多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是含有2个及以上碳-碳双键、18~22个碳原子的直链脂肪酸,根据双键位置主要分为n-3和n-6两大类。饲粮中补充PUFAs对于反刍动物脂质代谢、生物膜磷脂构成、繁殖、免疫功能及生物活性物质合成等过程具有重要作用[1]。同时,饲粮中的PUFAs经动物消化代谢沉积在乳、肉等产品中,对于促进人体健康具有特殊意义。据报道,n-3 PUFAs在促进神经系统发育、改善心血管功能[2]、预防糖尿病和改善免疫功能[3]等方面发挥着重要作用,n-6 PUFAs在促进细胞生长发育和调节免疫功能[4]等方面发挥着重要作用。集约化养殖中,奶牛同时承担着泌乳和妊娠的双重任务,机体代谢压力大,疾病易感性高。在围产期(产前2~3周至产后2~3周),奶牛因能量供应不足而出现严重的能量负平衡(negative energy balance,NEB)状态[5],并经受着分娩、泌乳及饲粮调整等多种应激,免疫系统可能处于抑制状态;但另有研究表明,奶牛在围产期免疫系统可能被激活[6]。此外,犊牛是牧场的后备力量,其免疫系统发育不成熟,面临巨大的环境变化和病原体挑战,腹泻和呼吸性疾病导致死亡率居高不下[7]。因此,促进奶牛免疫系统健康发育,提高免疫功能,对发挥生产性能至关重要。本文结合生产性能数据,对PUFAs影响奶牛免疫功能的研究成果及其机制进行综述,为通过PUFAs提高奶牛免疫功能提供营养调控策略。
1 PUFAs营养概述
n-3 PUFAs包括α-亚麻酸(alpha-linolenic acid,ALA)、二十碳五烯酸(eicosa pentaenoic acid,EPA)、二十二碳五烯酸(docosa pentaenoic acid,DPA)、二十二碳六烯酸(docosa hexaenoic acid,DHA)等,n-6 PUFAs包括亚油酸(linoleic acid,LA)、γ-亚麻酸(gamma-linolenic acid,GLA)、花生四烯酸(arachidonic acid,ARA)、共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)等。在奶牛饲料原料中,天然牧草富含ALA,是n-3 PUFAs的主要来源;亚麻籽富含ALA,鱼油和藻类富含EPA和DHA,是n-3 PUFAs的补充来源;玉米、大豆、豆粕、棉籽粕和菜籽粕等谷物饲料原料富含LA,是n-6 PUFAs的主要来源[8-9]。奶牛缺乏Δ9及以上去饱和酶,自身不能合成ALA和LA,必须从含有此类去饱和酶的植物中获取[10],因此ALA和LA是必需脂肪酸,ARA的合成需消耗LA,也归为必需脂肪酸。n-3和n-6 PUFAs家族中的其他成员分别以ALA和LA为前体经碳链延伸和去饱和作用合成[11]。PUFAs在奶牛体内参与多种生理过程、发挥营养作用,并沉积在乳、肉及其产品中,为人体提供重要的营养物质。
2 免疫功能概述
免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成,发挥着抗感染、识别和清除非己成分、维持内环境稳定的功能。病原体入侵后,机体首先激活单核/吞噬细胞、自然杀伤(natural killer,NK)细胞、树突状细胞和γδT细胞等参与固有免疫的细胞,并启动炎症反应吞噬和杀伤病原体。未被清除的病原体会被淋巴细胞(T细胞和B细胞)的受体识别,激活适应性免疫,T细胞发挥效应功能、B细胞产生以免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)为主的抗体,特异性地清除病原体。炎症反应在固有免疫应答中发挥着重要作用,白细胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6、IL-18、干扰素和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是具有促炎活性的关键细胞因子[12]。炎症可以提供生理屏障,促进免疫细胞杀伤病原体,加快修复损伤组织,但是过度的炎症反应会造成组织损伤,成为多种感染性和代谢性疾病如乳腺炎、子宫内膜炎和酮病的主要诱因[13]。
