丙酮酸肌酸(creatine pyruvate,CrPyr)是一种新型的功能性营养添加剂,分子式为C7H13N3O5,其中肌酸与丙酮酸占比为60∶40,主要成分为丙酮酸和肌酸。CrPyr的合成方式主要是通过丙酮酸和肌酸单体在10~30 ℃的温度下,按肌酸与丙酮酸摩尔比为5∶1~1∶2的比例混合而成。该反应可以在常规的装置如混合器、叶片干燥器或者搅拌容器当中进行,且在有无稀释剂(甲醇、乙醇和乙醚等)的条件下均能发生。CrPyr的物理特性具有安全、保存期长、水溶解度大以及生物利用率高的特点[1]。CrPyr在运动员当中使用较为广泛,有研究报道称CrPyr在增强运动员肌肉质量以及运动能力方面,其效果显著优于单独使用肌酸[2];但Van Schuylenbergh等[3]研究发现,自行车运动员口服7 g/d的CrPyr,对运动员的耐力和冲刺能力无显著影响。目前,CrPyr主要应用于医药原料及食品添加剂,在畜禽动物上的研究应用较少。因此,本文通过综述近年来国内外学者在丙酮酸、肌酸和CrPyr在畜禽上的研究,为开发CrPyr作为一种饲料添加剂在畜禽养殖中应用提供参考。
1 丙酮酸、肌酸和CrPyr概述
1.1 丙酮酸概述
丙酮酸是生物体内重要的有机小分子,分子式为C3H4O3,作为机体内糖代谢、蛋白质代谢和脂肪代谢三者之间重要的连接枢纽[4],其在三大营养物质代谢中扮演着重要的角色,其代谢途径如图1 [5]所示。丙酮酸不仅可以直接抑制机体内过氧化氢(H2O2)的生成[6],间接增加谷胱甘肽的含量[7],从而增加机体的抗氧化能力;也可以进入三羧酸循环为机体提供能量[8]。丙酮酸是一种黄色或者淡黄色的透明液体,自然条件下具有刺激性气味,化学性质不稳定,容易被氧化[9],其在畜禽动物生产上的添加形式一般为丙酮酸钠、丙酮酸钙和丙酮酸镁,但是丙酮酸镁和丙酮酸钙中钙离子和镁离子加速了丙酮酸和丙酮酸根离子分解为二聚体、聚合物以及环状合物,不利于保存;而丙酮酸钠中额外补充的钠离子,容易造成体液滞留,导致内环境紊乱。
1.2 肌酸概述
肌酸是一种主要分布在骨骼肌中的氨基酸化合物,分子式为C4H9N3O2,机体内可由L-精氨酸(L-Arg)、甘氨酸(Gly)和甲硫氨酸(Met)在肝脏中合成[10],其合成代谢途径如图2 [11]所示。研究表明,肌酸也有一定的抗氧化能力,其作用方式是通过清除细胞内活性氧和活性氮来完成的[12]。同时,肌酸也可以作为一种能量补充剂为机体提供能量[13]。在畜禽生产中其添加形式一般为一水肌酸(creatine monohydration,CMH),CHM可以通过维持肌肉当中能量的平衡,减少糖类和蛋白质的分解,降低脂肪的沉积,从而促进肌肉的发育以及改善宰后肉品质[11,14];但是CMH的溶解性较差,造成其吸收率较低,在20 ℃条件下,1 L水中只能溶解13 g的CMH。
1.3 CrPyr概述
CrPyr是一种新型的功能性营养添加剂,具有肌酸的特性和丙酮酸的功能,同时又弥补了肌酸难溶于水、丙酮酸易氧化的缺点[9,15],其结构式如图3 所示。不过,我国《饲料添加剂品种目录(2013)》中尚未加入CrPyr,但是其肌酸合成的前体物质L-Arg、Gly以及与丙酮酸合成相关的柠檬酸、苹果酸等可以作为添加剂用于动物养殖中。CrPyr中的肌酸单体作为一种兴奋剂,其安全性也受到一定的关注。Kreider等[16]研究发现,在婴儿、青年和老年人当中短期或者长期补充肌酸(最多30 g/d,持续5年),均表现出安全且良好的耐受性,在整个试验过程中发现3 g/d肌酸可以提供显著的健康益处;Gualano等[17]研究表明,连续补充5 g/d肌酸、持续12周,不会损害Ⅱ型糖尿病患者的肾功能,并且建议患有糖尿病的人每天摄入5 g肌酸有助于机体健康。因此,适量摄入肌酸对机体有益。
