动物营养学报 >

2026 , Vol. 38 >Issue 5: 3730 - 3746

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2026.299

研究论文

基于网络药理学、分子对接与动物试验探究辣木叶缓解蛋鸡脂肪肝出血综合征的作用机制

  • 黄睿彤 , 1 ,
  • 董雯雯 2, 3, * ,
  • 张玉霞 2 ,
  • 袁小远 2 ,
  • 孟凯 2 ,
  • 齐佳佳 2 ,
  • 尹振晨 2, 3 ,
  • 徐宇良 2 ,
  • 田野 2 ,
  • 朱应波 4 ,
  • 李桂明 , 2, 5, ** ,
  • 白莹 , 1, **
展开
  • 1 河北工程大学生命科学与食品工程学院, 邯郸 056038
  • 2 山东省农业科学院家禽研究所, 山东省主要畜禽育种重点实验室,济南市农业实验动物与比较医学重点实验室, 济南 250100
  • 3 国家盐碱地综合利用技术创新中心, 东营 257347
  • 4 东营蓝海生态养殖有限公司, 东营 257100
  • 5 山东蓝海生态农业有限公司, 东营 257100
**李桂明,研究员,硕士生导师,E-mail: ;
白 莹,教授,硕士生导师,E-mail:

*同等贡献作者

黄睿彤(2000—),女,江苏南京人,硕士研究生,研究方向为动物营养与饲料。E-mail:

Office editor: 菅景颖

收稿日期: 2025-09-30

  网络出版日期: 2026-05-14

基金资助

山东省重点研发计划项目(2022LZGC013)

山东省重点研发计划项目(2024SFGC0403)

山东省重点研发计划项目(2024TZXD029)

泰山产业领军人才项目(TSCX202306046)

农业科技研究项目2024(GG202408)

山东省农业科学院农业科技创新工程(CXGC2025B03)

山东省农业科学院农业科技创新工程(CXGC2025G07)

山东省农业科学院农业科技创新工程(CXGC2024C11)

山东省农业科学院农业科技创新工程(CXGC2025H10)

济南“新高校”二十条项目(202228037)

济南市科技计划“揭榜挂帅”项目(202527075)

山东省重点研发计划(竞争性创新平台)项目(2025CXPT162)

收起

Exploring Mechanism of Moringa oleifera Lam. Leaves in Alleviating Fatty Liver Hemorrhagic Syndrome in Laying Hens Based on Network Pharmacology, Molecular Docking and Animal Experiment

  • HUANG Ruitong , 1 ,
  • DONG Wenwen 2, 3 ,
  • ZHANG Yuxia 2 ,
  • YUAN Xiaoyuan 2 ,
  • MENG Kai 2 ,
  • QI Jiajia 2 ,
  • YIN Zhenchen 2, 3 ,
  • XU Yuliang 2 ,
  • TIAN Ye 2 ,
  • ZHU Yingbo 4 ,
  • LI Guiming , 2, 5, ** ,
  • BAI Ying , 1, **
Expand
  • 1 School of Life Sciences and Food Engineering, Hebei University of Engineering, Handan 056038, China
  • 2 Jinan Key Laboratory of Agricultural Laboratory Animals and Comparative Medicine, Shandong Provincial Key Laboratory of Livestock and Poultry Breeding, Poultry Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Ji’nan 250100, China
  • 3 National Center of Technology Innovation for Comprehensive Utilization of Saline-Alkali Land, Dongying 257347, China
  • 4 Dongying Blue Sea Ecological Agriculture Co., Ltd., Dongying 257100, China
  • 5 Dongying Blue Sea Ecological Aquaculture Co., Ltd., Dongying 257100, China
**LI Guiming, professor, E-mail: ;
BAI Ying, professor, E-mail:

*Contributed equally

Received date: 2025-09-30

  Online published: 2026-05-14

Fold

摘要

本研究旨在探究辣木叶缓解蛋鸡脂肪肝出血综合征(FLHS)的作用机制。首先,运用网络药理学方法对辣木叶缓解FLHS的关键作用靶点和信号通路进行预测;其次,利用分子对接技术对辣木叶的活性成分与核心靶点的结合活性进行验证;最后,通过动物试验进一步验证辣木叶对蛋鸡FLHS的缓解效果及作用机制。结果显示:辣木叶的59个活性成分经372个关键作用靶点,通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、叉头框蛋白O亚家族(FoxO)、细胞凋亡等30条关键信号通路,参与缓解FLHS,其中MAPK信号通路关联靶点最多;分子对接结果揭示,辣木叶活性成分异槲皮苷与核心靶点Src非受体酪氨酸激酶(SRC)、信号转导和转录激活因子3(STAT3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(BCL2)结合形成的分子构象稳定。动物试验结果表明,相较于饲喂高能量低蛋白质饲粮的蛋鸡,饲喂添加5.0%或10.0%辣木叶的高能量低蛋白质饲粮的蛋鸡肝脏组织中脂滴面积占细胞总面积的比例显著降低(P<0.05),血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活性显著降低(P<0.05),肝脏中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)含量显著下降(P<0.05),且肝脏中MAPK信号通路关键基因细胞外信号调节激酶(ERK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。上述结果表明,辣木叶可通过异槲皮苷等活性成分作用于SRC、STAT3等核心靶点,调控MAPK等信号通路,降低肝脏脂质沉积与损伤,达到缓解蛋鸡FLHS的目的,该结果可为蛋鸡FLHS的防治和辣木资源开发提供理论依据。

