动物营养学报 >

2025 , Vol. 37 >Issue 9: 6393 - 6406

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.519

研究论文

不同添加剂对天然牧草青贮品质、微生物多样性及体外发酵特性的影响

  • 姜塽 , 1 ,
  • 关曾根 1 ,
  • 田晨 1 ,
  • 纪守坤 1 ,
  • 王云玲 1 ,
  • 刘建 1 ,
  • 高明 1 ,
  • 王雅雅 2 ,
  • 韩旭 3 ,
  • 刘计双 4 ,
  • 高立杰 , 1, *
展开
  • 1 河北农业大学动物科技学院,保定 071001
  • 2 河北农业大学机电工程学院,保定 071001
  • 3 承德鱼儿山承垦农业发展有限公司,承德 068363
  • 4 承德市畜牧工作站,承德 067065
* 高立杰,教授,硕士生导师,E-mail:

姜 塽(1999—),女,河北承德人,硕士研究生,动物营养与饲料科学专业。E-mail:

Office editor: 陈鑫

收稿日期: 2025-01-27

  网络出版日期: 2025-09-12

基金资助

河北省重点研发计划项目“坝上草畜耦合修复退化草地生态技术模式研究(22327508D)”

河北省草产业技术体系饲草资源开发岗创新团队项目(HBCT2023160202)

收起

Effects of Different Additives on Silage Quality, Microbial Diversity and in Vitro Fermentation Characteristics of Natural Pasture

  • JIANG Shuang , 1 ,
  • GUAN Zenggen 1 ,
  • TIAN Chen 1 ,
  • JI Shoukun 1 ,
  • WANG Yunling 1 ,
  • LIU Jian 1 ,
  • mGAO Ming 1 ,
  • WANG Yaya 2 ,
  • HAN Xu 3 ,
  • LIU Jishuang 4 ,
  • GAO Lijie , 1, *
Expand
  • 1 College of Animal Science and Technology, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, China
  • 2 College of Mechanical and Electrical Engineering, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, China
  • 3 Chengde Yuershan Chengken Agricultural Development Co., Ltd., Chengde 068363, China
  • 4 Chengde Animal Husbandry Workstation, Chengde 067065, China
* professor, E-mail:

Received date: 2025-01-27

  Online published: 2025-09-12

Fold

摘要

本试验旨在研究不同添加剂对天然牧草青贮营养品质、发酵品质、微生物多样性、体外发酵参数及营养物质消化率的影响。试验以天然牧草作为青贮原料,采用单因素随机区组设计,设置6个组,即对照组(CK组,无添加)、甲酸(FA)组(添加6 mL/kg FA)、纤维素酶(CE)组(添加0.2 g/kg CE)、绿汁发酵液(FGJ)组(添加2 mL/kg FGJ)、黄芪多糖(APS)组(添加0.5% APS)、APS+FGJ(H)组(添加0.5% APS和2 mL/kg FGJ),每组5个重复,青贮60 d后对青贮饲料的营养品质、发酵品质、微生物多样性、体外发酵参数及营养物质消化率进行分析,采用隶属函数法进行综合评价。结果表明:1)与CK组相比,各组干物质(DM)和粗蛋白质(CP)含量均显著提高(P<0.05),丙酸(PA)含量显著降低(P<0.05);H组乳酸(LA)含量显著提高(P<0.05),pH、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量显著降低(P<0.05)。2)各组优势菌门均为厚壁菌门;与CK组相比,FGJ组和H组片球菌属相对丰度较高,分别为53.03%和41.95%。3)与CK组相比,各组体外发酵48 h后均可显著提高青贮饲料的体外干物质消化率(IVDMD)、体外中性洗涤纤维消化率(IVNDFD)和总挥发性脂肪酸(TVFA)含量(P<0.05),显著降低瘤胃液中氨态氮(NH3-N)含量(P<0.05),其中H组IVDMD和IVNDFD最高;除FA组外,其他组乙酸/丙酸(AA/PA)显著降低(P<0.05)。4)隶属函综合评价结果显示,H组隶属函数值最高,为0.75。综上所述,5种添加剂均可提高天然牧草青贮饲料的营养品质、发酵品质、微生物多样性、体外发酵参数及营养物质消化率,其中以混合添加APS和FGJ对天然牧草青贮效果最好。

关键词： 牧草青贮; 添加剂; 微生物多样性; 体外发酵

本文引用格式

姜塽 , 关曾根 , 田晨 , 纪守坤 , 王云玲 , 刘建 , 高明 , 王雅雅 , 韩旭 , 刘计双 , 高立杰 . 不同添加剂对天然牧草青贮品质、微生物多样性及体外发酵特性的影响[J]. 动物营养学报, 2025 , 37(9) : 6393 -6406 . DOI: 10.12418/CJAN2025.519