功能强大的免疫系统是奶牛维持健康和高产的保证,提高免疫功能重在维持免疫系统的平衡,即不仅要增强免疫系统抗感染的能力,而且要及时终止免疫反应,避免攻击自身成分。奶牛生产中多使用药物和疫苗提高抗病力,但是营养物质与免疫系统有密切关系,是免疫功能充分发挥的决定因素,其中PUFAs对免疫系统有重要的调节作用。
3 PUFAs对奶牛免疫功能的影响
3.1 n-3 PUFAs对奶牛免疫功能的影响
ALA通过改变免疫细胞、细胞因子和免疫反应影响奶牛免疫功能。围产期饲粮中添加亚麻籽提供ALA,可以提高奶牛中性粒细胞[14]和单核细胞的吞噬能力,增加辅助性T细胞和细胞毒性T细胞的比例[15],降低奶牛产后血浆中促炎细胞因子IL-1β[14]、IL-6和IL-17α含量及脂肪组织中的炎症蛋白质数量[16],且所产犊牛血浆中TNF-α含量下降,有益于犊牛免疫系统发育[14],同时可以提高产奶量[14],或不影响产奶量但可以提高产后能量平衡[15]。犊牛代乳粉中添加亚麻籽油可以降低血清IL-4含量,缓解接种疫苗后直肠温度的升高[17],但不影响体增重;还可以降低血清TNF-α含量,提高饲料效率[18]。另外,Caroprese等[19]研究发现,热应激下饲粮中补充亚麻籽的奶牛产生的抗卵清蛋白的IgG抗体水平显著升高;而Lessard等[20]发现,产前饲粮中补充亚麻籽对奶牛产后抗卵清蛋白的抗体反应没有影响。结果不同是因为试验奶牛的生理状态不同,围产期奶牛的免疫功能受分娩和泌乳启动的复杂生理机制调控,而热应激奶牛免疫功能的变化可能与体温调控机制有关。
综上所述,n-3 PUFAs可以促进奶牛免疫细胞增殖、减少促炎细胞因子产生、增强免疫应答,这可能会提高免疫系统的防御效率,减轻慢性或不受控制的炎症带来的并发症。因此,n-3 PUFAs对奶牛免疫系统产生了积极作用,可能是奶牛生产性能维持或提高的原因。
3.2 n-6 PUFAs对奶牛免疫功能的影响
CLA是LA代谢产生的所有位置和几何异构体的混合物,具有减少脂肪沉积、预防癌症和糖尿病[26]等作用。CLA在促使乳脂合成的能量分配给体脂储存[27]、改善奶牛产后能量代谢[28]方面发挥着重要作用,对免疫系统的影响较小[29]。奶牛产后饲粮中添加过瘤胃CLA可以降低炎症和氧化应激水平,虽然降低了能量校正乳产量,但提高了能量平衡[30]。体外研究发现,CLA可以在试验性促炎条件下减少单核细胞凋亡[31],减少促炎细胞因子的产生[32];此外,补充CLA可以降低奶牛CXC趋化因子受体4(CXCR4)的表达,介导白细胞向炎症部位迁移[33]。综上所述,LA有提高免疫细胞数量和功能、增强免疫反应的作用,CLA具有抗炎作用。但是,补充n-6 PUFAs对奶牛免疫功能影响的研究较少,还需要进一步研究以明确不同种类和添加量的n-6 PUFAs对奶牛免疫系统的调节作用。
3.3 n-3与n-6 PUFAs的平衡
n-3和n-6 PUFAs单独添加影响了奶牛免疫功能,二者在饲粮中的平衡也非常重要。奶牛饲粮中n-3与n-6 PUFAs的平衡与机体代谢和免疫功能有关,并影响泌乳性能。Greco等[34]研究发现,采食饲粮中n-3与n-6 PUFAs比值分别为1∶4、1∶5和1∶6的奶牛,在n-3与n-6 PUFAs比值为1∶4时采食量、产奶量和乳成分达到最大值,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理后血浆中IL-6含量随饲粮中n-3 PUFAs比例增加而降低。另外,Sun等[14]研究发现,采食产前饲粮中n-3与n-6 PUFAs比值分别为1∶0.64、1∶1.68和1∶3.24,以及产后饲粮中n-3与n-6 PUFAs比值分别为1∶1.59、1∶4.89和1∶8.15的奶牛,采食n-3 PUFAs比例高的饲粮可以增加奶牛围产期血液中性粒细胞的数量,降低IL-1β含量,提高产奶量。Welboren等[35]研究发现,相比n-3与n-6 PUFAs比值为1∶40的代乳粉,采食n-3与n-6 PUFAs比值为1∶6.5的代乳粉犊牛回肠组织中Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)和CD14的表达水平更高,LPS处理后血浆IL-4含量更低。综上所述,提高饲粮中n-3 PUFAs比例对免疫系统产生了更积极的影响。但是不同泌乳期的奶牛、泌乳牛和犊牛饲粮中n-3与n-6 PUFAs比值差异非常大,且n-3与n-6 PUFAs的相互作用对机体脂质代谢、免疫功能和生产性能的影响尚不明确,应针对不同阶段奶牛的生理特征确定饲粮中适宜的n-3与n-6 PUFAs比值,以促进奶牛的生长发育和健康。