关键词： 辣木叶; 脂肪肝出血综合征; 网络药理学; 分子对接; 动物试验

本文引用格式

黄睿彤 , 董雯雯 , 张玉霞 , 袁小远 , 孟凯 , 齐佳佳 , 尹振晨 , 徐宇良 , 田野 , 朱应波 , 李桂明 , 白莹 . 基于网络药理学、分子对接与动物试验探究辣木叶缓解蛋鸡脂肪肝出血综合征的作用机制[J]. 动物营养学报, 2026 , 38(5) : 3730 -3746 . DOI: 10.12418/CJAN2026.299

Abstract

This study aimed to investigate the mechanism by which Moringa oleifera Lam. leaves (MOL) alleviate fatty liver hemorrhagic syndrome (FLHS) in laying hens. Initially, network pharmacology was employed to predict the key targets and signaling pathways involved in the alleviation of FLHS by MOL. Subsequently, molecular docking technology was used to validate the binding affinity between the active ingredient of MOL and the core targets. Finally, an animal experiment was conducted to further verify the alleviating effects of MOL on FLHS in laying hens and to elucidate the mechanism. The results showed that 59 active ingredients from MOL acted on 372 core targets and were involved in alleviating FLHS through 30 key signaling pathways, including the mitogen-activated protein kinase (MAPK), forkhead box protein O (FoxO) and apoptosis. Among these, the MAPK signaling pathway was associated with the largest number of targets. Molecular docking results revealed that isoquercitrin, an active ingredient in MOL, formed stable molecular conformations with the core targets Src non-receptor tyrosine kinase (SRC), signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) and B-cell lymphoma/leukemia 2 protein (BCL2). The animal experiment results demonstrated that, compared with laying hens fed a high-energy low-protein diet, those fed the same diet supplemented with 5.0% or 10.0% MOL showed a significant reduction in the percentage of lipid droplet area to total cell area in liver tissue (P<0.05); additionally, serum aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) activities were significantly decreased (P<0.05), and liver triglyceride (TG) and total cholesterol (TC) contents were significantly reduced (P<0.05); furthermore, the mRNA relative expression levels of key genes in the MAPK signaling pathway, including extracellular signal-regulated kinase (ERK), p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK) and c-Jun N-terminal kinase (JNK), were significantly downregulated in the liver (P<0.05). These findings suggest that MOL can alleviate FLHS in laying hens by reducing hepatic lipid deposition and injury through active ingredients such as isoquercitrin, which act on core targets like SRC and STAT3 and regulate signaling pathways including MAPK. This result provides a theoretical basis for the prevention and treatment of FLHS in laying hens and for the development of Moringa oleifera Lam. resources.

Key words： Moringa oleifera Lam. leaves; fatty liver hemorrhage syndrome; network pharmacology; molecular docking; animal experiment

蛋鸡脂肪肝出血综合征(FLHS)作为全球集约化养殖业中高发的营养代谢性疾病,以肝脏脂肪过度沉积、氧化应激损伤及出血为特征,导致蛋鸡产蛋率下降、死亡率升高,给产业造成巨大经济损失[1-2]。已有文献报道,蛋鸡FLHS的核心诱因在于肝脏脂质的摄入与合成速率超过其转运和分解能力,进而引发脂质代谢稳态失衡,最终造成大量脂质成分在肝细胞内异常沉积[3];产蛋鸡患有FLHS时,肝脏组织内会蓄积大量游离脂肪酸,此类物质可攻击生物膜系统并引发脂质过氧化反应,造成细胞膜结构与功能损伤,最终诱导肝细胞发生氧化应激性损伤[4]。国内外关于蛋鸡FLHS的相关研究已取得较多进展,但蛋鸡FLHS的诱发因素具有多元性,涉及氧化应激、脂质代谢紊乱、激素失衡等多方面因素,且不同品种、生长阶段的蛋鸡对药物的反应存在差异[1,5-6]。这给药物研发带来了极大挑战。因此,寻找一种合适的安全药物治疗FLHS,已成为当前蛋鸡养殖业亟待解决的关键问题。
辣木(Moringa oleifera Lam.)是辣木科辣木属的一年生或多年生热带落叶乔木,原产于印度西北部半干旱热带区域,现在我国云南、广东、福建等地已形成规模化栽培[7]。辣木叶(MOL)中黄酮类(如槲皮素、山奈酚、木犀草素)和多酚类(如绿原酸、白藜芦醇、原儿茶酸)化合物以及多种有机酸类物质含量丰富,这些成分通过清除自由基、抑制脂质过氧化、调节脂质代谢关键酶活性,在抗氧化、抗炎、降脂等方面展现出显著效果[8]。研究表明,辣木叶可通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/乙酰辅酶A羧化酶(ACC)通路抑制脂肪酸合成,同时上调过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)表达促进脂肪酸氧化,从而减少肝脏脂肪沉积,其含有的β-谷甾醇可抑制胆固醇合成酶活性,降低胆固醇吸收,进一步改善脂质代谢紊乱[9-10]。饲粮中添加辣木叶可显著降低肠道中厚壁菌门/拟杆菌门比例,同时促进短链脂肪酸(SCFAs)产生,通过激活游离脂肪酸受体2(FFA2,又称GPR43)和AMPK信号通路改善脂质代谢[11]。饲粮中添加5%辣木叶使肉鸡血清总抗氧化能力(T-AOC)显著提升,丙二醛(MDA)含量显著下降,通过抑制核因子-κB(NF-κB)信号通路减轻炎症反应[12]。基于现有研究推断,辣木叶可以作为潜在的缓解FLHS的药物,但是其具体的作用机制尚未明确。
网络药理学作为新兴学科,整合了多组学数据和生物信息学技术,能够系统地解析药物活性成分、作用靶点与疾病之间的复杂网络关系,从整体层面揭示药物的作用机制[13]。本研究将运用网络药理学方法对辣木叶缓解FLHS的关键靶点和信号通路进行预测,并利用分子对接技术对辣木叶的活性成分与靶点的结合活性进行验证,最后通过高能量低蛋白质饲粮诱导蛋鸡FLHS,并在饲粮中添加不同水平的辣木叶,进一步验证辣木叶对蛋鸡FLHS的防治效果及作用机制,旨在为防控蛋鸡FLHS提供新的思路和方法,为蛋鸡健康养殖提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 辣木叶活性成分及其潜在作用靶点的筛选