Abstract

This experiment aimed to investigate the effects of different additives on nutritional quality, fermentation quality, microbial diversity, in vitro fermentation parameters, and nutrient digestibility of natural pasture silage. The experiment used natural grass as ensiling material, using single factor randomized block design, set up 6 groups, namely control group (CK group, no addition), formic acid (FA) group (6 mL/kg FA), cellulase (CE) group (0.2 g/kg CE), fermented green juice (FGJ) group (2 mL/kg FGJ), Astragalus polysaccharide (APS) group (0.5% APS), APS+FGJ (H) group (0.5% APS and 2 mL/kg FGJ), five replicates in each group. After 60 days of silage, the nutritional quality, fermentation quality, microbial diversity, in vitro fermentation parameters and nutrient digestibility of silage were analyzed, and the membership function method was used for comprehensive evaluation. The results showed as follows: 1) compared with CK group, dry matter (DM) and crude protein (CP) contents in each group significantly increased (P<0.05) while reducing propanoic acid (PA) content (P<0.05); the lactic acid (LA) content in H group significantly increased (P<0.05) and pH, neutral detergent fiber (NDF), and acid detergent fiber (ADF) contents significantly decreased (P<0.05). 2) Firmicutes was the dominant phylum in all groups. Compared with CK group, the relative abundance of Pediococcus in FGJ and H groups was higher, which was 53.03% and 41.95%, respectively. 3) After 48 h of in vitro fermentation, in vitro dry matter digestibility (IVDMD), in vitro NDF digestibility (IVNDFD), and total volatile fatty acid (TVFA) content in each group significantly increased (P<0.05), while reducing NH3-N content in rumen fluid (P<0.05). The H group achieved the highest IVDMD and IVNDFD. Except for FA, all groups significantly decreased the acetic acid/propionic acid (AA/PA) (P<0.05). 4) The subordinate function evaluation ranked the highest in H group, with a score of 0.75. In conclusion, all five additives improve the nutritional quality, fermentation quality, microbial diversity, in vitro fermentation parameters, and nutrient digestibility of natural pasture silage. The combined application of APS and FGJ has the optimal ensiling performance.

Key words： forage silage; additives; microbial diversity; in vitro fermentation

草原与畜牧业的发展息息相关,合理高效地利用天然牧草,可以解决饲草短缺的问题,为畜牧业的快速发展提供物质基础。在草原牧区,天然牧草主要利用方式是放牧和刈割,刈割后的牧草可用于调制成干草,而这种传统的保存方式导致营养物质损耗占30%以上,造成浪费[1]。利用青贮加工技术可以有效提高牧草营养成分的保存率,然而天然牧草具有较高的缓冲能值、较低的可溶性碳水化合物(WSC)含量及乳酸菌附着量,青贮过程中pH较难下降,导致有害微生物生长繁殖,影响青贮品质[2]。
添加青贮添加剂是改善饲料青贮品质的重要方法,不同类型添加剂对青贮饲料品质具有不同作用。甲酸(FA)、纤维素酶(CE)以及绿汁发酵液(FGJ)是常用的青贮添加剂。其中,FA作为发酵抑制型添加剂可以有效地减少牧草在青贮发酵过程中产生腐败菌等不良微生物,同时显著降低氨态氮(NH3-N)含量,提高了青贮饲料的品质[3-4]。冯启贤等[5]和于浩然等[6]研究发现,添加6 mL/kg FA可以显著提高紫花苜蓿青贮后干物质(DM)和粗蛋白质(CP)含量,提高青贮饲料营养品质,减少营养物质的流失。另外,CE可以降低青贮饲料中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)的含量,也可以将牧草中的纤维素生成葡萄糖和麦芽糖,从而为乳酸菌提供发酵底物[7]。刘逸超等[8]研究发现,添加0.2 g/kg CE对天然牧草青贮的营养品质和发酵品质均有不同程度的提高,并能增加乳酸菌的数量。何国琼等[9]研究发现,添加CE除了可以调整青贮饲料的感官评价,还具有改善青贮效果、提高发酵品质的作用。作为有乳酸发酵“启动因子”之称的FGJ[10],可提高青贮饲料中乳酸(LA)含量,降低青贮饲料pH,改善青贮发酵效果[11]。宋鸽等[12]和张诗等[13]研究发现,添加2 mL/kg的FGJ可以提高WSC含量及DM回收率,减少营养物质的损耗,明显改善青贮饲料品质,提高饲料利用价值。黄芪多糖(APS)是一种天然有机多糖,由葡萄糖、果糖等糖类单体组成,可通过酶解作用释放葡萄糖等单糖,为青贮饲料中乳酸菌发酵提供底物,促进同型乳酸发酵,降低pH,抑制不良微生物的生长[14]。朱新术等[15]研究,发酵黄芪与优良乳酸菌相互作用发现黄芪药液能促进乳酸菌的增殖,提高菌体浓度。詹佳琦等[16]研究,黄芪等中药渣青贮时,发现不同添加处理均对青贮品质有影响,证实APS在青贮中有潜在的应用价值。
目前这些青贮添加剂主要应用于紫花苜蓿、秸秆、稻草等植物上,在天然牧草上研究较少。基于此,本试验将FA、CE、APS以及FGJ作为青贮添加剂,探究其对河北丰宁坝上草甸草原的天然牧草青贮品质的影响。通过分析不同添加剂对天然牧草青贮品质、微生物多样性及体外发酵特性的影响,综合评价各添加剂对天然牧草的青贮效果。以此来提高牧草利用率,改进牧草贮藏方式,缓解草原牧区春冬季节饲草供应不足问题,为河北丰宁坝上地区草甸草原天然牧草青贮饲料的发展提供一定的理论和技术指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用草甸草原的天然牧草取自河北省承德市丰宁坝上北庙牧场(东经:115°55'48.4″;北纬:41°38'23.8″;海拔高度:1 465.5 m),选择植被分布均匀的草地作为样品采集地,采用1 m×1 m的样方框随机抛选取样,收集样方框内所有牧草。样地的植物总盖度为86%,详见表1。
表1 样地植被组成情况

