动物营养学报 >

2026 , Vol. 38 >Issue 7: 5416 - 5426

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2026.433

研究论文

吉拉德试剂P标记-液相色谱-串联质谱法同步测定猪粪便中5种短链脂肪酸

  • 程远之 ,
  • 王凤芹 , *
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  • 浙江大学动物科学学院, 教育部动物分子营养学重点实验室,农业农村部(华东)动物营养与饲料重点实验室, 全省优质动物产品生产重点实验室, 杭州 310058
* 王凤芹,正高级实验师,E-mail:

程远之(1993—),男,浙江衢州人,助理研究员,博士,研究方向为动物营养与饲料科学。E-mail:

Office editor: 田艳明

收稿日期: 2025-12-12

  网络出版日期: 2026-07-14

基金资助

国家重点研发计划项目(2023YFD1301502-03)

国家自然科学基金项目(32502952)

浙江省自然科学基金项目(LQN26C170001)

收起

Simultaneous Determination of Five Short-Chain Fatty Acids in Pig Feces by Girard Reagent P Derivatization Coupled with Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

  • CHENG Yuanzhi ,
  • WANG Fengqin , *
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  • Zhejiang Key Laboratory of Nutrition and Breeding for High-Quality Animal Products, Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science in Eastern China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Key Laboratory of Molecular Animal Nutrition, Ministry of Education, College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China
* senior experimentalist, E-mail:

Received date: 2025-12-12

  Online published: 2026-07-14

Fold

摘要

本研究旨在建立猪粪便中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸等短链脂肪酸(SCFAs)的高灵敏检测方法。猪粪便样品经乙腈提取后,在吡啶缓冲体系中经1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)催化,SCFAs与吉拉德试剂P(GP)于室温下反应生成带永久正电荷的酰胺衍生物;以GP标记的氘代SCFAs为内标,采用亲水相互作用色谱(HILIC)柱分离,液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)正离子多反应监测(MRM)模式检测,同位素内标法定量。结果表明:5种SCFAs的检出限(LOD)为0.5~2.0 pmol/g,定量限(LOQ)为1.0~5.0 pmol/g;在0.001~1.000 mmol/L浓度内,相关系数(R2)均大于0.99;加标回收率为80.1%~103.8%,相对标准偏差(RSD)为1.8%~10.0%。由此可见,本研究建立的基于GP标记结合LC-MS/MS的5种SCFAs同步定量方法灵敏度高、稳定性好,可实现复杂基质中痕量SCFAs的精准检测。

关键词： 吉拉德试剂P; 短链脂肪酸; 液相色谱-串联质谱; 衍生化; 猪粪便

本文引用格式

程远之 , 王凤芹 . 吉拉德试剂P标记-液相色谱-串联质谱法同步测定猪粪便中5种短链脂肪酸[J]. 动物营养学报, 2026 , 38(7) : 5416 -5426 . DOI: 10.12418/CJAN2026.433

Abstract

This study aimed to establish a highly sensitive method for the determination of short-chain fatty acids (SCFAs), including acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid and hexanoic acid, in pig feces. Pig fecal samples were extracted with acetonitrile. In a pyridine buffer system, under the catalysis of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC·HCl), the SCFAs reacted with Girard reagent P (GP) at room temperature to form amide derivatives with permanent positive charges. Using GP-labeled deuterated SCFAs as internal standards, the derivatives were separated on a hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) column, detected by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) in positive ion multiple reaction monitoring (MRM) mode, and quantified by isotope internal standard method. The results showed that the limits of detection (LOD) of the five SCFAs ranged from 0.5 to 2.0 pmol/g, and the limits of quantification (LOQ) ranged from 1.0 to 5.0 pmol/g. In the concentration range of 0.001 to 1.000 mmol/L, the correlation coefficients (R2) were all greater than 0.99. The spiked recoveries were in the range of 80.1% to 103.8%, with relative standard deviations (RSD) of 1.8% to 10.0%. It is concluded that the established simultaneous quantification method for five SCFAs based on GP derivatization combined with LC-MS/MS has high sensitivity and good stability, and can achieve accurate determination of trace SCFAs in complex matrices.