首先,通过查阅相关文献资料[14-15],整理辣木叶活性成分信息,随后登录PubChem数据库(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)获取活性成分对应的化学结构式。将结构数据逐一导入SwissADME在线分析平台(http://www.swissadme.ch),以分子质量(MW)≤500 Da、脂水分配系数(LogP)≤5、氢键供体(HBD)≤5、氢键受体(HBA)≤10、拓扑极性表面积(TPSA)≤140 Å2以及肠道吸收率≥30%为筛选标准,依据预设的筛选条件,筛选出辣木叶中的活性成分,并配置好相应的预测参数。对于标记为“soluble(可溶)”“soluble/very(易溶/高度)”、“soluble/highly(易溶/极高度)”的化合物,均视为辣木叶中可能具备生物活性的成分。利用SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch)查询活性成分对应的潜在作用靶点,同时借助Uniprot数据库(https://www.uniprot.org)对这些靶点信息进行规范化处理[16]。

1.2 辣木叶缓解FLHS的作用靶点的确定

在GeneCards数据库(https://www.genecards.org)中,借助关键词“Fatty liver synd”展开搜索,挑选出Relevance(相关性)数值超过中位数2倍的靶点。利用CTD数据库(https://ctdbase.org)中的MyVenn模块,对辣木叶活性成分潜在作用靶点与FLHS相关靶点进行交集分析,并绘制韦恩图。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的构建及核心靶点的筛选

利用STRING数据库(https://string-db.org)获取辣木叶活性成分潜在作用靶点与FLHS相关靶点的交集靶点的PPI数据,将PPI数据导入Cytoscape 3.7.2软件,运用其CytoNCA插件开展网络拓扑分析,通过评估接近中心性、介数中心性、度中心性、特征向量中心性等网络中心性指标,筛选出关键作用靶点,并运用Cytoscape 3.7.2软件对PPI网络进行可视化呈现。

1.4 关键作用靶点的KEGG通路和GO功能富集分析

将筛选出的关键作用靶点导入到DAVID数据库(https://davidbioinformatics.nih.gov),物种和基因背景设定为“Gallus gallus”,进行GO功能注释和KEGG通路富集分析,以P<0.05为阈值筛选显著富集的代谢通路,即为辣木叶缓解蛋鸡FLHS所涉及的主要代谢通路。采用R语言的ggplot2包绘制关键作用靶点的GO功能富集图,采用clusterProfiler包绘制KEGG显著富集通路与关键作用靶点的关联图。

1.5 辣木叶活性成分干预FLHS核心靶点的分子对接验证

依据PPI网络筛选出辣木叶中度值最高的活性成分,并对其与核心靶点开展分子对接研究。具体步骤包括:先通过PDB数据库获取候选活性成分的二维结构,随后运用Chem3D软件优化其三维构型;接着从PDB官网(https://www.rcsb.org/structure)下载关键靶点的PDB文件,使用PyMOL 2.5.2软件完成去水及去配体操作;再采用Autodock Tools 1.5.6软件对受体蛋白进行加氢、平衡电荷等修饰,将受体蛋白和配体小分子分别转化为PDBQT格式;最后利用Autodock Vina 1.1.2软件对受体蛋白与配体小分子进行分子对接,并在PLIP官网(https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index)分析对接结果。

1.6 动物试验验证辣木叶对蛋鸡FLHS的缓解效果及作用机制

1.6.1 试验设计

动物试验获得山东省农业科学院批准(批准编号为SAAS-2023-G32),试验在山东省无特定病原鸡研究中心进行。挑选450只450日龄的健康海兰褐蛋鸡,要求其体重和产蛋率均处于相近水平,在经过10 d的适应性饲养后随机分为6个组,每组5个重复,每个重复15只鸡,各重复均匀分布于鸡舍。5组蛋鸡分别饲喂基础饲粮(BD组)、基础饲粮+10%辣木叶(BD+MOL10组)、高能量低蛋白质饲粮(HELP组)、高能量低蛋白质饲粮+2.5%辣木叶(HELP+MOL2.5组)、高能量低蛋白质饲粮+5.0%辣木叶(HELP+MOL5组)、高能量低蛋白质饲粮+10.0%辣木叶(HELP+MOL10组)。按表1配方配制基础饲粮和高能量低蛋白质饲粮,其中基础饲粮的代谢能(11.21 MJ/kg)参照《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)设定,粗蛋白质水平(15.86%)参照《产蛋鸡和肉鸡配合饲料》(GB/T 5916—2020)设定;高能量低蛋白质饲粮的代谢能(12.97 MJ/kg)和粗蛋白质水平(12.00%)参照文献[17]设定,该饲粮可引发蛋鸡FLHS。试验期为85 d,试验期间蛋鸡自由采食和饮水。
表1 基础饲粮与高能量低蛋白质饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet and high-energy low-protein diet (air-dry basis)%