Table 1 Vegetation composition of sample plots

编号
Number		 种名
Species name		 种拉丁文名
Latin species name		 科名
Family name		 盖度
Coverage/%		 比例
Proportion/%
1 赖草 Leymus secalinus (Georgi) Tzvel. 禾本科 14 10
2 垂穗披碱草 Elymus nutans Griseb. 禾本科 50 15
3 硬质早熟禾 Poasphondylodes Trin. 禾本科 20 13
4 糙隐子草 Cleistogenes squarrosa (Trin.) Keng 禾本科 25 10
5 针茅 Stipa capillata L. 禾本科 24 11
6 扁穗冰草 Agropyron cristatum (L.) Gaertn. 禾本科 9 7
7 冷蒿 Artemisia frigida Willd. 菊科 43 4
8 艾蒿 Artemisia argyi H. Lév.&Vaniot 菊科 10 2
9 阿尔泰狗娃花 Heteropappus altaicus (Willd.) Novopokr. 菊科 10 5
10 蒙古蒿 Artemisia mongolica Nakai 菊科 16 2
11 朝天委陵菜 Potentilla supina L. 蔷薇科 24 8
12 细叶委陵菜 Potentilla multifida L. 蔷薇科 12 3
13 苔草 Carex callitrichos V.Krecz 莎草科 29 10
试验添加剂:FA(实验室用分析纯试剂,纯度>99%)、CE(酶活性为10 000 U/g)、APS(水提法,有效成分APS含量>70%,水分含量<12%,甲苷含量0.2%,毛蕊异黄酮含量0.05%)和FGJ(实验室厌氧发酵,微生物组成见表2)。
表2 绿汁发酵液的微生物组成

Table 2 Microbial composition of fermented green juice

门
Phylum		 属
Genus		 种
Species		 相对丰度
Relative abundance/
%
厚壁菌门Firmicutes 乳球菌属Lactococcus 格氏乳球菌Lactococcus garvieae 40.60
变形菌门Proteobacteria 泛菌属Pantoea 成团泛菌Pantoea agglomerans 9.58
变形菌门Proteobacteria 克雷伯氏菌属Klebsiella 产气克雷伯菌Klebsiella aerogenes 6.34
变形菌门Proteobacteria 克雷伯氏菌属Klebsiella 肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae 3.81
变形菌门Proteobacteria 预研菌属Yokenella 预研菌属_雷根斯堡预研菌Yokenella regensburgei 3.18
FGJ的制备:参照吴璞[17]的方法称取天然牧草200 g,添加400 mL蒸馏水用破壁机打浆,过滤,在滤液中添加2 g葡萄糖,充分溶解后定容至1 000 mL,置于30 ℃恒温水浴锅中厌氧发酵48 h,备用。

1.2 试验设计

试验采用单因素随机区组设计,设置6个组,即对照组(CK组,无添加)、FA组(添加6 mL/kg FA)、CE组(添加0.2 g/kg CE)、FGJ组(添加2 mL/kg FGJ)、APS组(添加0.5% APS)、H组(添加0.5% APS和2 mL/kg FGJ)。将添加剂均匀洒入经切段至2~3 cm的天然牧草中,CK组喷洒等量的无菌水,混合均匀后装入聚乙烯袋中,每袋300 g,使用真空包装机真空密封,每组5次重复。室温条件下青贮60 d后开袋,检测各项指标。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 营养品质测定

采用四分法缩分200 g样品,65 ℃下烘干至恒重,粉碎,过20目(0.850 mm)、40目(0.425 mm)筛,干燥密封保存。按照GB/T 6435—2006的方法[18]测定DM含量;按照范氏洗涤纤维法[19]测定NDF和ADF含量;按照蒽酮-硫酸法[20]测定WSC含量;按照GB/T 6432—2018的凯氏定氮法[21]测定CP和总氮(TN)含量;按照GB/T 6433—2006的索氏提取法[22]测定粗脂肪(EE)含量。

1.3.2 发酵品质测定

各组取青贮样品20 g,按1∶9料液比加入180 mL蒸馏水,充分混合后放入4 ℃冰箱中浸提48 h,4层纱布过滤获得滤液。用pH计(奥豪斯AB-23,美国)测定pH;使用苯酚-次氯酸钠比色法[23]测定NH3-N含量,并计算NH3-N/TN;用高效液相仪(CT0-10AS,日本岛津公司)[24]测定挥发性脂肪酸(VFA)含量。