Key words： Girard reagent P; short-chain fatty acids; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; derivatization; pig feces

短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)是肠道微生物发酵膳食纤维产生的核心代谢产物,主要包括碳原子数小于等于6的乙酸、丙酸和丁酸等羧酸类物质,其中乙酸、丙酸和丁酸占肠道总SCFAs的90%以上[1]。SCFAs浓度可直接反映肠道菌群的活性和多样性,是评估动物肠道健康的关键指标[2-3];同时,通过监测SCFAs浓度可优化饲粮配方,提升营养物质利用率,减少养殖环境污染物的排放[4-5]。猪粪便作为SCFAs检测的典型生物基质,其乙酸浓度占总SCFAs的50%以上[6-7],因此建立高效灵敏的SCFAs检测方法对畜牧养殖领域具有重要的实践价值。
目前,SCFAs的检测方法主要有气相色谱(GC)法、气相色谱-质谱联用(GC-MS)法和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法[8-9]。其中,GC和GC-MS需对SCFAs进行衍生化以增强挥发性,但存在衍生条件苛刻(如三甲基硅烷衍生需严格无水环境)、衍生物易挥发损失等缺陷[10-11];LC-MS/MS的优势在于分析和样品前处理时间更短,理论上可以省去GC或液相色谱中使用的衍生化和反萃取步骤[12-14]。然而,在LC-MS/MS中对游离脂肪酸的提取极具挑战性;同时,由于羧基电离效率低,串联质谱碎裂效果不明显,基质干扰严重,导致检测灵敏度不足[15-16]。采用选择离子监测(selected ion monitoring,SIM)模式进行LC-MS/MS分析会导致溶剂和生物基质带来干扰,该方法测定丁酸、戊酸和己酸的特异性较低,定量结果不可靠[15]。化学衍生化可改善SCFAs的质谱响应,如采用3-硝基苯肼(3-nitrophenylhydrazine,3-NPH)衍生结合负离子LC-MS/MS检测[17],但负离子模式灵敏度仍有提升空间。
吉拉德试剂作为带永久正电荷的衍生化试剂,可显著提高目标物在正离子模式下的电离效率[18]。鉴于此,本研究首次将吉拉德试剂P(Girard reagent P,GP)应用于SCFAs衍生化,在温和水相条件下实现5种SCFAs的高效标记,并结合亲水相互作用色谱(HILIC)分离和LC-MS/MS正离子检测,旨在建立猪粪便中SCFAs的同步定量方法,为动物肠道健康评估及饲料营养调控研究提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试剂

乙酸(纯度≥99.9%)、丙酸(纯度≥99.9%)、丁酸(纯度≥99.5%)、戊酸(纯度≥99.0%)、己酸(纯度≥99.0%)、乙酸-d4(纯度≥99.5%)、丙酸-d5(纯度≥99.9%)、丁酸-d7(纯度≥98.0%)、戊酸-d9(纯度≥98.0%)、己酸-d11(纯度≥98.0%)、GP(纯度≥98.0%)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl,纯度≥98.0%)和吡啶(纯度≥99.9%)购自北京百灵威科技有限公司;色谱级甲醇、乙腈、甲酸铵和甲酸购自美国Sigma-Aldrich公司;试验用水为超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm)。
SCFAs标准储备液:准确称取各SCFAs标准品,用乙腈配制成10 mmol/L储备液,于-20 ℃避光保存;临用前用乙腈稀释成浓度为0.001~1.000 mmol/L的系列标准工作溶液。
同位素内标储备液:准确称取各氘代SCFAs内标,用乙腈配制成10 mmol/L储备液,于-20 ℃避光保存;临用前稀释成浓度为10 μmol/L的工作溶液。
GP溶液:称取0.187 6 g GP,用少量甲醇溶解后乙腈定容至10 mL,得到0.1 mol/L储备液,临用前稀释为0.025 mol/L。EDC·HCl溶液:称取0.191 7 g EDC·HCl,乙腈溶解并定容至10 mL,得到0.1 mol/L储备液,临用前稀释为0.05 mol/L。吡啶水溶液:称取0.197 8 g 吡啶,超纯水溶解并定容至50 mL,得到0.05 mol/L吡啶水溶液。