项目
Items		 基础饲粮
Basal diet		 高能量低
蛋白质饲粮
High-energy
low-protein diet
原料 Ingredients
玉米 Corn 64.50 69.70
豆粕 Soybean meal 24.00 14.58
玉米油 Corn oil 4.22
石粉 Limestone 8.00 8.00
磷酸氢钙 CaHPO4 1.20 1.20
食盐 NaCl 0.30 0.30
预混料 Premix1) 2.00 2.00
合计 Total 100.00 100.00
营养水平 Nutrient levels2)
代谢能 ME/(MJ/kg) 11.21 12.97
粗蛋白质 CP 15.86 12.00
钙 Ca 3.43 3.61
有效磷 AP 0.51 0.46
精氨酸 Arg 1.03 0.74
蛋氨酸 Met 0.38 0.36
赖氨酸 Lys 0.93 0.69
缬氨酸 Val 0.77 0.58
蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys 0.67 0.56

1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of diets:Cu 2.50 mg,Fe 20.00 mg,Zn 17.50 mg,Mn 15.00 mg,KI 4.00 mg,Na2SeO3 6.00 mg,CoCl2·6H2O 2.50 mg,Cr 2.00 mg,NaCl 200.00 mg,植酸酶 phytase 10.00 mg,激肽酶 kininase 7.50 mg,抗氧化剂 antioxidant 2.00 mg,甜菜碱 betaine 15.00 mg,胆碱 choline 50.00 mg,蛋氨酸 Met 50.00 mg,沸石粉 zeolite powder 76.00 mg。

2)粗蛋白质(GB/T 18868—2024)、钙(GB/T 6436—2018)为参照对应国标方法所得测定值,其余为参照《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)所得计算值。CP (GB/T 18868—2024) and Ca (GB/T 6436—2018) were determined using the corresponding national standard methods, while the others were calculated in accordance with the Feeding Standard of Chicken (NY/T 33—2004).

1.6.2 检测指标与方法

1.6.2.1 血清中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活性

饲养试验结束后,从各组中随机选取10只蛋鸡进行心脏采血操作,随后分离血清样本,借助全自动生化分析仪(BS-360E,深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)对血清中AST和ALT活性进行测定。

1.6.2.2 肝脏组织病理变化

将采血后的蛋鸡解剖,采集肝脏组织,在预冷的生理盐水(4 ℃)中漂洗后用滤纸拭干。取部分肝脏组织样本,经4%甲醛溶液固定后进行石蜡包埋处理,并采用油红O染色法进行染色,在正置光学显微镜(Eclipse Ci-L,Nikon,日本)下观察组织的病理变化,并采集图像。利用Image J 1.53e软件,通过荧光定量法统计脂滴面积占细胞总面积的比例。

1.6.2.3 肝脏中脂质含量

取在-80 °C冰箱中保存肝脏组织样本,称取0.2 g放入烧杯中,在冰水浴环境中加入9倍体积的无水乙醇,使用高通量组织研磨器(JXFSTPRP-24,上海净信实业发展有限公司)进行匀浆后1 100×g离心10 min后收集上清液,参照试剂盒(南京建成生物工程研究所)的说明书检测上清液中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)含量。

1.6.2.4 肝脏中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路关键基因的mRNA相对表达量

按照SimplyP总RNA提取试剂盒(BSC52M1,杭州博日科技股份有限公司)的说明书进行肝脏组织总RNA提取,并使用Evo M-MLV反转录预混型试剂盒(AG11728,湖南艾科瑞生物工程有限公司)将提取的RNA反转录为cDNA。通过NCBI平台(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)设计目的基因的引物,并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因,引物序列见表2。以反转录反应所得cDNA为模板,使用SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒(AG11701,江苏艾迪生生物科技有限公司),利用PCR仪(CT014878,C1000 Touch Thermal Cycler,Bio-Rad,美国)进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)扩增,目的基因的mRNA相对表达量采用2-ΔΔCt法进行计算。
表2 引物序列

Table 2 Primer sequences

基因名称 Gene names 引物序列 Primer sequences (5'—3')
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 GAPDH F:TGCTGCCCAGAACATCATCC
R:ACGGCAGGTCAGGTCAACAA
p38丝裂原活化蛋白激酶 p38 MAPK F:GCATCCATCTTCGTCGTCAT
R:TCATCTACAGCAACCCAGAGG
细胞外信号调节激酶 ERK F:TGGTACAGGGCTCCTGAAAT
R:GGAAAGATGGGTCTGTTGGA
c-Jun氨基末端激酶 JNK F:CAGCAGTGAACAGCAGCGAGAG
R:CAGCGTCTGATCCGTGGACATG

1.6.3 数据统计分析

采用SPSS 19.0软件对试验数据进行统计分析。数据以“平均值±标准误(mean±SE)”的形式表示。统计分析时,先对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA),然后利用LSD法进行组间多重比较。以P<0.05作为差异具有统计学意义的判定标准。

2 结果与分析

2.1 辣木叶缓解FLHS的作用靶点的确定

辣木叶活性成分在SwissADME数据库筛选后,得到异槲皮苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、芦丁、山奈酚-3-O-芸香苷、山奈酚、咖啡酸、木犀草素、辣木素等59种活性成分;再利用SwissTargetPrediction数据库,识别出918个与辣木叶活性成分相关的潜在作用靶点。同时,在GeneCards数据库中使用“Fatty liver synd”作为关键词进行搜索并以Relevance数值超过中位数2倍作为筛选条件,共获得4 891个与FLHS相关的靶点。将918个辣木叶活性成分潜在作用靶点与4 891个FLHS相关靶点导入CTD数据库的MyVenn模块,分析出交集数据,基于该交集数据绘制韦恩图,最终得到580个交集靶点(图1),这些交集靶点即为辣木叶缓解蛋鸡FLHS的作用靶点。
图1 辣木叶活性成分潜在作用靶点与FLHS相关靶点的韦恩图