1.3.3 微生物多样性检测

各组取青贮样品装入5 mL无菌冻存管中,于-80 ℃保存备测。采用天根动植物组织DNA提取试剂盒[DP302-02,天根生化科技(北京)有限公司]提取青贮饲料中的细菌DNA,引物为341F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)和805R(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’),通过聚合酶链式反应(PCR)扩增细菌rRNA基因的V3~V4区域[25]。PCR扩增、产物纯化、文库制备与质检、上机测序、微生物群落组成、α和β多样性的计算及序列比对等均由杭州联川生物技术股份有限公司完成。

1.3.4 体外发酵试验

选取3只体况相近、健康状况良好、装有永久瘤胃瘘管的成年小尾寒羊作为瘤胃液供体。晨饲前采集瘤胃液,4层无菌纱布过滤,将缓冲液和瘤胃液按体积比2∶1充分混合。参考Menke等[26]的方法配制缓冲液,并置于39 ℃恒温水浴锅中备用。准确称取9 g样品,置于发酵袋中,加入300 mL人工瘤胃缓冲液,排空气体后迅速使用橡胶塞塞紧密封。将发酵袋放入试验前备好的恒温水浴摇床中,保持温度在39 ℃。待48 h发酵结束后,迅速将发酵袋置于冰水浴中终止发酵。立即测定pH,收集剩余样品。测定NH3-N、VFA、DM及NDF含量,按以下公式计算营养物质降解率[27]:
某营养物质降解率(%)=100×(X-Y)/X。
式中:X为该营养物质含量(g);Y为发酵48 h后剩余底物该营养物质含量(g)。

1.4 隶属函数综合评价

采用隶属函数法对天然牧草青贮品质和体外营养物质消化率进行综合评价[28],正向指标包括CP、WSC、EE、LA含量及IVDMD、IVNDFD,负向指标包括pH、NH3-N/TN及NDF、ADF、乙酸(AA)、丙酸(PA)含量,各隶属度求和后将总隶属度排序,得出最佳处理(综合评价高以总隶属度高为标准)。计算公式如下:
UX(+)=(Xij-Ximin)/(Ximax-Ximin);
UX(-)=1-UX(+)。
式中:UX(+)为各指标呈正相关隶属函数值;UX(-)为各指标呈负相关隶属函数值;Xij为某样品某指标平均测定值;Ximax为某样品某指标最大测定值;Ximin为某样品某指标最小测定值。

1.5 数据统计分析

试验数据使用Excel 2016软件进行初步整理,使用SPSS 23.0统计软件对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA),Duncan氏法进行多重比较,结果以“平均值±标准差”表示,P>0.05表示差异不显著,P<0.05表示差异显著。微生物数据使用联川生物OmicStudio云平台(https://www.omicstudio.cn/tool.)和Adobe Illustrator 2023绘图软件分析制图。

2 结果与分析

2.1 天然牧草的原料特性

由表3可知,天然牧草以鲜重计算DM为50.18%;以干重计算,天然牧草CP含量为10.42%,NDF含量为58.57%,ADF含量为42.33%,EE含量为4.73%,WSC含量为4.79%。
表3 天然牧草营养成分

Table 3 Nutritional composition of natural pasture

项目
Item		 干物质
DM/% FM		 粗蛋白质
CP/% DM		 中性洗涤纤维
NDF/% DM		 酸性洗涤纤维
ADF/% DM		 粗脂肪
EE/% DM		 可溶性碳水化合物
WSC/% DM
含量Content 50.18±0.33 10.42±0.44 58.57±0.66 42.33±0.51 4.73±0.26 4.79±0.29

2.2 不同添加剂对天然牧草青贮饲料营养品质的影响

由表4可知,与CK组比,各添加组DM含量显著增加(P<0.05),其中FA组显著高于CE组、APS组和FGJ组(P<0.05);各添加组CP含量显著增加(P<0.05),其中FGJ组最高;各添加组NDF和ADF含量均低于CK组,其中H组NDF和ADF含量显著降低(P<0.05);各添加组EE、WSC含量均增加,但差异不显著(P>0.05)。
表4 不同添加剂对天然牧草青贮营养品质的影响

Table 4 Effects of different additives on nutritional quality of natural pasture silage

项目
Items		 干物质
DM/% FM		 粗蛋白质
CP/% DM		 中性洗涤纤维
NDF/% DM		 酸性洗涤纤维
ADF/% DM		 粗脂肪
EE/% DM		 可溶性碳水化合物
WSC/% DM
组别Groups
CK 35.77±0.79c 13.62±0.47d 54.61±2.34a 33.19±1.67a 4.59±0.15 2.37±0.14
FA 40.93±0.82a 14.75±0.37ab 52.98±0.87ab 32.92±0.68a 4.79±0.50 3.17±0.68
CE 38.65±0.59b 14.56±0.10bc 51.10±1.65bc 32.39±1.28a 5.06±0.23 3.41±0.88
APS 39.30±1.39b 15.02±0.25ab 49.79±1.22c 32.05±1.63a 5.66±1.08 2.66±0.52
FGJ 39.04±0.24b 15.16±0.42a 51.93±1.94b 32.49±0.92a 5.31±0.37 2.91±0.88
H 39.55±0.67ab 14.23±0.53c 51.59±1.52bc 30.44±0.95b 5.34±0.87 3.48±1.18
P值P-value <0.001 <0.001 <0.001 0.011 0.380 0.491

同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同小写字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。表5至表8同。

In the same column, values with different lowercase letter superscripts indicated significant difference (P<0.05), while with the same lowercase letter or no letter superscripts indicated no significant difference (P>0.05). The same as Table 5 to Table 8.

