脏器无出血现象,无眼观异常;通过统计学方法分析差异性,结果表明,在急性毒性试验期间,对照组和试验组的体重变化和血液学指标并没有显著差异。综上所述,本研究分离得到的野生黑鸢源巨大普里斯特氏菌YF9对小鼠无毒副作用,是安全的。

4 结论

本试验从野生黑鸢粪便中分离出的巨大普里斯特氏菌YF9表现出良好的体外益生潜力和体内安全性,对金黄色葡萄球菌有较强的抑制效果,对多种抗生素敏感,可作为动物益生菌制剂的候选菌株。

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