2 丙酮酸、肌酸和CrPyr的生物学功能
2.1 调控机体能量代谢
CrPyr可以调控机体能量代谢。Scheer等[18]用100 μmol/L的CrPyr灌胃小鼠,发现CrPyr能够在机体内分解为2种代谢中间产物丙酮酸和肌酸,可以改善神经组织的能量代谢,而且与肌酸相比,其作用效果更加显著和迅速。而在胚蛋当中注射CrPyr可以提高孵化19 d鸡胚肝脏中丙酮酸和葡萄糖的含量以及6-磷酸葡萄糖酶的活性,同时提高糖异生相关基因丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PC)和磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)的mRNA表达量[19]。单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是细胞能量“感受器”,在能量代谢过程中发挥着关键作用[20]。有文献报道,补充肌酸可以使肾上皮细胞中肌酸含量升高,导致磷酸肌酸与肌酸的比值下降,从而激活AMPK通路[21-22]。在仔猪模型中,灌注丙酮酸可以激活AMPK和己糖胺生物合成途径,并通过增强葡萄糖转运蛋白(glucose transporter,GLUT)4的表达来维持能量代谢的平衡[23]。丙酮酸和肌酸都具有调节能量代谢的功能,作为二者的复合体,CrPyr也具有类似的功能。赵敏孟[19]研究发现,胚蛋注射CrPyr可以提高肉鸡出壳后第19天胸肌中ADP的含量,降低胸肌中ATP的含量,同时肝脏中6-磷酸葡萄糖酶以及胸肌中肌酸激酶的活性都有所提高。分析其原因可能是CrPyr促进了胸肌对葡萄糖的摄取,同时提高了糖酵解过程中关键酶的活性,促进了胸肌当中葡萄糖的分解功能,而这一过程可能与注射CrPyr之后激活了肉鸡胸肌中肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)/AMPK信号通路有关。
2.2 抗氧化功能
CrPyr具有一定的抗氧化功能。丙酮酸是葡萄糖代谢的关键产物,是一种可以与H2O2反应的α-酮酸[6],其抗氧化能力主要有2个途径:一个是丙酮酸直接通过非酶促的去碳酸基反应抑制H2O2;另一个是丙酮酸通过三羧酸循环,增加磷酸戊糖途径产生还原性辅酶Ⅱ的含量,从而间接增加谷胱甘肽抗氧化系统能力[24⇓-26]。研究表明,肌酸也具有一定的抗氧化能力[27]。Lawler等[28]将细胞暴露在2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS+)和过氧硝酸盐的环境中,然后添加40 mmol/L肌酸,发现肌酸显著降低了ABTS+和过氧硝酸盐的水平。在单核细胞与肌酸共同孵育2 h后,用H2O2或者过氧硝酸盐处理,与对照组相比,肌酸组细胞的活力显著升高[12]。而在机体中,额外补充肌酸可以降低肌酸从头合成的原料,增加细胞内精氨酸(Arg)的含量;而Arg含量的升高可以促进机体谷氨酰胺的生成,谷氨酰胺可以缓解细胞内的氧化损伤[29-30],从而提高机体的抗氧化能力。在大鼠的试验中也发现,与对照组相比,CrPyr可以显著提高骨骼肌当中Arg的含量[31]。此外,刘琳[32]研究发现,在热应激条件下,饲粮添加CrPyr可以显著降低肉牛血清丙二醛含量,显著提高血清超氧化物歧化酶活性。这说明CrPyr可以缓解热应激造成的机体氧化损伤,提高机体的抗氧化能力。
2.3 调控肌肉发育