2.3 不同添加剂对天然牧草青贮饲料发酵品质的影响

由表5可知,与CK组相比,各添加组pH均降低,其中FA组、APS组、FGJ组和H组均显著降低(P<0.05);各添加组NH3-N/TN、PA含量均显著下降(P<0.05);除FA组外,各添加组LA含量均显著提高(P<0.05),其中H组最高;FA组LA和AA含量显著降低(P<0.05);各组均未检测出丁酸(BA)。
表5 不同添加剂对天然牧草青贮发酵品质的影响

Table 5 Effects of different additives on fermentation quality of natural pasture silage

项目
Items		 pH 氨态氮/总氮
NH3-N/TN/%		 乳酸
LA/% DM		 乙酸
AA/% DM		 丙酸
PA/% DM		 丁酸
BA/% DM
组别Groups
CK 4.60±0.10a 5.05±0.26a 2.60±0.05c 0.89±0.12a 0.27±0.11a ND
FA 3.90±0.10d 1.83±0.55d 1.36±0.03d 0.53±0.02b 0.04±0.00b ND
CE 4.43±0.06ab 3.84±0.19b 3.52±0.42b 0.86±0.14a 0.05±0.01b ND
APS 4.30±0.00bc 2.87±0.28c 3.73±0.17b 0.88±0.16a 0.04±0.03b ND
FGJ 4.03±0.31cd 2.74±0.10c 3.95±0.26ab 0.90±0.02a 0.04±0.01b ND
H 4.23±0.15bc 2.43±0.09c 4.38±0.37a 0.84±0.04a 0.09±0.04b ND
P值P-value 0.001 <0.001 <0.001 0.005 <0.001

ND表示未检测到。

ND mean not detected.

2.4 不同添加剂对天然牧草青贮饲料微生物多样性的影响

2.4.1 不同添加剂对天然牧草青贮饲料微生物α多样性分析的影响

由表6可知,与CK组相比,各添加组Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数和ACE指数均差异不显著(P>0.05)。各组覆盖率指数均为1,说明测序数据量足够大,可以反映样品中绝大多数的微生物信息,代表了样品微生物群落的真实情况。
表6 不同添加剂对天然牧草青贮微生物α多样性分析

Table 6 Analysis of microbial α diversity in natural pasture grass silage with different additives

项目
Items		 Shannon指数
Shannon index		 Simpson指数
Simpson index		 Chao1指数
Chao1 index		 ACE指数
ACE index		 覆盖率指数
Coverage index
组别Groups
CK 4.36±0.94 0.85±0.10 397.72±122.21 399.58±123.65 1.00±0.00
FA 4.36±1.24 0.82±0.14 503.59±67.68 506.24±67.60 1.00±0.00
CE 4.78±0.46 0.89±0.06 498.64±22.60 501.84±22.58 1.00±0.00
APS 4.53±0.58 0.85±0.08 491.04±44.39 494.35±43.83 1.00±0.00
FGJ 3.88±0.56 0.77±0.08 414.20±69.17 416.73±68.69 1.00±0.00
H 3.98±0.75 0.80±0.075 420.51±72.72 423.61±72.57 1.00±0.00
P值P-value 0.506 0.415 0.089 0.087

2.4.2 不同添加剂对天然牧草青贮饲料微生物β多样性分析的影响

由图1可知,本试验中,各组样品点相对集中,说明各组微生物的群落相似度较高;第1主成分对各样品的贡献率达44.54%,第2主成分对各样品的贡献率达16.53%,合计达61.07%。
图1 天然牧草青贮饲料的PCA图

Fig.1 PCA plot of natural pasture silage

2.4.3 不同添加剂对天然牧草青贮门水平上微生物群落组成的影响

由图2可知,在门水平上,各组优势菌门均为厚壁菌门,相对丰度分别为79.86%、51.20%、86.10%、87.70%、88.87%、81.51%。FA组厚壁菌门相对丰度低于其他组,蓝藻菌门相对丰度高于其他组。
图2 天然牧草青贮微生物菌群在门水平上的相对丰度

Fig.2 Relative abundance of natural pasture silage microbial flora at phylum level

2.4.4 不同添加剂对天然牧草青贮属水平上微生物群落组成的影响

由图3可知,在属水平上,各组片球菌属、果实乳杆菌属和乳酸杆菌属占据优势地位,CK组、FA组、CE组、APS组、FGJ组、H组3种菌属相对丰度依次为58%、33.2%、67.68%、69.34%、57.01%、53.55%;FGJ组和H组片球菌属相对丰度较高,分别为53.03%和41.95%,FA组片球菌属相对丰度最低,为2.09%。
图3 天然牧草青贮饲料微生物菌群在属水平上的相对丰度

Fig.3 Relative abundance of natural pasture silage microbial flora at genus level