Fig.1 Venn diagram of potential targets of active components in MOL and FLHS-related targets

2.2 辣木叶缓解FLHS的PPI网络的构建及核心靶点的筛选

为明确靶基因间相互作用机制,并识别出关键的调控基因,在STRING数据库中输入获取的580个交集靶点,得到PPI网络图(图2)。通过STRING数据库映射,580个交集靶点中有497个被识别为节点,形成了1 158条边连接,预计边数为315,平均节点度为4.66,平均局部聚类系数为0.415。这些靶点是辣木叶在缓解FLHS过程中的核心作用点。
图2 辣木叶缓解FLHS靶点的PPI网络图

Fig.2 PPI network diagram of MOL targets for alleviating FLHS

将交集靶点导入Cytoscape 3.7.2软件,利用CytoNCA插件进行网络拓扑分析,通过网络中心性指标筛选出关键作用靶点,并构建辣木叶活性成分-FLHS关键作用靶点PPI网络图(图3),图中节点大小代表其度值大小,度值越大表示该靶点在网络中的关联性越紧密。基于该网络共识别出372个关键作用靶点,其中度值排名前6位的核心靶点分别为Src非受体酪氨酸激酶(SRC)、信号转导和转录激活因子3(STAT3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(BCL2)、白细胞介素6(IL6)、半胱天冬酶3(CASP3)和成纤维细胞生长因子2(FGF2)。
图3 辣木叶活性成分-FLHS关键作用靶点PPI网络图

限于篇幅,仅列出度值排名前6的靶点名称Due to space limitations, only the names of the top 6 targets ranked by degree value are listed。SRC:Src非受体酪氨酸激酶 Src non-receptor tyrosine kinase;STAT3:信号转导和转录激活因子3 signal transducer and activator of transcription 3;BCL2:B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白 B-cell leukemia/lymphoma 2;IL6:白细胞介素6 interleukin 6;CASP3:半胱天冬酶3 cysteine-aspartic protease 3;FGF2:成纤维细胞生长因子2 fibroblast growth factor 2 。

Fig.3 PPI network diagram of key targets for MOL active ingredients-FLHS

2.3 辣木叶缓解FLHS关键作用靶点的KEGG通路与GO功能富集分析

针对筛选出的辣木叶缓解FLHS的372个关键作用靶点,在DAVID数据库中开展KEGG通路以及GO功能富集分析。以P<0.05作为筛选条件,共筛选出30条显著富集的代谢通路,并借助R语言绘制出KEGG通路富集分析图(图4)。KEGG通路富集分析显示,辣木叶能够通过多条信号通路来发挥缓解FLHS的功效,主要涉及MAPK信号通路、黏着斑、细胞凋亡、叉头框蛋白O亚家族(FoxO)信号通路等,其中MAPK信号通路是关键作用靶点参与缓解FLHS过程中富集程度最高的通路。为深入探究其作用机制,采用R语言的clusterProfiler包对该MAPK信号通路进行可视化处理,结果见图5。
图4 KEGG通路富集分析气泡图

Fig.4 Bubble plot of KEGG pathway enrichment analysis

图5 关键作用靶点调控MAPK信号通路的机制

图中红色框标注的是辣木叶作用于MAPK信号通路的核心靶点,其中文名称及英文全称如下The red boxes in the figure indicated the core targets of MOL acting on the MAPK signaling pathway, and their Chinese names and full English names were as follows。GF:生长因子 growth factor;RTK:受体酪氨酸激酶 receptor tyrosine kinase;PKA:蛋白激酶A protein kinase A;Ras:大鼠肉瘤癌基因 rat sarcoma;CASP:半胱天冬氨酸蛋白酶 cysteine-aspartic protease;AP1:激活蛋白 1 activator protein 1;JUN:原癌基因Jun proto-oncogene Jun;p53:肿瘤蛋白p53 tumor protein p53;TGFβ:转化生长因子β transforming growth factor beta;TNF:肿瘤坏死因子 tumor necrosis factor;FASL:Fas配体Fas ligand;FAS:Fas细胞表面死亡受体 Fas cell surface death receptor;TNFR:肿瘤坏死因子受体 tumor necrosis factor receptor。

Fig.5 Mechanisms of key targets regulating MAPK signaling pathway

为明确关键作用靶点的功能特征,从生物学过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)3个类别进行了GO功能富集分析,并对3个类别中富集显著性排名前10的GO条目进行了可视化分析,结果如图6所示。在BP类别中,靶点主要富集于蛋白质磷酸化、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、多细胞生物发育等过程;在CC类别中,靶点主要涉及细胞质、细胞核、胞质溶胶等组分;在MF类别中,靶点则主要与ATP结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性及锌离子结合等功能相关。
图6 GO功能富集分析柱状图

