动物营养学报 >

2025 , Vol. 37 >Issue 10: 7010 - 7022

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.570

研究论文

复方中草药提取物对凡纳滨对虾生长性能、血清生化指标、肠道健康及抗病力的影响

  • 陈龙 , 1, 2 ,
  • 邓敬明 3 ,
  • 刘再凡 3 ,
  • 钟永锋 2 ,
  • 李志文 4 ,
  • 韦贞宏 4 ,
  • 张羽帆 5 ,
  • 杨映 , 1, * ,
  • 胡俊茹 , 2, * ,
  • 黄文 2
展开
  • 1 佛山大学动物科技学院,广东省动物分子设计与精准育种重点实验室,佛山 528000
  • 2 广东省农业科学院动物科学研究所,农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室,广东省畜禽育种与营养研究重点实验室,广州 510640
  • 3 广州大农生物科技有限公司,广州 510640
  • 4 广东旺渔生物科技有限公司,阳江 529599
  • 5 北京奥特奇生物制品有限公司,北京 101499
*杨 映,教授,硕士生导师,E-mail: ;
胡俊茹,副研究员,硕士生导师,E-mail:

陈 龙(1998—),男,江苏淮安人,硕士研究生,研究方向为水产动物营养与饲料。E-mail:

Office editor: 武海龙

收稿日期: 2025-03-21

  网络出版日期: 2025-10-15

基金资助

广东省乡村振兴战略专项资金种业振兴项目(2024-SPY-00-006)

广东省农业科学院协同创新中心项目(202138)

广东省农业科学院协同创新中心项目(XT202301)

企业自主研发项目

收起

Effects of Compound Chinese Herbal Medicine Extract on Growth Performance, Serum Biochemical Indices, Intestinal Health and Disease Resistance of Litopenaeus vannamei

  • CHEN Long , 1, 2 ,
  • DENG Jingming 3 ,
  • LIU Zaifan 3 ,
  • ZHONG Yongfeng 2 ,
  • LI Zhiwen 4 ,
  • WEI Zhenhong 4 ,
  • ZHANG Yufan 5 ,
  • YANG Ying , 1, * ,
  • HU Junru , 2, * ,
  • HUANG Wen 2
Expand
  • 1 Guangdong Key Laboratory of Animal Molecular Design and Precision Breeding, School of Animal Science and Technology, Foshan University, Foshan 528000, China
  • 2 Guangdong Provincial Key Laboratory of Animal Breeding and Nutrition, Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science in South China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Institute of Animal Science, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China
  • 3 Guangzhou Danong Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou 510640, China
  • 4 Guangdong Wangyu Biotechnology Co., Ltd., Yangjiang 529599, China
  • 5 Beijing Aoteqi Biological Products Co., Ltd., Beijing 101499, China
*YANG Ying, professor, E-mail: ;
HU Junru, associate professor, E-mail:

Received date: 2025-03-21

  Online published: 2025-10-15

Fold

摘要

本试验旨在研究高植物蛋白质饲料中添加复方中草药提取物对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生长性能、血清生化指标、肠道健康及抗病力的影响。选取初始均重为0.80 g左右的凡纳滨对虾360尾,随机分为3组,每组3个重复,每个重复40尾。对照组(T0组)投喂高植物蛋白质饲料,试验组分别在高植物蛋白质饲料中添加0.08%复方中草药提取物1(由杨树花、山楂、茯苓组成,主要活性成分鞣花酸含量为0.8%,T1组)和复方中草药提取物2(由甘草、五倍子、葛根组成,主要活性成分甘草酸含量为2%,T2组)。试验期42 d。结果表明:1)与T0组相比,T1组的终末均重、增重率和特定生长率显著提高(P<0.05),饲料系数显著降低(P<0.05);T1组和T2组的存活率显著提高(P<0.05)。2)与T0组相比,T1组和T2组的血清葡萄糖含量显著提高(P<0.05)。3)与T0组相比,T1组和T2组的肝胰腺磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38)、磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)、核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)及真核起始因子4结合蛋1(4EBP1)的基因相对表达量显著提高(P<0.05)。4)与T0组相比,T1组和T2组的肠道绒毛高度、黏膜层厚度、肠壁厚度和肌层厚度显著提高(P<0.05)。5)感染弧菌后,T1组的肝胰腺干扰素-维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因-19(Grim-19)、Rab、甲壳肽(Crustin)的基因相对表达量均显著高于T0组和T2组(P<0.05),T2组的肝胰腺Grim-19和Crustin的基因相对表达量均显著高于T0组(P<0.05)。综上所述,在高植物蛋白质饲料中添加2种复方中草药提取物均可提高凡纳滨对虾生长性能和饲料利用率,改善肠道健康,增加抗病能力,尤其以由杨树花、山楂和茯苓组成的复方中草药提取物效果较好。