1.1.2 主要仪器

主要仪器如下:超高效液相色谱-串联质谱仪(Acquity UPLC TQ MS,美国Waters公司);超声波清洗器(KQ-500E,昆山市超声仪器有限公司);超纯水仪(Milli-Q,德国EMD Millipore公司);电子分析天平(ME204E,瑞士Mettler Toledo公司);离心机(ST 40R,美国Thermo公司)。

1.2 LC-MS/MS分析条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱:Cortecs UPLC HILIC柱(2.1 mm×100 mm,1.6 μm,美国Waters公司);柱温40 ℃;进样量5 μL;流速0.5 mL/min。流动相A:2.5 mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸水溶液;流动相B:2.5 mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸乙腈水溶液(含10%水)。梯度洗脱程序:0 min时B相100%,1 min内降至50%并维持2 min,3.1 min回升至100%,平衡2 min,总运行时间5 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾电离(ESI)正离子模式;多反应监测(MRM)模式;喷雾电压2.5 kV;离子源温度550 ℃。所有GP标记的SCFAs及其同位素衍生物均以质荷比(m/z)120为定量子离子,m/z 80为定性子离子;驻留时间、锥孔电压及碰撞能量通过MassLynx软件优化确定。

1.3 猪粪便样品采集

粪便样本来源于60日龄“杜×长×大”三元杂交仔猪,试验用基础饲粮参照NRC(2012)营养需要配制。粪便以栏为单位,在每天晨饲前,使用棉签刺激仔猪肛门排便,收集至少6头猪,总共收集250 g粪便,除去毛屑后混匀,置于-20 ℃冰箱中密封保存,直至样品前处理。

1.4 样品前处理

准确称取200 mg猪粪便样品于离心管中,加入10 mL含10 μmol/L氘代内标的乙腈提取液,超声提取10 min[(24±1) ℃],7 154×g离心5 min。取400 μL上清液至2 mL离心管,依次加入200 μL 0.025 mol/L GP溶液、200 μL 0.05 mol/L EDC·HCl溶液和200 μL 0.05 mol/L吡啶水溶液,室温孵育2 h。反应液用50%甲醇稀释50倍,过0.22 μm滤膜后供LC-MS/MS分析。

1.5 方法学验证

检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别定义为信噪比(S/N)>3和S/N>10时对应的浓度。精密度以相对标准偏差(RSD)评估,即RSD(%)=(标准差/平均值)×100。通过对同一粪便样本在同一天进行3次提取(日内RSD)和连续3 d进行提取(日间RSD)来测定。准确度以采用标准加入法,设置低、中、高3个浓度水平进行加标回收试验进行验证,每个水平3次平行,计算回收率和RSD。

2 结果与分析

2.1 衍生化条件优化

2.1.1 GP和EDC·HCl浓度优化

将200 μL不同浓度(0.005、0.010、0.025、0.050 mol/L)的GP乙腈溶液和200 μL不同浓度(0.005、0.010、0.025、0.050 mol/L)的EDC·HCl乙腈溶液(表1),加入到400 μL 0.1 mmol/L SCFAs混合标准溶液(含0.01 mmol/L SCFAs同位素混合标准溶液)和200 μL 0.05 mol/L吡啶水溶液中,在环境温度下孵育2 h。将反应液用50%甲醇稀释50倍,通过LC-MS/MS分析比较不同溶剂中SCFAs衍生物的峰面积。
表1 不同浓度的GP与EDC·HCl组合