表1 PUFAs对奶牛免疫功能和生产性能的影响Table 1 Effects of PUFAs on immune function and performance of dairy cows |
| 多不饱和脂肪酸类型 Types of PUFAs | 添加量(干物质基础) Addition (DM basis) | 试验动物 Trial animal | 对免疫功能的影响 Effects on immune function | 对生产性能的影响 Effects on performance | 参考文献 Reference |
|---|---|---|---|---|---|
| α-亚麻酸 ALA | 64 g/d | 围产期荷 斯坦奶牛 | 血浆ALA和n-3多不饱和脂肪酸(PUFAs) 含量↑,血浆总脂联素含量↓, 子宫内膜的炎症状态←→ | 产奶量↑,乳蛋白率、乳脂 率←→,产犊至受孕的间隔↓ | Pereira等[36] |
| 产前700 g/d挤压亚麻籽, 产后6.4%挤压亚麻籽 | 围产期荷 斯坦奶牛 | 补体因子I、D、H,补体成分 C7链和C8β链蛋白丰度↓ | — | Dos等[37] | |
| 6.5%亚麻籽 | 弗里斯兰奶牛 | 抗卵清蛋白的免疫球蛋白(Ig)G含量↑,白细胞 介素(IL)-10含量↓,IL-1β、IL-6含量←→ | — | Caroprese等[19] | |
| 3.5%挤压亚麻籽 | 围产期荷 斯坦奶牛 | 产前血液中性粒细胞计数↑,产后中性粒细胞 比例↑,产前和产后血清IL-1β含量↓ | 产奶量↑ | Sun等[14] | |
| 700 g/d膨化亚麻籽 | 围产期荷 斯坦奶牛 | 血清IL-6和IL-17α含量、产后白细胞 比例↓,脂肪组织中炎症蛋白质数量↓、 内源性大麻素系统(ECS)成分↓ | — | Kra等[16] | |
| 2%亚麻籽油 | 荷斯坦犊牛 | IL-4表达↓,IL-8表达有降低趋势 | 体增重、饲料效率←→ | Karcher等[17] | |
| 二十二碳六烯酸、 二十碳五烯酸 DHA and EPA | 1.5%鱼油 | 产后荷斯坦母牛 | 中性粒细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量↓ | — | Silvestre等[24] |
| 2%鱼油 | 荷斯坦犊牛 | TNF-α表达有降低趋势 | 体增重、饲料效率←→ | Karcher等[17] | |
| 二十二碳六烯酸 DHA | 9、18、27 g/d | 荷斯坦犊牛 | IL-1β、p65亚基、TNF-α、血清IgG含量呈线性下降 趋势,血清IgA、IgM含量←→ | 平均日增重(ADG)、 粪便评分呈线性↓ | Flaga等[7] |
| α-亚麻酸、二十二 碳六烯酸、二十碳五烯酸 ALA, DHA and EPA | 30、60、120 mL亚麻籽油与 鱼油1∶1混合 | 荷斯坦犊牛 | 血浆脂氧素A4含量↑, 异前列腺素含量↓ | 体增重←→ | Opgenorth 等[21] |
| α-亚麻酸、亚油酸 ALA and LA | 产前和产后分别摄入 亚麻籽6%和8%; 生大豆12%和16% | 围产期荷斯坦奶牛 | 白细胞和单核细胞的吞噬能力、单核细胞的 吞噬活性,辅助性T细胞、细胞毒性 T细胞和CD62黏附分子的比例↑ | 干物质采食量(DMI)、 产奶量←→,产后能量平衡↑ | Gandra等[15] |
| 亚油酸 LA | 12% | 围产期荷 斯坦奶牛 | 产后血液中CD3+和CD8+细胞比例↑,中性 粒细胞对大肠杆菌的吞噬能力↑ | 生产性能←→ | Gardinal等[23] |
| 1.5%红花油钙盐 | 围产期荷 斯坦奶牛 | 中性粒细胞黏附分子表达、TNF-α和IL-1β生成、 杀菌活性、结合珠蛋白和纤维蛋白原含量↑ | 产奶量↑ | Silvestre等[24] Silvestre等[25] | |