关键词： 凡纳滨对虾; 中草药; 生长性能; 肠道健康; 抗病力

本文引用格式

陈龙 , 邓敬明 , 刘再凡 , 钟永锋 , 李志文 , 韦贞宏 , 张羽帆 , 杨映 , 胡俊茹 , 黄文 . 复方中草药提取物对凡纳滨对虾生长性能、血清生化指标、肠道健康及抗病力的影响[J]. 动物营养学报, 2025 , 37(10) : 7010 -7022 . DOI: 10.12418/CJAN2025.570

Abstract

The study was to investigate the effects of compound Chinese herbal medicine extract added to high plant protein diet on growth performance, serum biochemical indices, intestinal health and disease resistance of Litopenaeus vannamei. A total of 360 Litopenaeus vannamei with an initial average body weight of about 0.80 g were randomly divided into 3 groups with 3 replicates per group and 40 shrimp per replicate. The control group (T0 group) was fed a high plant protein diet, and the experimenal groups were fed the high plant protein diets supplemented with 0.08% compound Chinese herbal medicine extract 1 (composed by poplar flower, hawthorn and poria, the main active ingredient tannic acid content was 0.8%, T1 group) and compound Chinese herbal medicine extract 2 (composed by liquorice, gallploid and pueraria, the main active ingredient glycyrrhizic acid content was 2.0%, T2 group), respectively. The experimental period lasted for 42 days. The results showed as follows: 1) compared with the T0 group, the final average weight, weight gain rate and specific growth rate of the T1 group were significantly increased (P<0.05), and the feed coefficient was significantly decreased (P<0.05); the survival rate of T1 and T2 groups was significantly increased (P<0.05). 2) Compared with the T0 group, the serum glucose content of T1 and T2 groups was significantly increased (P<0.05). 3) Compared with the T0 group, the gene relative expression levels of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), mammalian target of rapamycin (mTOR), p38 mitogen-activated protein kinases (p38), phosphatase and tensin homolog deleted on chromosometen (PTEN), ribosomal protein S6 kinase1 (S6K1) and eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1 (4EBP1) in hepatopancreas of T1 and T2 groups were significantly increased (P<0.05). 4) Compared with the T0 group, the villus height, mucosal layer thickness, intestinal wall thickness and muscle layer thickness in intestine of T1 and T2 groups were significantly increased (P<0.05). 5) After infected with vibrio, the gene relative expression levels of gene associated with retinoid-interferon-induced mortality-19 (Grim-19), Rab and Crustin in hepatopancreas of T1 group were significantly higher than those of T0 and T2 groups (P<0.05), and the gene relative expression levels of Grim-19 and Crustin in T2 group were significantly higher than those of T0 group (P<0.05). In conclusion, the addition of two compound Chinese herbal medicine extracts in high plant protein diet can improve the growth performance, feed utilization rate, intestinal health and disease resistance of Litopenaeus vannamei, and the compound Chinese herbal medicine extract composed by poplar flower, hawthorn and poria has the better effect.

Key words： Litopenaeus vannamei; Chinese herbal medicine; growth performance; intestinal health; disease resistance

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)又称南美白对虾,属对虾科、对虾属,具有生长快、抗逆性强、适应性广的优势[1]。2022年全球渔业和水产养殖总产量激增至2.232亿t,比2020年增长4.4%,2023年我国凡纳滨对虾产量超过200万t,是国际水产贸易的关键品种之一[2-3],已成为我国渔业经济的一个关键支柱。鱼粉作为水产养殖中不可或缺的优质蛋白质来源,由于其全球供应紧张和需求持续增加的双重影响,价格不断攀升,直接导致饲料成本增加,促使饲料企业加速开发低鱼粉饲料配方,如使用酶解豆粕等植物蛋白质替代品,以降低生产成本[4]。然而,豆粕、花生粕等植物蛋白质因氨基酸比例失衡、含抗营养因子(如胰蛋白酶抑制剂、植酸、异黄酮和皂素等)[5]以及适口性差等限制因素,长期在低鱼粉饲料中使用可能导致凡纳滨对虾体重增长、特定生长率、饲料转化率、蛋白质效率以及存活率的显著下降[6-7];此外,还可能影响凡纳滨对虾的免疫功能和抗氧化能力[8],进而增加对虾感染弧菌的风险,因此低鱼粉饲料配制技术的研究仍需不断探索与创新。
水产养殖领域已对中草药及其提取物展开广泛的研究,这得益于其具备的安全性、不易诱发耐药性以及无药物残留等显著优势[9]。传统经典中草药富含的黄酮类、多糖及苷类等多元生物活性成分对动物健康形成了独特调控优势,展现出广阔应用前景[10]。五倍子、杨树花及甘草的活性成分分别为鞣花酸与甘草酸,研究显示,鞣花酸可通过特异性蛋白质结合机制发挥抗炎[11]、抗氧化[12]等功效。Wang等[13]研究发现,在饲料中添加鞣花酸可显著提高黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)的特定生长率和增重率,并下调凋亡与炎症相关基因的表达,从而缓解氨中毒对机体的负面影响。然而,也有研究表明,鞣花酸对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的生长性能无显著影响,但能够显著提升肝脏、头肾和脾脏的消化酶活性,并增强其对耶尔森菌(Yersinia ruckeri)的抵抗力[14]。甘草酸是一种三萜皂苷类化合物,作为免疫刺激剂已广泛应用于凡纳滨对虾养殖,可提高其特定生长率、消化酶活性,促进生长,增强免疫力[15-17]。此外,饲料中添加甘草酸可以增强大黄鱼(Larimichthys crocea)幼鱼摄食因子的基因表达和消化酶活性[18]。上述研究表明,中草药中的活性成分具有多靶点、多通路的作用特点,能够有效调节水产动物的生长、免疫功能[10]。因此,本试验在高植物蛋白质饲料中添加复方中草药提取物,旨在研究其对凡纳滨对虾生长性能、血清生化指标、肠道健康及抗病力的影响,为凡纳滨对虾低鱼粉饲料的开发提供技术支撑,以期为凡纳滨对虾养殖业开辟一条可持续发展之路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