Table 1 Combinations of GP and EDC·HCl at different concentrations mol/L

序号
No.		 EDC·HCl浓度
EDC·HCl
concentration		 GP浓度
GP
concentration
1 0.050 0.050
2 0.050 0.025
3 0.050 0.010
4 0.050 0.005
5 0.025 0.050
6 0.025 0.025
7 0.025 0.010
8 0.025 0.005
9 0.010 0.050
10 0.010 0.025
11 0.010 0.010
12 0.010 0.005
13 0.005 0.050
14 0.005 0.025
15 0.005 0.010
16 0.005 0.005
考察不同浓度的GP(0.005~0.050 mol/L)和EDC·HCl(0.005~0.050 mol/L)组合对衍生化效率的影响,结果显示,0.025 mol/L GP与0.05 mol/L EDC·HCl组合时,SCFAs衍生物峰面积最大(图1),此条件下羧基活化效率最高,且GP与SCFAs反应完全。
图1 不同浓度的GP与EDC·HCl组合对SCFAs及其同位素衍生物峰面积的影响

AA:乙酸 acetic acid;AA-d4:乙酸-d4 acetic acid-d4;PA:丙酸 propionic acid;PA-d5:丙酸-d5 propionic acid-d5;BA:丁酸 butyric acid;BA-d7:丁酸-d7 butyric acid-d7;VA:戊酸 valeric acid;VA-d9:戊酸-d9 valeric acid-d9;HA:己酸 hexanoic acid;HA-d11:己酸-d11 hexanoic acid-d11。下图同 the same as below。

Fig.1 Effects of combinations of GP and EDC·HCl at different concentrations on peak areas of SCFAs and their isotopic derivatives

2.1.2 反应溶剂优化

在离心管中加入400 μL 0.1 mmol/L SCFAs混合标准溶液(含0.01 mmol/L SCFAs同位素混合标准溶液),依次加入200 μL 0.025 mol/L的GP、200 μL 0.05 mol/L的EDC·HCl和200 μL不同的反应溶剂[包括5 mmol/L三乙胺水溶液、一系列不同浓度的吡啶水溶液以及盐酸(HCl)-吡啶水溶液],充分混匀后,在室温条件下孵育2 h,以完成衍生化反应。反应结束后,将反应液用50%甲醇稀释50倍,随后通过LC-MS/MS进行分析,比较不同溶剂体系下SCFAs衍生物的峰面积。
结合图2和图3的试验结果,对不同溶剂的衍生效果进行评估:图2显示,在5 mmol/L吡啶、HCl-吡啶和5 mmol/L三乙胺3种溶剂中,5 mmol/L吡啶组SCFAs及其同位素衍生物峰面积响应最高,且稳定性最佳,明显优于另外2种溶剂;图3进一步表明,随着吡啶浓度从0 mmol/L升高到50 mmol/L,衍生物峰面积持续上升,在50 mmol/L(即0.05 mol/L)时达到较高水平并趋于稳定,而继续提高浓度至100 mmol/L,峰面积无明显提升。
图2 不同溶剂对SCFAs及其同位素衍生物峰面积的影响

Fig.2 Effects of different solvents on peak areas of SCFAs and their isotopic derivatives

图3 不同浓度的吡啶对SCFAs及其同位素衍生物峰面积的影响

Fig.3 Effects of different concentrations of pyridine on peak areas of SCFAs and their isotopic derivatives

综合分析可知,0.05 mol/L吡啶水溶液为最佳反应溶剂,该浓度的吡啶可提供适宜的碱性环境,有效促进酰胺键的形成,从而提升SCFAs衍生物的峰面积,增强检测灵敏度。