Fig.6 Bar chart of GO functional enrichment analysis

2.4 辣木叶活性成分与核心靶点的分子对接结果

本部分以网络分析图度值排名第1的活性成分为配体,PPI网络图中度值排名前3的靶点蛋白为受体分别进行分子对接,即配体为异槲皮苷,受体分别为SRC、STAT3、BCL2。结合自由能为粒子从自由状态成为复合粒子时所释放的能量,即结合自由能越小,提示2个分子在自然状态下更容易结合,且稳定性越高。分子对接结果显示,辣木叶中的异槲皮苷与受体蛋白SRC、STAT3、BCL2的结合能均小于-5 kcal/mol(1 kcal/mol≈4.184 kJ/mol),提示分子构象稳定(表3)。由图7可知,SRC中的LYS-9、LYS-38与异槲皮苷形成疏水作用,LYS-9、GLU-33、SER-34、LYS-38与异槲皮苷形成氢键,LYS-9、LYS-38与小分子形成盐桥;STAT3中的ALA-44、ALA-106、LEU-109、TRP-110与异槲皮苷形成疏水作用,GLN-41、TRP-43、ALA44、ARG-107与异槲皮苷形成氢键;BCL2中的LEU-57、VAL-76、LEU-80与异槲皮苷形成疏水作用,HIS-50、ARG-90与异槲皮苷形成氢键。上述结果提示,异槲皮苷能以高亲和力与受体蛋白结合。
表3 辣木叶活性成分异槲皮苷与核心靶点蛋白的分子对接结果

Table 3 Results of molecular docking for active ingredient isoquercitrin from MOL with core target proteinskcal/mol

活性成分
Active ingredient		 结合自由能 Combined free energy
Src非受体酪氨酸激酶
SRC		 信号转导和转录激活因子3
STAT3		 B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白
BCL2
异槲皮苷 Isoquercitrin -5.8 -6.0 -6.6
图7 异槲皮苷与核心靶点蛋白最佳构象相互作用模式图

图A表示异槲皮苷与SRC的分子对接结果;图B表示异槲皮苷与STAT3的分子对接结果;图C表示异槲皮苷与BCL2的分子对接结果。

Fig.7 Schematic diagrams of optimal conformational interaction between isoquercitrin and core target proteins

Figure A shows the molecular docking result between isoquercitrin and SRC; figure B shows the molecular docking result between isoquercitrin and STAT3; figure C shows the molecular docking result between isoquercitrin and the BCL2.

2.5 辣木叶缓解蛋鸡FLHS的动物试验结果

2.5.1 辣木叶对饲喂高能量低蛋白质饲粮蛋鸡肝脏组织病理变化的影响

由图8可知,与BD组相比,HELP组肝脏组织中脂滴面积占细胞总面积的比例显著升高(P<0.05),BD+MOL10组则无显著变化(P>0.05);与HELP组相比,高能量低蛋白质饲粮中添加不同水平的辣木叶均显著降低了肝脏组织中脂滴面积占细胞总面积的比例(P<0.05)。上述结果提示,高能量低蛋白质饲粮使蛋鸡肝脏脂肪变性,而辣木叶则缓解了高能量低蛋白质饲粮诱导的肝脏脂肪变性。
图8 各组蛋鸡肝脏组织病理变化情况

图A为肝脏组织的油红O染色切片,图中箭头指示的是脂滴;图B表示肝脏组织中脂滴面积占细胞总面积的比例。数据柱标注相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同字母表示差异显著(P<0.05)。图9同。

Fig.8 Pathological changes in liver tissue of laying hens from each group

Figure A shows oil red O-stained sections of liver tissue, with the arrows indicating lipid droplets; figure B represents the percentage of lipid droplet area to total cell area in the liver tissue. Data bars with the same letter are not significantly different (P>0.05), while those with different letters are significantly different (P<0.05). The same as Fig.9.

2.5.2 辣木叶对饲喂高能量低蛋白质饲粮蛋鸡血清中AST和ALT活性的影响

由表4可知,与BD组相比,HELP组血清中AST和ALT活性显著升高(P<0.05),BD+MOL10组则无显著变化(P>0.05);与HELP组相比,高能量低蛋白质饲粮中添加不同水平的辣木叶均逆转了高能量低蛋白质饲粮引起的血清中AST和ALT活性的显著升高(P<0.05)。上述结果提示,高能量低蛋白质饲粮导致蛋鸡肝脏损伤,而辣木叶则缓解了高能量低蛋白质饲粮引起的肝脏损伤。
表4 各组蛋鸡血清中AST和ALT活性

Table 4 Serum AST and ALT activities of laying hens from each groupU/L

项目
Items		 组别 Groups
BD BD+
MOL10		 HELP HELP+
MOL2.5		 HELP+
MOL5		 HELP+
MOL10
谷丙转氨酶ALT 11.20
±0.41b		 13.41
±1.10ab		 16.43
±0.52a		 12.22
±1.78bc		 8.56
±2.06c		 9.96
±0.77c
谷草转氨酶AST 136.88
±1.41b		 140.22
±12.99b		 201.68
±8.69a		 129.03
±15.82b		 129.42
±9.10b		 140.57
±3.30b

同行数据肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.5.3 辣木叶对饲喂高能量低蛋白质饲粮蛋鸡肝脏中脂质含量的影响

由表5可知,与BD组相比,HELP组肝脏中TG、TC含量显著增加(P<0.05),BD+MOL10组则无显著变化(P>0.05);与HELP组相比,高能量低蛋白质饲粮中添加5.0%或10.0%的辣木叶则显著降低了肝脏中TG和TC含量(P<0.05)。上述结果提示,高能量低蛋白质饲粮导致蛋鸡肝脏脂质沉积,而添加5.0%或10.0%的辣木叶则可降低肝脏脂质含量。
表5 各组蛋鸡肝脏中脂质含量

Table 5 Lipid contents in liver of laying hens from each groupμmol/L

项目
Items		 组别 Groups
BD BD+
MOL10		 HELP HELP+
MOL2.5		 HELP+
MOL5		 HELP+
MOL10
甘油三酯 TG 11.30±0.90bc 8.89±0.46c 21.88±0.48a 14.52±0.74b 8.78±1.70c 8.25±1.72c
总胆固醇 TC 5.17±0.48b 4.88±1.49b 6.78±1.01a 6.24±0.41ab 5.45±0.86b 4.86±0.66b