复方中草药提取物1由杨树花(40%)、山楂(20%)、茯苓(20%)组成,主要活性成分为鞣花酸,含量为0.8%;复方中草药提取物2由甘草(40%)、五倍子(20%)、葛根(20%)组成,主要活性成分为甘草酸,含量为2.0%。
高植物蛋白质饲料以鱼粉、豆粕、花生粕、虾粉、鸡肉粉、膨化大豆作为主要蛋白质源,鱼油作为主要脂肪源,高精面粉作为主要碳源配制而成。

1.2 试验设计

动物试验伦理审批机构:广东省农业科学院动物科学研究所(水产研究所)实验动物伦理委员会;批准编号:2022002。
选取初始均重为0.80 g左右的凡纳滨对虾360尾,随机分为3组,每组3个重复,每个重复40尾。对照组(T0组)投喂未添加复方中草药提取物的高植物蛋白质饲料,试验组分别在高植物蛋白质饲料中添加0.08%复方中草药提取物1(T1组)和复方中草药提取物2(T2组)。试验期42 d。试验饲料组成及营养水平见表1。将所有饲料原料进行粉碎处理后过筛,制成颗粒饲料,最后烘干处理后分装备用。
表1 试验饲料组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) %

项目
Items		 组别Groups
T0 T1 T2
原料Ingredients
鱼粉Fish meal 8.00 8.00 8.00
豆粕Soybean meal 24.50 24.50 24.50
花生粕Peanut meal 20.00 20.00 20.00
虾粉Prawn powder 5.00 5.00 5.00
鸡肉粉Chicken meal 5.00 5.00 5.00
膨化大豆Puffed soybean 4.00 4.00 4.00
面粉Wheat flour 24.82 24.74 24.74
血球蛋白Hemoglobin 2.00 2.00 2.00
鱼油Fish oil 3.00 3.00 3.00
磷酸二氢钙Ca(H2PO4)2 1.50 1.50 1.50
预混料Premix1) 1.00 1.00 1.00
胆碱Choline 0.15 0.15 0.15
维生素C Vitamin C 0.03 0.03 0.03
腐植酸钠Sodium humate 1.00 1.00 1.00
复方中草药提取物
Compound Chinese herbal medicine extract		 0.08 0.08
合计Total 100.00 100.00 100.00
营养水平Nutrient levels2)
粗蛋白质Crude protein 39.85 39.71 39.63
粗脂肪Ether extract 5.97 6.12 6.19
粗灰分Crude ash 9.96 9.69 9.91
水分Moisture 8.42 8.45 8.31

1)每千克预混料含有 One kg of the premix contained the following:VA 4 000 000 IU,VD3 2 000 000 IU,VE 30 g,VK3 10 g,VB1 5 g,VB2 15 g,VB6 8 g,D-泛酸 D-pantothenic acid 25 g,叶酸 folic acid 2.5 g,生物素 biotin 0.08 g,烟酸 nicotinic acid 40 g,VB12 0.02 g,肌醇 inositol 150 g,MgSO4·H2O 12 g,MgCl2 90 g,Met-Cu 3 g,FeSO4·H2O 1 g,ZnSO4·H2O 10 g,Ca(IO3)2 0.06 g,Met-Co 0.16 g,Na2SeO3 0.003 6 g。2)营养水平均为实测值。Nutrient levels were all measured values.