2.1.3 反应时间和温度优化

为优化SCFAs的衍生化反应条件,本研究考察了孵育时间对衍生物生成效率的影响。试验在离心管中依次加入400 μL 0.1 mmol/L SCFAs混合标准溶液(含0.01 mmol/L SCFAs同位素混合标准溶液)、200 μL 0.025 mol/L的GP、200 μL 0.05 mol/L的EDC·HCl和200 μL 0.05 mol/L的吡啶水溶液,于室温下孵育。在30~180 min的时间梯度内取样分析,结果显示,随着反应时间的延长,各SCFAs及其同位素衍生物的峰面积整体呈先上升后趋于平稳的趋势。如衍生化时间试验(图2)所示,反应进行至120 min时,衍生物的峰面积达到平衡状态,表明此时衍生化反应已基本完成。由此可见,120 min是该衍生化反应的最优时间点。
在离心管中依次加入400 μL 0.1 mmol/L SCFAs混合标准溶液(含0.01 mmol/L SCFAs同位素混合标准溶液)、200 μL 0.025 mol/L的GP、200 μL 0.05 mol/L的EDC·HCl和200 μL 0.05 mol/L的吡啶水溶液,分别在25、37、50、70 ℃下孵育2 h,用50%甲醇稀释50倍,备用。不同孵育温度试验结果发现(图4),孵育温度在20~37 ℃内峰面积无明显差异,因此确定最佳衍生温度为室温。
图4 不同孵育温度对SCFAs及其同位素衍生物峰面积的影响

Fig.4 Effects of different incubation temperatures on peak areas of SCFAs and their isotopic derivatives

2.2 色谱条件优化

对比C18和HILIC色谱柱的分离效果发现,GP标记的SCFAs衍生物在C18柱上无明显保留(图5),而HILIC柱可实现5种衍生物的快速基线分离,保留时间为2.19~2.35 min(图6)。进一步优化流动相组成,确定含2.5 mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸的乙腈-水体系为最佳流动相,在此条件下5种SCFAs衍生物保留时间为2.19~2.35 min,可实现快速分离。
图5 SCFAs衍生物的色谱图(色谱柱:C18)

Fig.5 Chromatograms of SCFA derivatives (column:C18)

图6 SCFAs衍生物的色谱图(色谱柱:HILIC)

Fig.6 Chromatograms of SCFA derivatives (column: HILIC)

2.3 质谱裂解途径和MRM参数优化

将GP标记的SCFAs反应液分别通过注射泵以20 μL/min的流速直接注入质谱仪,质谱仪采用正离子模式运行,将喷雾电压设定为2.5 kV,离子源温度设定为550 ℃,调节脱溶剂气、雾化气和干燥气温度或流量等参数,以获得高质量的全扫描质谱和串联质谱图谱,并创建相应的调谐文件。
由于GP中具有预带电基团,在ESI模式下,10种SCFAs衍生物分别产生特征分子离子峰[M]+:m/z 194.0、m/z 197.2、m/z 208.1、m/z 213.2、m/z 222.0、m/z 229.2、m/z 236.2、m/z 245.2、m/z 250.2和m/z 261.3,并且均生成m/z 120(N-乙烯基甲酰基吡啶阳离子)和m/z 80(吡啶环阳离子)的共同碎片离子(图7和图8),与脂肪酸碳链长度无关,裂解碎片离子见表2,可能的裂解途径见图8。据此选择m/z 120为定量子离子,m/z 80为定性子离子,优化后的MRM参数见表3。
图7 GP-SCFAs质谱图

a~j分别表示GP标记的乙酸、乙酸-d4、丙酸、丙酸-d5、丁酸、丁酸-d7、戊酸、戊酸-d9、己酸和己酸-d11。

Fig.7 Mass spectra of GP-SCFAs

a to j represented GP-labeled acetic acid, acetic acid-d4, propionic acid, propionic acid-d5, butyric acid, butyric acid-d7, valeric acid, valeric acid-d9, hexanoic acid and hexanoic acid-d11, respectively.

图8 SCFAs及其同位素衍生物可能的裂解途径

a、b、c和d表示裂解位置。

Fig.8 Possible fragmentation pathways of SCFAs and their isotopic derivatives

a, b, c and d represented fragmentation locations.