| 共轭亚油酸 CLA | 10~15 g/d cis-9,trans-11 CLA和trans-10,cis-12 CLA 1∶1混合 | 产后北欧红奶牛 | 炎症标志物 总胆红素含量↓ | 能量校正乳 产量、乳脂率↓ | Bayat等[30] |
↑:升高 increase;↓:降低 decrease;←→:无显著变化 no significant change;—:无此项 no such item。 |
4 PUFAs影响免疫功能的机制
4.1 PUFAs的代谢物影响免疫功能
乙酰化的环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)催化n-3 PUFAs中的EPA生成消退素E(resolvin E,RvE),催化DHA生成消退素D(resolvin D,RvD);15-脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)催化DHA生成RvD和保护素D(protectin D,PD);12-LOX催化DHA生成Maresin。RvE、RvD、PD和Maresin可以抑制促炎细胞因子产生,发挥抗炎并促进炎症消退的作用。其中,RvE能够抑制中性粒细胞活化、迁移,减少细胞因子IL-12生成;RvD能够维持内皮细胞完整性;PD能够促进巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞[39];Maresin能够限制中性粒细胞浸润、黏附,抑制核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)活化[38]。
n-6 PUFAs中的ARA在COX-2催化下生成前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)和血栓素B2;在5-LOX催化下生成白三烯4(leukotriene 4,LT4);在15-LOX催化下生成LXA4。PGE2对免疫细胞发挥着复杂的调节作用,在炎症反应中参与抗炎和促炎2个方向的调节过程,这与免疫细胞的类型和分化阶段及细胞所处的环境有关。此外,PGE2还具有免疫抑制的作用,能显著降低T细胞的增殖,上调免疫抑制分子的表达[40],并抑制B细胞和NK细胞的增殖、活化[41-42]。LT4可以促进白细胞趋化、迁移,促进促炎细胞因子产生[43]。LXA4具有强抗炎作用,可抑制粒细胞趋化、迁移,阻止IL-1β和TNF-α诱导的细胞间黏附分子生成[44]。因此,n-3 PUFAs产生的氧脂有抗炎和促进炎症消退的作用,n-6 PUFAs产生的多数氧脂具有促炎作用,但是氧脂的作用复杂,且具有细胞特异性,需具体分析。
n-6 PUFAs家族的ARA可以合成花生四烯酸乙醇胺(arachidonoylethanolamide,AEA)和2-花生四烯酸甘油(2-arachidonoylglycerol,2-AG),n-3 PUFAs可以合成二十二碳六烯酸乙醇胺和二十碳五烯酸乙醇胺,这几种代谢产物属于内源性大麻素(endocannabinoid,eCB)。哺乳动物内源性大麻素系统(endocannabinoid system,ECS)由大麻素受体(cannabinoid receptor,CB)、内源性配体(即eCB)及合成和降解eCB的酶组成,参与机体能量代谢、免疫功能和生殖的调节[45]。AEA和2-AG是最具代表性的eCB,主要激活免疫细胞的CB2,通过影响免疫细胞的迁移、增殖、死亡及细胞因子分泌调节免疫功能。补充ALA可以降低奶牛血浆AEA、子宫内膜2-AG[37]、白细胞中CB1的表达[16]和ECS的激活水平[46],降低血清促炎细胞因子[16,46]、补体蛋白质的含量[37]。但是ECS或PUFAs对奶牛免疫系统的调节作用非常复杂,PUFAs通过ECS途径对免疫功能产生的影响仍需进一步阐明。
4.2 PUFAs影响免疫细胞膜磷脂结构和功能