2.5 不同添加剂对天然牧草青贮体外发酵特性的影响

2.5.1 不同添加剂对天然牧草青贮体外发酵参数和营养物质消化率的影响

由表7可知,各组瘤胃pH无显著差异(P>0.05)。与CK组相比,添加FA、CE、APS和FGJ均可显著提高牧草青贮IVDMD和IVNDFD(P<0.05),显著降低瘤胃液NH3-N含量(P<0.05)。
表7 不同添加剂对天然牧草体外发酵参数和营养物质消化率的影响

Table 7 Effects of different additives on in vitro fermentation parameters and nutrient digestibility of natural pasture

项目
Items		 pH 氨态氮
NH3-N/(mg/dL)		 体外干物质消化率
IVDMD/%		 体外中性洗涤纤维消化率
IVNDFD/%
组别Groups
CK 6.45±0.09 9.28±0.38a 47.96±0.43d 31.25±0.52c
FA 6.38±0.18 6.50±0.57d 51.01±0.34c 33.45±0.46b
CE 6.43±0.04 8.43±0.52b 52.75±0.68ab 34.15±0.23b
APS 6.47±0.13 7.27±0.27c 51.94±0.46bc 35.78±0.99a
FGJ 6.40±0.13 7.14±0.25cd 52.78±0.71ab 35.27±0.48a
H 6.38±0.03 7.57±0.12c 53.41±1.08a 36.35±0.74a
P值P-value 0.896 <0.001 <0.001 <0.001

2.5.2 不同添加剂对天然牧草青贮体外发酵VFA含量的影响

由表8可知,与CK组相比,FA组AA和总挥发性脂肪酸(TVFA)含量显著升高(P<0.05);CE组、FGJ组及H组AA、PA、BA及TVFA含量显著升高(P<0.05),AA/PA显著降低(P<0.05);APS组PA及TVFA含量显著升高(P<0.05),AA/PA显著降低(P<0.05)。
表8 不同添加剂对天然牧草青贮体外发酵挥发性脂肪酸含量的影响

Table 8 Effects of different additives on volatile fatty acid contents in in vitro fermentation of natural pasture silage

项目
Items		 乙酸
AA/(mmol/L)		 丙酸
PA/(mmol/L)		 丁酸
BA/(mmol/L)		 乙酸/丙酸
AA/PA		 总挥发酸
TVFA/(mmol/L)
组别Groups
CK 39.70±0.04d 10.44±0.30c 4.05±0.57b 3.81±0.11a 54.19±0.54d
FA 40.58±0.45bc 10.71±0.15c 4.37±0.40b 3.79±0.03a 55.67±0.35c
CE 42.15±0.14a 13.69±0.30a 5.17±0.44a 3.08±0.06c 61.01±0.64ab
APS 40.15±0.09cd 11.16±0.14b 4.31±0.15b 3.60±0.04b 55.63±0.29c
FGJ 42.16±0.55a 13.88±0.15a 5.79±0.26a 3.04±0.02c 61.82±0.93a
H 41.11±0.15b 13.69±0.14a 5.80±0.38a 3.00±0.02c 60.61±0.44b
P值P-value <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

2.6 不同添加剂对天然牧草青贮效果综合评价

由表9可知,将各组具有差异性的12个指标进行隶属函数分析,其中正向指标包括CP、WSC、EE、LA含量及IVDMD、IVNDFD,负向指标包括pH、NH3-N/TN及NDF、ADF、AA、PA含量。平均12项指标的隶属函数值进行综合价值的排序,平均值越大综合价值越高,各组综合排序为:H组(0.75)>APS组(0.68)>FGJ组(0.67)>FA组(0.59)>CE组(0.57)>CK组(0.04)。综合评价12项指标,H组青贮效果最佳。
表9 不同添加剂对天然牧草青贮效果的隶属函数综合评价

Table 9 Comprehensive evaluation of membership function of different additives on effect of natural pasture silage

项目
Items		 组别Groups
CK FA CE APS FGJ H
粗蛋白质CP 0.00 0.73 0.61 0.91 1.00 0.40
粗脂肪EE 0.00 0.19 0.44 1.00 0.67 0.70
可溶性碳水化合物WSC 0.00 0.72 0.94 0.26 0.49 1.00
乳酸LA 0.41 0.00 0.72 0.78 0.86 1.00
体外干物质消化率IVDMD 0.00 0.56 0.88 0.73 0.88 1.00
体外中性洗涤纤维消化率IVNDFD 0.00 0.43 0.57 0.89 0.79 1.00
pH 0.00 1.00 0.24 0.43 0.81 0.53
氨态氮/总氮NH3-N/TN 0.00 1.00 0.38 0.68 0.72 0.81
乙酸AA 0.03 1.00 0.11 0.05 0.00 0.16
丙酸PA 0.00 1.00 0.96 1.00 1.00 0.78
中性洗涤纤维NDF 0.00 0.34 0.73 1.00 0.56 0.63
酸性洗涤纤维ADF 0.00 0.10 0.29 0.41 0.25 1.00
平均值Average value 0.04 0.59 0.57 0.68 0.67 0.75
排序Rank 6 4 5 2 3 1