1.3 饲养管理

试验前,从番禺某养殖场购入虾苗,并在水泥池中暂养约1周,随后挑选出体型均匀、健康状况良好、初始平均体重约为0.80 g的凡纳滨对虾苗360尾,放入9个容量为300 L的循环系统圆柱形玻璃纤维缸中。将这些虾苗随机分为3组,每组设3个平行缸,每缸40尾虾,各组分别投喂不同的试验饲料。每日定时投喂3次(08:30、14:30和20:30),并根据虾的摄食情况调整次日投喂量。若有剩余饲料,则收集烘干称重并保存,从总投喂量中扣除。记录虾的摄食量、死亡数量及对应缸号,并定期称重。养殖期间,水温维持在27~31 ℃,盐度为4.5%~5.5%,氨氮浓度低于0.20 mg/L,亚硝酸盐浓度低于0.01 mg/L,溶解氧浓度高于5.0 mg/L,pH保持在7.8~8.2。养殖试验持续42 d。

1.4 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)急性感染试验

将活化好的副溶血弧菌(中国水产科学研究院南海水产研究所提供)培养48 h后进行计数,制备副溶血弧菌悬液。养殖试验结束后,随机选取90尾对虾(每缸10尾),每尾注射30 μL浓度为5×105 CFU/mL副溶血弧菌,随后每4 h观察1次,并记录死亡数,注射6 h后发现每缸虾已经出现死亡,马上采集活虾肝胰腺样品。

1.5 样品采集与处理

养殖试验结束后,禁食12 h,从每个养殖缸中随机选取15尾对虾,用一次性无菌注射器(1.0 mL)于心脏采血,置于冷冻离心机2 680×g离心10 min分离血清,于-80 ℃冻存,用于测定血清生化指标;从上述15尾对虾中随机抽取6尾,3尾于无菌条件下采集肝胰腺组织,置于无酶管中,于-80 ℃冻存,用于检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路基因的表达;另外3尾虾分离出肠道,并用波恩氏液固定,用于测定肠道组织形态。攻毒结束后,每缸抽取3尾虾,采集肝胰腺样品,用于检测抗病基因的表达。

1.6 指标测定

1.6.1 试验饲料营养水平

分别采用凯氏定氮法(GB 5009.5—2016)、索氏抽提法(GB 5009.6—2016)、550 ℃马弗炉灼烧法(GB 5009.4—2016)、恒温干燥法(GB 5009.3—2016)测定试验饲料中粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分和水分含量。

1.6.2 生长性能

养殖试验结束后,计数每个重复的对虾存活尾数,并称量其终末体重,用于计算增重率、特定生长率、饲料系数和存活率,公式如下:

增重率(%)=100×(Wf-W0)/W0;

特定生长率(%/d)=100×(lnWf-lnW0)/t;

饲料系数=Wt/(Wf-W0);

存活率(%)=100×Nf/Ni。

式中:Wf为对虾终末均重;W0为对虾初始均重;Wt为投喂饲料的总重;t为试验天数;Nf为试验末对虾尾数;Ni为试验初对虾尾数。

1.6.3 血清生化指标

血清总蛋白(total protein,TP)、白蛋白(albumin,ALB)、球蛋白(globularproteins,GLB)、葡萄糖(glucose,GLU)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、尿素(urea,UREA)含量按照试剂盒说明书进行测定,试剂盒购自威特曼(南京)生物科技有限公司。

1.6.4 肠道组织形态

取固定在波恩氏液中的部分对虾肠道组织,随后进行酒精脱水并包埋于石蜡中,定型后切片,用苏木精-伊红(HE)染色,于显微镜下以100×的倍率拍照观察,测量黏膜层厚度、肠壁厚度、肌层厚度、绒毛高度和绒毛宽度。

1.6.5 mTOR信号通路基因和肝胰腺抗病基因表达

按照通用RNA提取试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司)]说明书提取对虾肝胰腺的总RNA,利用TransGen Biotech试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)进行合成cDNA。通过Line Gene K Plus荧光定量PCR(杭州博日科技有限公司)检测相关基因的表达。β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因,目的基因包括磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、mTOR、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,p38)、磷酸酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosometen,PTEN)、核糖体蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase1,S6K1)、真核起始因子4结合蛋1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1,4EBP1)、干扰素-维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因-19(gene associated with retinoid-interferon-induced mortality-19,Grim-19)、Rab、甲壳肽(Crustin),根据2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。引物序列信息见表2。
表2 引物序列信息