表2 SCFAs裂解碎片离子

Table 2 Fragment ions of SCFAs cleavage

化合物Compounds R a b c d
GP-AA -CH3 138 120 115 80
GP-AA-d4 -CD3 138 120 118 80
GP-PA -C2H5 138 120 129 80
GP-PA-d5 -C2D5 138 120 134 80
GP-BA -C3H7 138 120 143 80
GP-BA-d7 -C3D7 138 120 150 80
GP-VA -C4H9 138 120 157 80
GP-VA-d9 -C4D9 138 120 166 80
GP-HA -C5H11 138 120 171 80
GP-HA-d11 -C5D11 138 120 182 80

GP:吉拉德试剂P Girard reagent P;AA:乙酸 acetic acid;AA-d4:乙酸-d4 acetic acid-d4;PA:丙酸 propionic acid;PA-d5:丙酸-d5 propionic acid-d5;BA:丁酸 butyric acid;BA-d7:丁酸-d7 butyric acid-d7;VA:戊酸 valeric acid;VA-d9:戊酸-d9 valeric acid-d9;HA:己酸 hexanoic acid;HA-d11:己酸-d11 hexanoic acid-d11。表3同 the same as Table 3。

R表示烷基侧链基团,a和b表示恒定碎片离子,c表示可变碎片离子,d表示恒定小碎片离子。R represented alkyl side chain group, a and b represented constant fragment ions, c represented variable fragment ions, and d represented constant small fragment ions.

表3 SCFAs及其同位素衍生物的定性离子对、定量离子对和碰撞能量参考值

Table 3 Qualitative ion pairs, quantitative ion pairs and collision energy reference values of SCFAs and their isotopic derivatives

化合物
Compounds		 离子对
Ion pairs(m/z)		 锥孔电压
Cone voltage/V		 碰撞能量
Collision energy/eV

GP-AA		 194.0/120.0a
14		 14
194.0/80.1 18

GP-AA-d4		 197.2/120.1a
22		 14
197.2/80.1 20

GP-PA		 208.1/120.1a
18		 14
208.1/80.0 22

GP-PA-d5		 213.2/120.1a
22		 14
213.2/80.1 20

GP-BA		 222.0/120.1a
20		 16
222.0/80.1 22

GP-BA-d7		 229.2/120.0a
22		 18
229.2/80.1 24

GP-VA		 236.2/120.1a
20		 16
236.2/80.1 26

GP-VA-d9		 245.2/120.1a
22		 16
245.2/80.1 22

GP-HA		 250.2/120.1a
24		 16
250.2/80.1 22

GP-HA-d11		 261.3/120.1a
24		 16
261.3/80.1 24

a:定量离子对 quantitative ion pair。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性范围和灵敏度

在配制的混合系列标准工作溶液中,乙酸、丙酸和丁酸浓度依次为0.001、0.002、0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200、0.500、1.000 mmol/L,戊酸和己酸浓度依次为0.001、0.002、0.005、0.010、0.020、0.050、0.100 mmol/L,其中含混合内标浓度为0.010 mmol/L。由表4可知,得到的标准曲线的相关系数(R2)均大于0.99;通过内标法测定,5种SCFAs的LOD为0.5~2.0 pmol/g,LOQ为1.0~5.0 pmol/g,灵敏度明显优于传统GC-MS及未衍生化LC-MS/MS方法[10,16]。
表4 方法学验证结果