洪平等[2]研究发现,国家青年篮球队运动员在训练过程中连续6周每天补充10 g CrPyr,能够显著增加肌肉的重量,明显提高运动能力。Tang等[33]研究发现,补充肌酸可以降低运动员肌肉中糖原和蛋白质的降解。早在1974年就有人提出肌酸可以控制蛋白质的合成[34],而蛋白质的合成与降解在肌肉发育的过程中起着十分重要的作用[35]。在哺乳动物中,骨骼肌是肌肉组织当中很重要的一个组成部分,机体的大部分蛋白质都是由骨骼肌组成[36-37]。王岩[27]通过C2C12细胞试验发现,细胞经2 mmol/L肌酸处理后可以显著增加肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)和肌细胞生成素(myogenin,MyoG)的蛋白表达量;并且在小鼠肌肉损伤模型中也发现,肌酸处理后的细胞可以增加肌核数,从而形成更多的肌纤维。肌酸促进骨骼肌生长的潜在机制还不清楚,但现有证据表明,肌酸诱导的肌肉发育可能是通过不同的机制发生:1)肌酸的渗透负荷特性激活渗透感知,可以刺激蛋白质合成代谢途径;2)直接刺激肌原纤维蛋白合成的信号通路;3)通过调节肌源调控因子(muscle regulatory factors,MRFs)、合成代谢和肥大肌球蛋白来刺激卫星细胞增殖和肌肉分化,从而促进肌肉的生成。
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,参与体内许多信号传导途径,包括调节蛋白质的合成、细胞生长和内环境稳态[38]。而胰岛素、氨基酸和生长因子均可激活mTOR信号通路。研究表明,CrPyr可以显著提高3日龄肉仔鸡血浆胰岛素含量,并且提高腿肌中mTOR信号通路的上下游关键信号因子胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)、mTOR、真核翻译起始因子4E结合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1,4EBP1)以及核糖体蛋白S6激酶β1(Ribosomal protein S6 kinase beta-1,S6K1)基因的相对表达量,同时下调叉头框蛋白O1(Forkhead box protein O1,FoxO1)及泛素连接酶E3的关键编码基因表达水平,抑制泛素蛋白酶体途径降解肌肉蛋白,有利于腿肌发育[39]。在激素方面,补充肌酸可以增加生长激素的含量,生长激素含量升高可以促进肌肉的发育,持续训练之前补充肌酸可以提高肌肉的质量[40-41]。在成熟的肌肉中,肌核不分裂,因此卫星细胞被认为是生长过程中的关键细胞。卫星细胞的激活、增殖、分化可以替代肌纤维的发育,并且在肌肉受到损伤后,卫星细胞可以与受损肌纤维融合,恢复肌核的数量以及肌纤维的体积和含量[42]。体外研究表明,与对照组相比,补充肌酸可以显著诱导绵羊卫星细胞的分化但不影响卫星细胞的存活率[43]。在人体试验中补充肌酸可以提高骨骼肌细胞有丝分裂的活性以及骨骼肌细胞的数目,同时发现这与MRFs基因家族成员MyoG基因的表达水平有关[44-45]。除了激素和生长因子特定的营养素外,肌肉蛋白质的合成速率也受细胞能量状态的调节。AMPK是细胞能量状态的感受器[46],AMPK结节性硬质复合物和Raptor磷酸化可以抑制mTOR的激活,从而调节蛋白质的合成[47-48]。Fu等[47]研究发现,抑制AMPK活性可以下调MyoG基因的表达,从而抑制骨骼肌卫星细胞的激活和分化。而AMPK的激活会抑制热激蛋白表达,使miRNA-1沉默,进一步抑制肌束肥大[49],而胚蛋注射CrPyr可以激活肉仔鸡出壳当天胸肌中AMPK信号通路,促进葡糖糖的分解供能,同时提高胸肌重量以及胸肌的相对重量,并使肌肉组织中肌球蛋白轻链和肌动蛋白的表达量增加[9,19],所以CrPyr可以通过AMPK通路调节肌肉蛋白质的合成代谢,从而调控肌肉的发育。