Table 2 Primer sequence information

项目Items 引物序列Primer sequence(5'—3')
β-肌动蛋白
β-actin		 F: GCCCATCTACGAGGGATA
R: GGTGGTCGTGAAGGTGTAA
磷脂酰肌醇-3-激酶
PI3K		 F: CGTGTGCCAAGACCAGTTT
R: GCTGAGTGICATGCCAGAGAA
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白
mTOR		 F: TGCCAACGGGTGGTAGA
R: GGGTGTTTGTGGACGGA
p38丝裂原活化蛋白激酶
p38		 F: GTCGGCTCGCAACTACATAC
R: CCGTTACACGCCTTTCACT
磷酸酶与张力蛋白同源物
PTEN		 F: CTCAGAAGTTGGAGGGTGTGTAC
R: CAATCAGAGGCGGIGGGTTA
核糖体蛋白S6激酶1
S6K1		 F: GCAAGAGGAAGACGCCATA
R: CCGCCCTTGCCCAAAACCT
真核起始因子4结合蛋1
4EBP1		 F: ATGTCTGCTTCGCTCGCTCGCC
R: GGTTCTTGGGTGGGCTCTT
干扰素-维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因-19
Grim-19		 F: TGTTGAAGGCTGGGAAGTTG
R: AGAGTGAGTGTCGTGTGAAGGAA
Rab F: GACAGTGGTGTTGGAAAG
R: GCCGTCTAGTTCAATTGTTCG
甲壳肽
Crustin		 F: CGGAGTAGGTGTTGGTGGTGGTT
R: CTCGCAGCAGTAGGCTTGAC

1.7 数据统计分析

采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析,再对数据进行方差齐性检验,Duncan氏检验方法进行多重比较,若不满足则采用Dunnett’s T3检验法进行多重比较。试验数据均采用“平均值±标准误”表示,P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 复方中草药提取物对凡纳滨对虾生长性能的影响

由表3可知,与T0组相比,T1组的终末均重、增重率和特定生长率显著提高(P<0.05),T2组的终末均重、增重率和特定生长率有所提高,但差异不显著(P>0.05);T1组的饲料系数显著降低(P<0.05),T2组的饲料系数有所降低,但差异不显著(P>0.05);T1组和T2组的存活率显著提高(P<0.05)。
表3 复方中草药提取物对凡纳滨对虾生长性能的影响

Table 3 Effects of compound Chinese herbal medicine extract on growth performance of Litopenaeus vannamei

项目
Items		 组别Groups
T0 T1 T2
终末均重FBW/g 5.37±0.09a 7.77±0.22b 6.23±0.50ab
增重率WGR/% 571.10±10.79a 871.00±27.01b 678.80±62.20ab
特定生长率SGR/(%/d) 4.53±0.04a 5.41±0.07b 4.87±0.20ab
饲料系数FCR 2.46±0.37b 1.20±0.01a 1.87±0.32ab
存活率SR/% 73.33±3.33a 94.17±2.20b 95.00±2.50b

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 复方中草药提取物对凡纳滨对虾血清生化指标的影响

由表4可知,与T0组相比,T1组和T2组的血清葡萄糖含量显著提高(P<0.05)。各组之间其余血清生化指标差异不显著(P>0.05)。
表4 复方中草药提取物对凡纳滨对虾血清生化指标的影响

Table 4 Effects of compound Chinese herbal medicine extract on serum biochemical indices of Litopenaeus vannamei

项目
Items		 组别Groups
T0 T1 T2
总蛋白TP/(g/L) 82.87±9.73 91.43±3.15 80.27±3.85
白蛋白ALB/(g/L) 9.60±1.86 9.20±0.53 9.03±0.97
球蛋白GLB/(g/L) 73.27±7.94 82.23±2.82 71.23±4.64
葡萄糖GLU/(mmol/L) 1.20±0.15a 2.63±0.26b 2.47±0.43b
总胆固醇TC/(mmol/L) 0.47±0.10 0.45±0.08 0.39±0.07
甘油三酯TG/(mmol/L) 0.59±0.14 1.22±0.02 0.83±0.17
尿素UREA/(mmol/L) 0.76±0.34 1.68±0.24 1.83±0.61

2.3 复方中草药提取物对凡纳滨对虾肝胰腺mTOR信号通路基因表达的影响

由表5可知,与T0组相比,T1组和T2组的肝胰腺PI3K、mTOR、p38、PTEN、S6K1及4EBP1的基因相对表达量显著提高(P<0.05);T1组的PI3K、mTOR、p38、S6K1及4EBP1的基因相对表达量显著高于T2组(P<0.05)。
表5 复方中草药提取物对凡纳滨对虾肝胰腺mTOR信号通路基因表达的影响

Table 5 Effects of compound Chinese herbal medicine extract on expression of mTOR signaling pathway gene in hepatopancreas of Litopenaeus vannamei