Table 4 Methodological verification results

化合物
Compounds		 日内回收率/
相对标准偏差
Intraday recovery rate/
RSD/%		 日间回收率/
相对标准偏差
Interday recovery/
RSD/%		 线性范围
Linear
range/
(mmol/L)		 相关系数
Correlation
coefficient
(R2)		 检出限
LOD/
(pmol/
g)		 定量限
LOQ/
(pmol/
g)
FL1 FL2 FL3 FL1 FL2 FL3
乙酸Acetic acid 80.6/5.5 80.1/7.7 99.1/10.0 82.2/5.6 81.0/4.7 87.3/9.7 0.001~1.000 0.996 7 1.0 2.0
丙酸
Propionic acid		 81.1/9.5 92.3/9.8 95.2/7.6 83.3/6.7 87.9/8.4 95.5/8.2 0.001~1.000 0.997 9 2.0 5.0
丁酸Butyric acid 96.6/8.3 96.1/8.1 103.8/1.8 90.1/8.3 91.1/8.4 96.8/7.1 0.001~1.000 0.998 0 2.0 5.0
戊酸Valeric acid 95.1/6.1 94.9/9.4 97.6/8.9 94.5/6.9 94.2/7.3 92.3/7.1 0.001~0.100 0.993 8 1.0 2.0
己酸
Hexanoic acid		 97.1/9.2 101.3/3.7 95.6/9.3 89.6/8.3 90.9/9.8 92.8/7.0 0.001~0.100 0.999 9 0.5 1.0

FL1、FL2和FL3分别表示低、中、高3个浓度水平。表5同。

FL1, FL2 and FL3 represented low, medium and high concentration levels, respectively. The same as Table 5.

2.4.2 回收率和精密度

设置2组样品:样品A为含内源性SCFAs并加入SCFAs同位素内标的粪便;样品B按表5添加方案,将1 mL分别含低(FL1)、中(FL2)和高(FL3)3个不同浓度水平的SCFAs混合标准溶液和SCFAs同位素内标加入到样品中(3个平行),按提取和衍生化步骤进行处理后,并经LC-MS/MS定量分析。
表5 猪粪便样品中SCFAs的添加方案

Table 5 Spiking protocol of SCFAs in pig fecal samples mmol/L

化合物Compounds FL1 FL2 FL3
乙酸Acetic acid 0.50 1.00 2.00
丙酸Propionic acid 0.50 1.00 2.00
丁酸Butyric acid 0.50 1.00 2.00
戊酸Valeric acid 0.05 0.20 0.50
己酸Hexanoic acid 0.05 0.20 0.50
评估SCFAs的平均回收率。对于一个有效的前处理方法,回收率应在80%~110%[19]。猪粪便样品加标回收试验结果显示,回收率为80.1%~103.8%,RSD为1.8%~10.0%(表4),符合痕量分析方法要求[19],表明方法准确度和稳定性良好,基质干扰影响较小。

2.5 猪粪便样品分析

猪粪便样品分析结果显示,样品中乙酸浓度[(54.70±0.99) μmol/g]最高,其次为丙酸[(14.88±0.81) μmol/g]和丁酸[(10.65±0.73) μmol/g],戊酸[(3.26±0.12) μmol/g]和己酸浓度[(0.46±0.03) μmol/g]较低,与文献报道[6-7]一致,验证了本试验方法的实用性。

3 讨论

传统SCFAs检测方法存在衍生条件苛刻、灵敏度不足等问题。本研究采用GP作为衍生化试剂,其带有的永久正电荷可明显提升SCFAs在正离子模式下的电离效率;同时,EDC·HCl-吡啶体系实现了温和水相衍生,避免了无水、高温等严苛条件,降低了操作难度。
HILIC色谱柱对极性衍生物的优异保留能力,解决了C18柱无保留的难题,实现了5种SCFAs衍生物的快速分离;而通用定量离子m/z 120的选择,简化了方法优化流程,提高了检测通量。方法学验证及实际样品分析结果表明,本试验建立方法可满足复杂基质中痕量SCFAs的检测需求,为动物肠道菌群代谢研究及饲料营养调控提供了可靠的技术支撑。

4 结论

本研究建立的GP标记-LC-MS/MS方法可实现猪粪便中5种SCFAs的同步定量检测,具有灵敏度高、操作简便、稳定性好等优势,可为动物肠道健康评估、饲料营养调控提供技术支撑。

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