2.4 其他作用
3 丙酮酸、肌酸和CrPyr在畜禽上的应用
3.1 在家禽上的应用
CrPyr作为一种能量供应物,目前在肉鸡出壳前研究较多。Zhao等[54]在胚蛋孵化17.5 d的时候每个蛋分别注射3、6和12 mg的CrPyr,发现不同处理的肉鸡种蛋的孵化率没有显著差异,但是12 mg CrPyr显著提高了肉鸡出生第3天和第7天的体重,6和12 mg CrPyr显著提高了肉鸡出生第21天的体重,并且在孵化后8~21 d这个期间的采食量显著高于对照组。Yang等[55]在胚蛋中注射20 g/L的CrPyr,发现CrPyr显著增加了注射后第2天肉鸡大腿肌肉中葡萄糖的含量,显著提高了注射后第2天以及孵化当天肌酸的含量,同时也提高了孵化当天GLUT3和GLUT8 mRNA的表达量。Chen等[56]用1日龄肉鸡做为研究对象,探究CrPyr对脂质和蛋白质代谢的影响,发现CrPyr显著增加了血清中非酯化脂肪酸和高密度脂蛋白的含量,并且显著提高了肝脏当中肉碱棕榈酰转移酶-1(carnitine palmityl transferase-1,CPT-1)和过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferators-activated receptor α,PPARα)基因的mRNA表达量,表明CrPyr可以通过加快脂肪酸β-氧化,从而降低脂肪的沉积;同时,在肌肉上的结果表明,CrPyr显著提高了腿肌的重量,并且使胰岛素生长因子Ⅰ表达增强,肌肉生长抑制素(myostatin)mRNA表达量降低,而胰岛素生长因子Ⅰ可以促进肌肉蛋白质的合成[57],myostatin基因可以抑制肌肉的生长[58],因此CrPyr在一定程度上可以调控肌肉的生长发育。
CMH也是畜禽养殖业当中肌酸的一种添加形式,张柏林等[59]通过在运输前对黔东南小香鸡饲喂CMH,发现饲喂CMH后,对小香鸡的平均日采食量、平均日增重以及料重比没有显著影响,但胸肌糖代谢指标丙酮酸激酶、已糖激酶和2,6-二磷酸果糖酶的活性显著降低,并且胸肌的亮度(L*)值、滴水损失以及蒸煮损失也显著下降,这说明肌酸可以降低宰后肌肉中糖酵解能力,调控宰后肉品质。祁晶等[60]研究宰前饲喂13 d CMH,可以降低运输过程中北京鸭胸肌糖酵解水平,降低胸大肌乳酸含量以及提高胸肌宰后24 h的pH。吕朋安等[61]探究了CrPyr对雏鸡空肠消化功能的影响,发现CrPyr显著提高了出壳当天肉鸡空肠蔗糖酶、麦芽糖酶和碱性磷酸酶的活性,显著上调了21日龄空肠碱性氨基酸转运载体(cationic amino acid transporter,CAT)、寡肽转运载体1(oligopeptide transporter1,PepT1)以及GLUT2基因的mRNA表达量,表明CrPyr可以提高肉鸡空肠对饲粮中糖类和蛋白质的消化和吸收。
综上可知,在家禽饲粮中添加CHM或者CrPyr均可提高机体的能量利用效率,降低宰后肌肉的糖酵解能力,并且有助于肌肉发育,同时CHM可以调控宰后肉品质,CrPyr可以提高空肠的消化和吸收能力。
3.2 在猪上的应用