项目
Items		 组别Groups
T0 T1 T2
磷脂酰肌醇-3-激酶PI3K 1.00±0.06a 62.29±5.67c 38.29±5.80b
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR 1.00±0.05a 32.47±0.64c 22.11±2.37b
p38丝裂原活化蛋白激酶p38 1.02±0.13a 184.44±8.59c 130.00±16.99b
磷酸酶与张力蛋白同源物PTEN 1.02±0.05a 50.40±7.60b 44.02±3.56b
核糖体蛋白S6激酶1 S6K1 1.02±0.14a 50.52±3.31c 34.88±5.33b
真核起始因子4结合蛋1 4EBP1 1.02±0.13a 29.22±1.36c 22.65±1.59b

2.4 复方中草药提取物对凡纳滨对虾肠道组织形态的影响

由表6可知,与T0组相比,T1组和T2组的肠道绒毛高度、黏膜层厚度、肠壁厚度和肌层厚度显著提高(P<0.05)。各组之间绒毛宽度差异不显著(P>0.05)。
表6 复方中草药提取物对凡纳滨对虾肠道组织形态的影响

Table 6 Effects of compound Chinese herbal medicine extract on intestinal tissue morphology of Litopenaeus vannamei mm

项目
Items		 组别Groups
T0 T1 T2
绒毛高度Villus height 0.03±0.00a 0.05±0.00b 0.06±0.01b
绒毛宽度Villus width 0.03±0.00 0.04±0.00 0.04±0.00
黏膜层厚度Mucosal layer thickness 0.04±0.00a 0.09±0.01c 0.06±0.00b
肠壁厚度Intestinal wall thickness 0.11±0.00a 0.20±0.01b 0.18±0.01b
肌层厚度Muscle layer thickness 0.05±0.00a 0.08±0.01b 0.09±0.01b

2.5 复方中草药提取物对凡纳滨对虾肠道组织病理的影响

如图1所示,与T0组比较,T1组和T2组的肠道组织上皮绒毛层脱落(黄色箭头)减少,黏膜上皮细胞较为完整,水样变性(红色箭头)减少,各组肌层结构清晰,细胞排列紧密,具有清晰的细胞间隙。
图1 复方中草药提取物对凡纳滨对虾肠道组织病理的影响

T0:T0组 T0 group;T1:T1组 T1 group;T2:T2组 T2 group。黄色箭头:上皮绒毛层;红色箭头:水样变性。Yellow arrow: epithelial villous layer; red arrow: water sample denaturation.

Fig.1 Effects of compound Chinese herbal medicine extract on intestinal tissue pathology of Litopenaeus vannamei (100×)

2.6 复方中草药提取物对凡纳滨对虾感染弧菌后肝胰腺抗病基因表达的影响

由图2可知,感染弧菌后,T1组的肝胰腺Grim-19、Rab、Crustin的基因相对表达量均显著高于T0组和T2组(P<0.05),T2组的肝胰腺Grim-19和Crustin的基因相对表达量均显著高于T0组(P<0.05)。
图2 复方中草药提取物对凡纳滨对虾感染弧菌后肝胰腺抗病基因表达的影响

Grim-19:干扰素-维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因-19 gene associated with retinoid-interferon-induced mortality-19;Crustin:甲壳肽。数据柱标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Value columns with the same small letter mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05).

Fig.2 Effects of compound Chinese herbal medicine extract on expression of hepatopancreas anti-disease gene of Litopenaeus vannamei infected with vibrio

3 讨论

3.1 复方中草药提取物对凡纳滨对虾生长性能的影响

中草药富含多种生物活性物质,能够促进水产动物的摄食量、增强消化酶活性、改善生长性能及肌肉品质等[10]。张玉[19]研究发现,在饲料中适量添加柴胡、甘草等复合中草药可促进凡纳滨对虾的生长,提高存活率、增重率和特定生长率,同时降低饵料系数并增强其免疫功能。陈嘉声等[20]也证实,适量添加五倍子能有效增强对虾的生长性能、抗氧化酶活性及免疫功能,并改善其肠道组织结构。此外,黄永春等[21]研究发现,将茯苓超微粉碎后以1.5%的比例添加到基础饲料中,可显著提高凡纳滨对虾的增重率、存活率及肠道消化酶活性,同时降低饵料系数。上述结果共同表明,茯苓、甘草、五倍子等中草药能够通过调节营养代谢、免疫应答及微生物平衡等多种途径,实现对虾生长速率与机体健康的协同增效作用。
Paust等[22]认为,在应激状态下,鱼类需要更多能量来维持正常生理功能,饲料中应提供足够的能量和营养支持。研究发现,活性成分鞣花酸可有效缓解慢性氨应激对黄颡鱼生长的抑制作用,补充鞣花酸减轻了氨引起的氧化应激,改善鱼体的健康状况[13],低鱼粉饲料中鱼粉含量降低,可能导致对虾所需的必需氨基酸、脂肪酸等关键营养素不足,进而诱发应激反应[23]。然而,植物提取物的添加可有效提高鱼粉部分替代后凡纳滨对虾的营养物质利用率,不仅改善了其生长性能,还增强了免疫应答能力[24]。在本试验中,鱼粉用量降至8%,显著低于商品饲料中20%左右的常规用量[23],结果显示添加2种复方中草药提取物后,尤其是由杨树花、山楂和茯苓组成的复方中草药提取物,对虾的增重率显著提升,饵料系数显著降低,这一结果与上述研究结果一致。