2.5.4 辣木叶对饲喂高能量低蛋白质饲粮蛋鸡肝脏中MAPK信号通路关键基因表达的影响

由图9可知,与BD组相比,HELP组肝脏中细胞外信号调节激酶(ERK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)及c-Jun氨基末端激酶(JNK)的mRNA相对表达量显著升高(P<0.05),BD+MOL10组则无显著变化(P>0.05);与HELP组相比,高能量低蛋白质饲粮中添加2.5%、5.0%或10.0%的辣木叶均显著降低了上述基因的mRNA相对表达量(P<0.05)。上述结果表明,高能量低蛋白质饲粮可激活蛋鸡肝脏中MAPK信号通路关键基因的表达,进而介导脂质代谢紊乱;而在高能量低蛋白质饲粮中添加辣木叶则能够显著下调蛋鸡肝脏中MAPK信号通路中关键基因的表达,抵抗高能量低蛋白质饲粮诱导的MAPK信号通路的过度激活,从而缓解FLHS。
图9 各组蛋鸡肝脏中MAPK信号通路关键基因的mRNA相对表达量

Fig.9 mRNA relative expression levels of key genes in MAPK signaling pathway in liver of laying hens from each group

3 讨论

蛋鸡FLHS作为一种营养代谢性疾病,目前尚无公认的特效治疗药物,临床常用的胆碱、维生素E、硒等多为辅助预防或改善剂,难以逆转其病理进程[18-19],且其作用机制,如胆碱侧重甲基供体功能[20],这与辣木叶多成分、多靶点的调控模式存在显著差异,因此本研究未设置阳性药物组。相关研究已证实,天然产物的机制解析可通过空白组-模型组-梯度干预组的核心对照体系实现[21],这为本研究的方案设计提供了依据。采用高能量低蛋白质饲粮诱导FLHS,是目前公认的经典造模方法,其病理进程与蛋鸡FLHS自然发病特征高度契合,更贴近规模化养殖的生产实际[22]。高能量加速了肝脏脂质的合成,而蛋白质摄入不足则导致肝脏脂蛋白合成受阻,进而抑制肝细胞内脂肪的转运效率,最终造成脂质在肝脏内异常蓄积,诱发FLHS[23-24]。有研究指出,高能量低蛋白质饲粮诱导的FLHS需同时符合肝脏损伤出血、脂肪变性及血清脂质代谢紊乱,方可作为有效模型用于后续试验[25]。本研究中的动物试验发现,HELP组蛋鸡肝脏组织油红O染色切片中可见大量的红色脂滴,血清中肝脏损伤相关指标AST和ALT活性显著高于正常蛋鸡,且肝脏中脂质含量也显著增加,证明成功构建了蛋鸡FLHS模型,这与言凯等[26]、李炎林等[27]的研究结论一致。
辣木叶含有单宁、植酸等抗营养因子,过量摄入可能降低养分消化率并影响肝肾代谢[28],因此需明确蛋鸡对其的安全耐受剂量。研究表明,5%~10%的梯度剂量设计是确定禽用植物添加剂安全阈值的有效方法,其中10%剂量可用于验证安全边界[29]。另有报道指出,饲粮中添加10%辣木叶粉对蛋鸡生产性能、蛋品质及肝肾指标无不良影响,而15%及以上剂量则可能导致采食量下降和代谢紊乱[30]。本试验中,BD+MOL10组蛋鸡肝脏组织切片未见明显病理变化,血清AST、ALT活性及肝脏脂质含量均未显著升高,证实10%辣木叶为蛋鸡的安全应用剂量,且无蓄积毒性。该结果为辣木叶的饲料化推广提供了剂量安全性依据。
本研究运用网络药理学技术筛选出辣木叶中的核心活性成分,包括异槲皮苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、芦丁、山奈酚-3-O-芸香苷等。异槲皮苷具有抗炎、抗氧化、降压、抗抑郁等广泛的药理学作用,研究显示其可以改善db/db小鼠肝脏脂肪酸代谢紊乱[31]。芦丁作为黄酮类化合物槲皮素的糖苷,表现出丰富的生物活性,如抗氧化、抗癌、抗炎和神经保护活性[32]。研究显示,芦丁在调控脂质代谢中发挥着重要的作用,其通过增强磷酸化AMPK和磷酸化ACC的表达来调节棕榈酸诱导的HEPG2细胞的脂质代谢过程,并与脂肪酸合酶(FAS)、固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)等脂质代谢相关基因表达的抑制有一定关联[33];Liu等[34]的研究进一步证明,芦丁在HepG2细胞中以剂量依赖性方式减少TG的积累。槲皮素可下调肝脏中固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)、FAS、ACC等脂质合成基因的表达,上调PPARα、肉碱棕榈酰转移酶-1A(CPT-1A)等脂肪分解与β-氧化基因的表达,同时降低血清中TG、TC及游离脂肪酸含量,显著减少肝脏中TG、TC的蓄积量,缓解肝细胞脂肪变性[35-36]。还有研究表明,添加槲皮素可极显著提升血清抗氧化水平,其3',4'-二羟基B环可释放核因子E2相关因子2(Nrf2)入核激活血红素加氧酶-1(HO-1)、醌氧化还原酶-2(NQO-2)等抗氧化基因转录,显著降低脂质过氧化损伤[37]。