CrPyr直接作用于猪生产方面的应用还未见报道,但其有效成分肌酸研究较多。门小明[62]研究发现,在育肥猪饲粮中添加CMH及其组合添加物(CMH+α-硫辛酸),能够显著降低其背膘厚,有降低背最长肌脂肪含量的趋势,并且可以显著提高背最长肌肌酸转运蛋白基因以及肌红蛋白和MyHCⅡa基因的表达水平。Li等[14]研究发现,CMH可以显著提高育肥猪的平均日采食量,降低背最长肌或半腱肌中宰后45 min的pH和滴水损失,并增加其背最长肌、半腱肌、肝脏和肾脏中肌酸和磷酸肌酸的含量以及肌酸转运蛋白的mRNA表达,从而调控宰后肉质的能量代谢。此外,有学者研究在低氧条件下添加肌酸对猪精子活力的影响,发现低氧条件下精子在30 min内可以锯齿状运动,但是在肌酸处理之后,精子可以进行120 min曲折运动,表明肌酸可能会提高猪精液中精子的活力[63]。
综上所述,在猪生产中饲喂CHM可以有效提高生产性能,降低背部脂肪的沉积,并且能为机体提供能量从而调控宰后肉品质。
3.3 在反刍动物上的应用
对于反刍动物营养来说,氮的补充尤为重要,而肌酸是蛋白质代谢和能量代谢中重要的含氮化合物之一。在过去的几十年里,肌酸被广泛地用于反刍动物营养中氮的补充剂。而肌酸能够被反刍动物有效利用是源于氨(NH3)的缓慢释放。从肌酸转变成NH3需要2个反应,首先肌酸被瘤胃细菌降解为尿素和肌氨酸,然后尿素在尿素酶的作用下催化成二氧化碳(CO2)和NH3[64]。本课题组最近研究发现,在热应激条件下,肉牛饲粮中添加20、40和60 g/d的CrPyr,可以提高瘤胃pH、微生物蛋白(MCP)含量以及血液中超氧化物歧化酶的活性,降低血液中丙二醛的含量以及皮质醇的水平,表明CrPyr通过提高抗氧化能力和微生物蛋白的合成来缓解肉牛热应激[65]。为了探究CrPyr缓解肉牛热应激的具体作用机制,本课题组又通过16S rDNA和蛋白质组学进行深入分析,与对照组相比,CrPyr添加组瘤胃菌群α多样性无显著差异,但是添加CrPyr上调了瘤胃细菌中脂肪酸β-氧化相关酶的表达,提高了肉牛粗脂肪消化率,并且可以上调参与糖异生和糖酵解相关酶的表达;而脂肪酸β-氧化生成的乙酰辅酶A和丙酮酸代谢生成的草酰乙酸进入三羧酸循环,可以产生更多α-酮戊二酸,而α-酮戊二酸与肌酸释放的NH3可以促进MCP的合成;丙酮酸代谢产生更多的ATP以及MCP含量的增加可能进一步降低氧化应激,调节能量代谢,从而缓解热应激造成的损伤[66]。此外,本课题组又研究了包被CrPyr缓解肉牛长途运输应激的效果,Mao等[67]在肉牛长途运输前饲喂30 d包被CrPyr,发现包被CrPyr能够缓解长途运输导致的瘤胃菌群紊乱,在门水平上可以提高厚壁菌门,降低拟杆菌门的丰度,在属水平上可以降低普雷沃氏菌属的丰度。以上研究表明,CrPyr可以调控应激状态下瘤胃微生物的紊乱。杨俊花等[68]研究了丙酮酸钙对山羊瘤胃消化代谢的影响,发现添加丙酮酸钙对瘤胃pH、氨态氮(NH3-N)和MCP含量无显著影响。
综上所述,肌酸可以促进瘤胃当中NH3的生成;CrPyr可以改善瘤胃的发酵功能,调控机体能量代谢,并通过提高机体的抗氧化能力从而缓解应激造成的机体损伤。
4 小结与展望
丙酮酸和肌酸作为机体重要的能量代谢物质,可以调控多种生理反应,但是其单体又具有容易氧化和溶解性差的缺点。CrPyr刚好弥补了这些缺点,又兼具二者优势,不仅能够提高机体生长性能和抗氧化能力,又可以调控机体蛋白质和脂肪代谢,而且还能为机体提供能量,改善宰后肉品质和胴体性状。然而,CrPyr还没有列入饲料添加剂目录,也没有获得推荐剂量,在生产上的应用还不够普及,未来可以在不同动物、动物不同生长阶段以及不同年龄上面进行添加剂量梯度试验,以确定适宜添加量,从而提高CrPyr的生物学效率以及降低饲料成本,为CrPyr的科学利用提供支撑。