3 讨论

3.1 不同添加剂对天然牧草青贮饲料青贮品质的影响

3.1.1 添加FA对天然牧草青贮品质的影响

FA是一种具有很强还原能力的发酵抑制型添加剂,在牧草青贮中起到防腐剂的作用。本试验中,FA组pH最低,表明FA可以迅使青贮环境变成酸性环境,这与于浩然等[6]、曹欣等[29]的结果相似。FA组降低了NH3-N、LA、AA、PA含量,与刘庭玉等[30]研究天然牧草青贮中FA促进LA积累的结论存在差异。这可能是青贮前期FA含量较高,导致青贮初期pH迅速下降,抑制了乳酸菌的生长繁殖,这与Randby[31]关于FA对红三叶、牛尾草和猫尾草混合青贮抑制LA发酵的研究结论相似。
青贮饲料的营养价值通常通过CP、ADF、NDF、WSC、EE、DM等主要指标进行评定。本试验中,FA组DM、CP、WSC含量显著提高,EE含量也有所提升,这与侯鑫狄等[32]研究典型草原牧草青贮FA添加剂部分结果一致,表明FA可以抑制微生物的生长,减弱植物的呼吸作用[33],降低营养物质的流失。ADF、NDF含量降低,可能是因为FA抑制植物酶活性,减少植物细胞壁降解,表明适量的FA有助于天然牧草青贮饲料纤维降解,保障了青贮饲料的营养品质。

3.1.2 添加CE对天然牧草青贮品质的影响

CE可将植物细胞壁中的纤维素和半纤维素分解成糖类物质,为乳酸菌提供充足底物,进而促进LA发酵,CE组LA含量显著提高,降低了NDF的含量,这与王伟等[34]在苜蓿青贮中的研究结论相吻合。NH3-N反映了微生物降解蛋白质的程度,含量越低,青贮饲料品质越好,CE组NH3-N/TN显著降低,表明CE可以抑制天然牧草青贮饲料有害菌生长,减少WSC消耗,这与王玉荣[35]在稻秸青贮和何玮等[36]在杂交狼尾草青贮中的研究结果一致。魏杰[37]利用CE调制燕麦草青贮证明可有效减少DM损耗提高发酵品质,这与本试验结果一致。微生物发酵过程中可产生细菌蛋白,从而使青贮饲料CP含量增加,本试验发现,添加CE可显著提高CP含量,与刘逸超等[8]在天然牧草青贮饲料中添加CE结果一致,证明使用CE可以有效保存青贮饲料的营养物质。

3.1.3 FGJ、APS及二者混合添加对天然牧草青贮品质的影响

FGJ中含有丰富的乳酸菌,可以提高青贮饲料中乳酸菌数量,促进LA发酵,确保乳酸菌是青贮发酵过程中的优势菌,减少有害微生物对营养物质的消耗,提高青贮饲料质量。APS主要由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖和鼠李糖等组成[38],可以为青贮发酵过程中乳酸菌的生长繁殖提供充足的底物,促进发酵进程。本试验中,单独或者混合添加APS和FGJ,均可以显著提高LA、DM和CP含量,显著降低pH、NH3-N/TN和NDF含量,有效地改善了青贮饲料品质。单独添加FGJ时,青贮饲料中CP含量得到了更好的保存,有研究表明,乳酸菌发酵使青贮饲料pH降低,抑制有害微生物的生长,从而减少CP等营养物质的损耗,因此,优质的青贮在LA含量较高的同时CP含量也高[39];这可能是FGJ组CP含量高于其他组的原因。单独添加APS时,可增加天然牧草青贮饲料CP含量,降低pH、NDF和ADF含量,这可能是由于APS可为LA发酵提供底物,促进菌体蛋白合成,从而提高饲料CP含量;NDF和ADF含量下降可能是APS抑制纤维分解菌的增殖,延缓纤维降解。杨富裕等[40]利用黄芪提取物调制豆科牧草青贮饲料的研究与本试验结果一致。张诗等[13]研究发现,混合添加葡萄糖和FGJ对混合青贮发酵效果优于单独添加。本试验中,混合添加APS和FGJ时,青贮饲料的LA含量最高,这可能是由于APS为乳酸菌发酵提供了碳源,促进其增殖,FGJ的加入加快了乳酸菌发酵进程,LA含量增加。因此,混合添加APS和FGJ对天然牧草青贮效果更好。