本研究基于辣木叶活性成分-FLHS关键作用靶点分析阐述了其作用机制,涉及6个核心靶点——SRC、STAT3、BCL2、IL6、CASP3和FGF2。IL6、SRC、STAT3等是重要的促炎介质和肝脏损伤标志物,与蛋鸡FLHS关系紧密。SRC作为非受体酪氨酸激酶核心节点,在炎症信号转导中起枢纽作用,可激活下游STAT3并调控多种炎症因子表达,介导广泛的炎症与免疫应答[38]。Wang等[39]研究表明,SRC/STAT3轴过度激活可加剧蛋鸡肝脏脂质沉积与炎症浸润,还可调节巨噬细胞极化状态,巨噬细胞的极化失衡会导致炎症细胞浸润加剧,进一步破坏肝脏结构,促进出血性损伤的发生。研究表明,使用SRC抑制剂PP2能显著减轻突变型K18蛋白诱导的肝脏损伤,证明了SRC在肝细胞凋亡中的关键作用[40]。IL6为典型炎症介质。Huang等[41]通过高通量测序和分子生物学试验证实了IL6在FLHS发病中的关键作用,并提出了通过抑制IL6改善肝脏炎症微环境的治疗策略。BCL2与CASP3构成凋亡调控核心轴,BCL2抑制肝细胞凋亡,CASP3执行凋亡程序。研究显示,将BCL2转基因表达于重型肝炎模型小鼠的肝细胞,可显著保护小鼠肝脏功能,减轻肝细胞纤维化程度,提示其与肝细胞凋亡呈负相关[42]。据报道,在酒精性肝病大鼠模型中,肝细胞凋亡显著增加,伴随CASP3表达量升高,表明其在介导肝细胞凋亡中发挥关键作用[43]。STAT3是一种关键的转录因子,可同时调控炎症与凋亡相关基因表达,当STAT3被持续激活后,可促进IL6等促炎因子释放并抑制BCL2表达,加剧肝脏损伤[44-45]。有研究表明,FGF2通过外泌体等旁分泌形式与肝细胞表面的受体相互作用,调节过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(PGC-1α)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)等关键转录因子的表达,参与肝细胞增殖与脂质代谢调控,促进肝组织修复并改善脂质沉积[46]。综上可知,辣木叶可能通过多靶点协同,调控炎症-凋亡-代谢网络,起到缓解蛋鸡FLHS的作用。
KEGG通路富集分析结果显示,辣木叶缓解蛋鸡FLHS的作用机制可能与多条信号通路相关,主要包括MAPK、黏着斑、细胞凋亡、FoxO、核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)及Toll样受体等信号通路。MAPK信号通路包括ERK、JNK、p38 MAPK等多个亚家族[47]。此外,该通路可调控脂肪细胞分化及凋亡、改善炎症等。研究显示,原儿茶酸抑制p38 MAPK后,可能上调相关抗氧化酶的表达,减轻氧化应激对肝脏脂质代谢的干扰,维持正常的脂质代谢水平[48]。槲皮素、姜黄素等天然活性成分可通过抑制p38 MAPK、ERK、JNK磷酸化,降低肝脂沉积、炎症因子水平与肝细胞凋亡率[49-50]。研究还发现,MAPK信号通路在调控NF-κB所诱导的炎症反应中发挥着关键作用[51]。FoxO转录因子家族在调节脂肪细胞的生长、分化、代谢以及机体能量平衡等方面发挥着重要作用,如槲皮素通过上调FoxO1的表达诱导自噬,抑制氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的脂滴形成[52]。此外,在氧化应激条件下,FoxO信号通路被激活后,能够促进抗氧化酶基因的表达,其中包括过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等关键酶类,以减轻氧化应激对脂肪细胞的损伤[53]。本研究中的动物试验结果表明,HELP组蛋鸡肝脏中MAPK信号通路关键基因p38 MAPK、ERK、JNK的mRNA相对表达量显著高于其他组,在辣木叶干预下这些基因的mRNA相对表达量出现逆转,说明辣木叶可通过抑制MAPK信号通路来发挥缓解FLHS的作用,这也验证了本研究中网络药理学的分析结果。后续可进一步开展体外细胞试验,探究KEGG通路富集分析所得其他重要通路(如黏着斑、细胞凋亡、FoxO等)是否也参与调控蛋鸡FLHS的病理进程。
本研究明确了辣木叶缓解蛋鸡FLHS的具体作用机制,为后续天然产物(如植物提取物)在畜禽疾病防治中的理论研究提供了思路,并为生产企业针对性地提取辣木叶核心活性成分以开发出靶向缓解FLHS的饲料添加剂提供了重要的理论支撑,有利于辣木资源的进一步开发和利用。

4 结论

本研究通过网络药理学分析筛选出异槲皮苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、芦丁、山奈酚-3-O-芸香苷等59个辣木叶主要活性成分,并富集到多条与缓解FLHS相关的信号通路,主要包括MAPK、黏着斑、细胞凋亡、FoxO、NOD样受体及Toll样受体等信号通路。筛选得到的上述活性成分中,一部分可通过介导特定信号通路发挥抗氧化、抗炎等生物学效应,另有一部分参与调控细胞分化、细胞凋亡等关键生命活动,进而影响细胞功能状态。分子对接结果显示,辣木叶中的异槲皮苷与核心靶点SRC、STAT3、BCL2均具有稳定的结合能力。此外,动物试验结果表明,辣木叶对缓解蛋鸡FLHS具有一定作用,结合肝脏中MAPK信号通路关键基因的表达变化,证实辣木叶中的活性成分可能通过调控MAPK信号通路参与缓解FLHS的病理进程。

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