DHA和EPA通过细胞膜重组直接影响T细胞功能。T细胞脂筏中以酰化作用保留着一些关键的信号转导蛋白质,如T细胞活化连接蛋白(linker for activation in T cells,LAT)。体外研究表明,DHA和EPA容易酯化到脂筏和膜磷脂上,导致LAT的磷酸化受到抑制,LAT从脂筏中被移除,这些效应可能导致T细胞增殖减少,IL-2生成减少,炎症反应减轻[48]。此外,DHA可以通过脂筏介导的机制抑制巨噬细胞TLR4功能和促炎通路的激活[49]。TLR4受到LPS刺激时与LPS结合,刺激TLR4二聚化并迁移进入脂筏,与衔接蛋白髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)相互作用,启动信号转导,激活促炎基因转录。此外,DHA酰基链还可以整合到非脂筏区域,将胆固醇分子从非脂筏区域转移到脂筏中,使脂筏区域增大,并增加脂筏的有序性[50],这些变化可能会抑制TLR4的二聚化及其合并到脂筏的过程,从而阻断TLR4激活及下游信号通路传递。但是PUFAs和免疫细胞种类繁多,不同PUFAs对不同免疫细胞膜脂筏的影响仍不明确,需要基于啮齿动物模型、细胞培养和仿生膜等技术对PUFAs控制脂筏结构的机制开展进一步研究。
4.3 PUFAs影响基因的转录激活
免疫原与受体配接后启动信号转导,引起基因转录激活和产物表达,开启免疫应答。信号转导级联反应最终激活转录因子,激活的转录因子随即进入细胞核与特定的DNA序列结合,启动基因转录。不同免疫细胞、同一细胞不同基因的转录因子不同,主要是NF-κB。饲粮中补充n-3 PUFAs的奶牛NF-κB的p65亚基丰度降低[7,51]、NF-κB信号通路下调,NF-κB的激活被抑制。NF-κB信号通路中,TLR4与MyD88作用后激活κB抑制因子激酶(inhibitor of kappa B kinase,IKK),活化的IKK会磷酸化κB抑制因子(inhibitor of kappa B,IκB),触发IκB泛素化降解,释放NF-κB的p65亚基进入细胞核,启动炎性基因转录,诱发炎症[52]。DHA和EPA通过改变细胞膜脂筏结构抑制TLR4二聚化及TLR4合并入脂筏,导致TLR4无法与MyD88相互作用,MyD88通过IKK途径激活启动信号转导激活NF-κB受阻,促炎基因转录受到抑制。此外,AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)磷酸化可以阻断IκB磷酸化和NF-κB入核[53],EPA的氧脂物质12-羟基二十碳五烯酸可以通过激活AMPK磷酸化,抑制NF-κB信号通路[54]。
此外,PUFAs与过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)相互作用,发挥免疫调节作用。PPARs属于核受体家族,依赖配体激活,参与机体免疫调节、糖代谢和抗肿瘤等多种生理病理过程[55]。DHA、CLA、LA和ARA等PUFAs是PPARs的天然配体,PUFAs激活PPARs后,与类视黄醇X受体结合为异源二聚体,调控免疫反应靶基因活性[56];或调节NF-κB的活性影响细胞因子表达和炎症反应。如CLA可以通过激活PPARs抑制NF-κB信号通路,进而抑制促炎性细胞因子[32,57],也可减轻大肠杆菌刺激后牛乳腺上皮细胞的炎症[58]。
5 小结与展望
n-3 PUFAs可以促进奶牛免疫细胞增殖、增强免疫应答、减少促炎细胞因子产生,发挥抗炎和促进炎症消退的作用,并可以维持或提高生产性能;n-6 PUFAs中的LA有提高奶牛免疫细胞数量和功能、增强免疫反应的作用,CLA发挥了抗炎作用。n-3 PUFAs有利于减轻慢性或不受控制的炎症带来的损伤,n-6 PUFAs有助于应对剧烈的病原菌入侵。PUFAs主要通过生成氧化脂质和合成代谢物、控制细胞膜磷脂结构、介导细胞内信号转导、影响基因转录激活的机制调节奶牛免疫功能。
PUFAs对奶牛免疫系统的影响非常复杂,未来可深入开展以下研究:1)明确在不同基础饲粮和环境下,优化不同阶段奶牛免疫功能的饲粮n-3和n-6 PUFAs最适添加类型、添加量和配比;2)挖掘PUFAs影响免疫功能的机制,在分子水平上精准调控奶牛免疫系统;3)阐明奶牛胃肠道微生物和PUFAs、免疫系统的相互作用,制定提高奶牛免疫功能的营养调控策略,以进一步提升奶牛健康水平,提高生产性能。
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