3.2 不同添加剂对天然牧草青贮饲料微生物多样性的影响

青贮发酵是一个复杂的微生物动态变化过程,利用乳酸菌产生LA,抑制霉菌、梭菌等有害菌的生长,影响青贮发酵品质。本试验通过16S rDNA扩增子测序技术,对不同添加剂处理的天然牧草青贮饲料上附着的微生物物种丰度和群落组成进行分析,探索天然牧草青贮饲料微生物多样性。试验中,各组青贮饲料覆盖率指数均为1,说明测序数据量足够大能代表样品中微生物的真实情况。王启芝等[41]在桑枝青贮中添加植物乳杆菌菌剂以及何家俊等[42]在玉米秸秆与酒糟混合青贮中添加CE的研究均表明,微生物菌剂或酶制剂的应用能够显著提高青贮饲料的Chao1指数,优化菌群物种丰富度。在本试验中,天然牧草青贮中各组的Chao1指数和ACE指数均呈现上升趋势,表明FA、CE、APS和FGJ对青贮饲料微生物α多样性具有积极调控作用。在β多样性分析中,各组青贮饲料微生物群落结构较为相似,各组微生物群落与CK组微生物群落距离大小有差异,表明不同添加剂对天然牧草青贮饲料的微生物群落组成结构的影响各不相同。
在门水平物种分布上,各组以厚壁菌门相对丰度最高,其中CE组、APS组、FGJ组和H组厚壁菌门相对丰度均高于CK组,变形菌门相对于CK组相对丰度均降低。厚壁菌门中主要包括芽孢杆菌和支原体等菌群,可以降解蛋白质、纤维素等物质;变形菌门主要包括大肠杆菌、沙门氏菌等病原菌,会与乳酸菌竞争发酵底物[43-44]。因此,说明在天然牧草青贮中添加CE、APS、FGJ均可以提高青贮饲料中有益菌相对丰度,抑制有害病原菌生长,提高青贮饲料发酵成功率,改善青贮品质,这与牟林林[45]研究结果一致。邸佳俐等[46]研究在菜用大豆秸秆中添加不同量的FA,表明随着FA的增加变形菌门相对丰度逐渐提升,厚壁菌门相对丰度逐渐降低,本试验结果与之一致。
在属水平物种分布上,以片球菌属、果实乳杆菌属、乳酸杆菌属、乳杆菌属相对丰度较高且均为乳酸菌,乳酸菌是发酵一系列糖类物质的主要终产物为乳酸的细菌总称[47]。有研究表明,片球菌属的相对丰度较高时会产生更多乳酸[48]。在本试验中,FGJ组和H组片球菌属相对丰度达40%以上且LA含量也相对较高;FA组球菌属相对丰度最低且LA含量也最低,这可能是由于FA能抑制LA发酵[31]。果实乳杆菌属、乳酸杆菌属和乳杆菌属在各组中占据一定比列,这些乳酸菌的协同作用促进了天然牧草青贮发酵的进行。

3.3 不同添加剂对天然牧草青贮体外发酵特性的影响

瘤胃发酵参数pH、NH3-N含量等是评价青贮饲料营养价值的重要指标,也可有效地反映动物机体营养情况[49]。利于瘤胃微生物正常生长及发挥发酵功能的pH一般在5.5~7.5[50]。有研究表明,当瘤胃NH3-N含量在0.29~29 mg/dL时,利于瘤胃微生物利用饲料中的含氮物质合成菌体蛋白[51]。本试验中,各组瘤胃pH在6.38~6.47,瘤胃NH3-N含量在6.50~9.28 mg/dL,均在正常范围内,表明添加剂处理的青贮饲料不会影响瘤胃微生物发挥正常功能,各组NH3-N含量均显著低于CK组,说明瘤胃微生物利用了更多的含氮物质合成菌体蛋白[52]。
VFA是瘤胃消化吸收WSC的过程中产生的,为反刍动物提供所需能量的70%以上[53],在动物乳脂的合成、饲料转化率等方面发挥着重要作用。其中AA、PA和BA约占VFA总量的95%,AA/PA反映出瘤胃发酵类型。AA对动物乳脂的合成起到积极作用,本试验各组AA、PA、BA和TVFA含量均高于CK组,说明添加剂通过提高青贮饲料中WSC的含量,促进了AA、PA和BA的生成,从而显著提高了TVFA的含量[52]。AA/PA越低,则能量利用率越高[54];CE组、FGJ组、APS组、H组AA/PA均低于CK组,表明添加CE、APS和FGJ的青贮饲料可改变绵羊瘤胃发酵模式。FA组与CK组之间AA/PA无显著差异,说明添加FA的青贮饲料不影响绵羊瘤胃发酵模式,这与康雅洁等[55]研究结果一致。
饲料IVDMD和IVNDFD能反映青贮饲料在反刍动物体内消化吸收程度,是评价青贮饲料饲用价值的重要指标[56]。在本试验中,各组的IVDMD和IVNDFD均高于CK组,表明添加剂处理过的青贮饲料饲用价值较高,添加剂可以促进青贮饲料在瘤胃中的消化。冯启贤等[5]、何家俊等[42]、郝建辉[57]研究表明,在青贮饲料中添加FA、CE、乳酸菌等添加剂均能提高饲料营养物质消化率。

3.4 不同添加剂对天然牧草青贮品质的综合评价

不同添加剂在对天然牧草青贮品质不同指标上的表现各不相同,使用单一指标评价最适合青贮的添加剂是不全面的。因此,将各组具有差异性的指标进行隶属函数分析,最后所得隶属函数平均值,数值越大说明该添加剂越适合天然牧草的青贮[58]。本试验通过对隶属函数分析得出,FGJ与APS混合添加对天然牧草的青贮效果最佳。

4 结论

① 添加FA、CE、APS、FGJ及混合添加APS和FGJ均可以较好保存天然牧草青贮饲料的营养成分,不同程度上提高了天然牧草的青贮品质、有益菌相对丰度及体外瘤胃发酵效果。
② 基于本试验条件下,对天然牧草青贮品质及体外营养物质消化率的综合分析,建议在天然牧草青贮过程中混合添加APS与FGJ,可为河北坝上地区天然牧草青贮饲料的调制提供理论依据。

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