3.2 复方中草药提取物对凡纳滨对虾血清生化指标的影响

鱼类的生长发育主要依赖于体内蛋白质的合成,其中血清总蛋白含量是评估水产动物蛋白质合成能力的关键指标[25],同时也与鱼类的先天免疫反应密切相关[26-27]。研究发现,饲料中添加鞣花酸可提高虹鳟血清总蛋白含量[14];饲料中添加五倍子可提高凡纳滨对虾血清总蛋白含量,降低血清甘油三酯含量,促进凡纳滨对虾对蛋白质的利用和脂质代谢[20]。本试验发现,饲料中添加由杨树花、山楂和茯苓组成的复方中草药提取物提高了凡纳滨对虾血清总蛋白和球蛋白含量,但与对照组差异不显著。研究认为,凡纳滨对虾生化指标的变化会受中草药的投喂时间和策略的影响[24],推测这可能是造成差异不显著的原因。
葡萄糖是维持水产动物生命活动的重要能量来源,也是反映饲料营养是否适当和肝脏机能是否良好的指标[28]。高植物蛋白质对凡纳滨对虾机体造成损伤,研究发现随着膨化豆粕含量增加、鱼粉含量降低,血清葡萄糖含量显著降低[29];此外,高豆粕替代鱼粉影响凡纳滨对虾胰高血糖信号通路、半乳糖代谢、糖酵解和糖异生信号通路的响应[30],这些代谢通路的变化可能导致对虾血糖水平的波动,进而影响其能量供应和生长性能。然而,通过饲料添加剂的合理调控,可以缓解这种负面影响,饲料中添加N-乙酰乙酰-L-半胱氨酸和月桂酸显著提高了拥挤胁迫下凡纳滨对虾的血糖水平,升高的血糖水平被认为为对虾生长提供了较好的营养供给[31]。研究发现,中草药组分甘草和五倍子的主要有效成分甘草酸和没食子酸对斑点叉尾鮰幼鱼(Ictalurus punctatus)[28]以及中华倒刺鲃(Spinibarbus sinensis)具有显著的提升血糖水平作用[32]。石小涛[33]认为,血糖水平通常会根据组织储备的释放情况而动态变化,以满足机体的能量需求。本研究结果表明,饲料中添加由杨树花、山楂和茯苓组成的复方中草药提取物和由甘草、五倍、葛根子组成的复方中草药提取物均显著提高了对虾血清葡萄糖含量,说明这2种复方中草药提取物都能增强对虾的血糖代谢,积极供能以促进生长。

3.3 复方中草药提取物对凡纳滨对虾肝胰腺mTOR信号通路基因表达的影响

凡纳滨对虾的肝胰腺在营养物质的加工和代谢中扮演着核心角色,其中mTOR信号通路是调控这些生理功能的关键分子机制。mTOR信号通路通过PI3K信号通路激活,随后通过下游靶标S6K1、4EBP1的磷酸化,促进蛋白质合成和细胞生长。与此同时,PTEN和p38作为负调节因子,分别通过去磷酸化磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)和磷酸化结节硬化复合物2(TSC2)来抑制mTOR的活性[34-36],而mTOR过表达也不利于维持细胞稳态[37]。低鱼粉饲料会影响凡纳滨对虾mTOR信号通路的响应,当饲料中发酵豆粕和青贮饲料替代鱼粉过量时,凡纳滨对虾肝胰腺的mTOR和S6K1表达水平被抑制[29,38]。研究发现,本试验所用中药组分甘草能增强尖吻鲈(Lates calcarifer)mTOR基因表达,并激活结合蛋白,促进mTOR复合物的形成,进一步提升了真核起始因子4E(eIF4E)基因的表达水平,生成翻译调节因子,最终推动蛋白质合成的增加[39]。此外,研究认为山楂果和山楂叶的营养与药用成分相近,主要成分为黄酮类化合物,山楂叶能够提高雏鸡空肠中PI3K和磷酸化mTOR蛋白的表达水平,从而促进其肠道发育[40]。本试验结果也表明,添加含有甘草和山楂的2种复方中草药提取物能够激活mTOR信号通路基因的表达,促进机体生长,从而有效降低由低鱼粉、高植物蛋白质饲料引起的生长抑制效果。

3.4 复方中草药提取物对凡纳滨对虾肠道健康的影响

肠道是一个至关重要的器官,具有吸收营养和防御疾病的双重功能,而肠道的结构形态和组织病理变化被用于评估动物肠道的健康状况[41]。龚舜莲等[42]研究发现,用大豆浓缩蛋白、鸡肉粉等替代鱼粉,影响了凡纳滨对虾肠道皱襞高度和肌层厚度,导致对虾肠道出现损伤。Xie等[6]研究发现,饲喂低鱼粉饲料的凡纳滨对虾肠道出现损伤,鱼粉含量为15%时肠道上皮细胞的外核膜与内核膜部分分离,鱼粉含量为5%时肠道上皮细胞的外核膜与内核膜完全分离且形成细胞凋亡体。本研究发现,与T0组相比,T1组和T2组的肠道绒毛高度、黏膜层厚度、肠壁厚度和肌层厚度显著提高。这与陈嘉声等[20]在饲料中添加五倍子能显著改善凡纳滨对虾全肠结构的结果一致,也与陈书礼[43]以山楂作为复方中草药组方之一对改善蛋鸡肠道形态以及盲肠菌群结构的研究结果吻合。此外,还有研究发现,饲料中添加适量的鞣花酸对改善大口黑鲈(Micropterus salmoides)的肠道组织结构、抑制病原菌增殖、增加有益菌群丰度具有显著的作用[44],同样鞣花酸在黄羽肉鸡和断奶仔猪的肠道健康方面也展现出相似的功效[45-46]。上述结果说明,本试验中的2种复方中草药提取物对摄食低鱼粉饲料的凡纳滨对虾的肠道健康具有保护作用。

3.5 复方中草药提取物对凡纳滨对虾感染弧菌后肝胰腺抗病基因表达的影响

副溶血弧菌是海水特别是近岸养殖海水中较常见的优势弧菌之一,通常会导致凡纳滨对虾大量死亡。然而,长期使用抗生素易产生耐药性,因此对于副溶血弧菌的防治成为推动对虾养殖健康发展的重要课题。细胞凋亡相关基因(Grim-19)主要参与调控细胞凋亡过程,同时在维持线粒体呼吸链功能和调节免疫应答方面发挥关键作用[47-48]。Rab是一个小的鸟苷三磷酸酶(GTPase)Ras超家族,对细菌胁迫反应敏感。Wang等[49]研究发现,Rab的基因相对表达量在凡纳滨对虾感染金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)初期显著升高,表明Rab蛋白参与了凡纳滨对虾对细菌感染的早期免疫防御。Crustin是一种抗菌肽,在甲壳类动物的先天免疫中起着关键作用,研究显示,Crustin的缺失增加了凡纳滨对虾感染溶藻弧菌后的死亡率[50]。赵伟等[51]研究发现,试验组对虾感染副溶血弧菌后肝胰腺中抗病基因干扰素-维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因(Grim)、Rab和Crustin的基因相对表达量显著高于对照组。鱼粉为水产动物提供生命活动所需的营养和能量,当鱼粉被部分或完全替代后,导致机体的免疫和抗氧化能力下降。李晓丽等[8]研究表明,用豆粕替代50%鱼粉形成的基础饲料,降低了对虾肠道和肌肉中Crustin的基因相对表达量。上述结果表明,抗病基因Grim、Rab和Crustin在凡纳滨对虾感染副溶血弧菌的过程中起到了关键的免疫调节作用,而低鱼粉饲料则削弱了这些基因的表达。本试验结果表明,与T0组相比,T1组和T2组的肝胰腺Grim-19、Rab、Crustin的基因相对表达量均上调,且T1组的肝胰腺Grim-19、Rab、Crustin的基因相对表达量均显著高于T0组和T2组。与之相似的是,Chang等[16]研究发现,在饲料中添加0.06%甘草酸增强了凡纳滨对虾对溶藻弧菌的抵抗力;Mişe Yonar[14]研究发现,饲料中添加鞣花酸可以提高虹鳟感染耶尔森菌后的存活率。因此,本试验结果表明,2种复方中草药提取物都不同程度提高了高植物蛋白质饲料养殖下凡纳滨对虾的抗副溶血弧菌能力。

4 结论

饲料中添加由杨树花、山楂和茯苓组成的复方中草药提取物和由甘草、五倍、葛根子组成的复方中草药提取物均能够提高高植物蛋白质饲料养殖下凡纳滨对虾的生长性能,降低饵料系数,改善肠道健康,增强抗病能力;由杨树花、山楂和茯苓组成的复方中草药提取物效果较好。

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