桑树归属于桑科植物,具有很强的抗逆和耐寒能力,其叶片具有多种营养成分,并富含黄酮类、生物碱和多糖类等生物活性分子,具有良好的降血脂[1]、调节血糖[2]、清除自由基[3]、消除炎症[4]等作用,是一种药食两用的食品。据2012年中华人民共和国农业部第1773号公告,桑叶、桑枝等已被收录到《饲料原料目录》中。不过,桑叶中含有大量的植物凝集素和单宁,使得桑叶苦涩味浓郁,严重影响了桑叶的适口性和营养成分的吸收利用,制约了桑叶在畜牧业中的应用。随着饲料发酵水平的提高,采用微生物发酵可降低桑叶中抗营养因子含量,提高粗蛋白质、粗脂肪和其他成分的含量。经过微生物发酵后,桑叶粗蛋白质含量能达到24.47%左右,甚至超过了玉米、小麦等一些常规饲料原料,且营养物质种类多样,比许多植物性蛋白质和水果更丰富。我国桑树种植面积近80万hm2,年产鲜桑叶1 200万t,居世界首位,而近年蚕桑资源的利用率只占到1%~3%,因此桑叶饲用化开发可促进桑树资源高效利用。目前,我国大豆进口依赖程度仍然很高,其中超过80%的进口大豆被用作畜禽饲料,因此,寻求一种质优、价廉、绿色安全的蛋白质替代原料成为重要任务之一。发酵桑叶营养成分丰富,对其开发利用有助于缓解当下蛋白质原料供求矛盾,促进畜禽养殖业的发展。
1 桑叶发酵的方法
1.1 发酵条件
研究已证明,菌种类型和发酵条件不同桑叶发酵效果不同。徐丹等[5]选择乳酸菌和枯草芽孢杆菌及2种菌株的混合物用于桑叶的发酵,结果表明,发酵后桑叶单宁含量明显减少,并且2种菌株混合发酵能使粗蛋白质含量提升23.27%,提升幅度较单一菌株大。张洪燕等[6]研究表明,采用18个菌株分别对桑叶进行发酵处理,其中地衣芽孢杆菌、康宁木霉和产脘假丝酵母发酵提升桑叶中粗蛋白质含量的幅度较大;植物乳杆菌、布氏乳杆菌和产脘假丝酵母发酵提升桑叶中粗脂肪含量的幅度较大;蜡状芽孢杆菌、热带假丝酵母和地衣芽孢杆菌发酵降低桑叶中粗纤维含量的幅度较大。屈红森等[7]报道,用枯草芽孢杆菌发酵桑叶粉,当桑叶粉质量浓度达到2.64 mg/mL、装液量105 mL、蔗糖质量浓度为22 mg/mL、温度为30 ℃、时间为45.1 h时发酵效果最佳,发酵桑叶粗蛋白质含量可达到60.78%,体外消化率比发酵前提高了4.29%。将发酵桑叶应用到畜禽饲粮中发现一定量的发酵桑叶可以促进畜禽的生长发育,调控脂质代谢水平[8],增强身体免疫力[9],提高肉品质量。
1.2 发酵桑叶的营养价值
微生物发酵法是指通过微生物自身特定的运动轨迹和代谢方式,把饲料中一些非营养物质转变成营养物质,也有相反的代谢过程,但是最终的结果有利于饲料营养价值的提高。新鲜采摘的桑叶含有大量水分,容易腐烂和发霉,难以贮藏,但利用微生物发酵法可以成功解决这一问题;而且,发酵后桑叶中粗蛋白质含量显著增多,粗纤维含量降低,生物活性成分也得到了极大的优化,如表1 所示。
表1 桑叶经不同菌种发酵后营养成分含量的变化Table 1 Changes in nutrient contents of mulberry leaves after fermentation by different strains |
| 菌种 Strains | 接种比 Inoculation ratio | 营养成分含量变化 Changes in nutrient contents | 参考文献 References |
|---|---|---|---|
| 植物乳酸杆菌 Lactobacillus plantarum | — | 发酵前粗蛋白质含量为163.68 g/kg, 发酵后粗蛋白质含量为190.03 g/kg, 与发酵前相比上升16.10% | [5] |
| 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis | — | 发酵前粗蛋白质含量为163.68 g/kg, 发酵后粗蛋白质含量为191.87 g/kg,与 发酵前相比上升17.22% | [5] |
| 枯草芽孢杆菌、植物乳酸杆菌 Bacillus subtilis and Lactobacillus plantarum | 1∶1 | 发酵前粗蛋白质含量为163.68 g/kg, 发酵后粗蛋白质含量为201.76 g/kg, 与发酵前相比上升23.26% | [5] |
| 蜡状芽孢杆菌、植物乳酸菌、 产朊假丝酵母、康宁木霉 Bacillus cereus, Lactobacillus plantarum, Candida utilis and Trichoderma koningii | 2∶1∶1∶1 | 发酵前粗蛋白质含量为26.32%, 粗纤维含量为15.00%;发酵后 粗蛋白质含量高达34.46%, 粗纤维含量降至9.97% | [10] |
| 枯草芽孢杆菌、米曲霉、酿酒酵母、 植物乳杆菌 Bacillus subtilis, Aspergillus oryzae, Saccharomyces cerevisiae and Lactobacillus plantarum | 1∶1∶1∶1 | 发酵前可溶性蛋白质含量为62.09 mg/g, 发酵后可溶性蛋白质含量为171.52 mg/g, 与发酵前相比提高了176.52% | [11] |
2 发酵桑叶替代部分蛋白质饲料原料在畜禽生产中的应用
发酵桑叶中富含糖类、蛋白质、脂肪、维生素、矿物元素等,尤其是蛋白质,其含量能达到24.47%左右。因此,在畜禽的养殖生产中使用发酵桑叶不仅有助于满足动物的营养需求,而且可以节省一部分蛋白质饲料原料资源。
2.1 发酵桑叶替代部分蛋白质饲料原料在猪生产中的应用
张娜娜等[12]在基础饲粮中添加15%的发酵饲料桑粉饲喂“杜×大×长”三元杂交育肥猪,发现平均日增重显著增加,同时肌肉剪切力显著降低,不饱和脂肪酸的含量有所提高。呼红梅等[13]在生长阶段的“杜×长×大”商品猪饲粮中用4%、8%、12%的发酵桑叶依次替换1.0%、2.0%和3.0%的豆粕粉,结果发现,在生长阶段添加12%的发酵桑叶并不影响猪的生长发育和肌肉成分的变化,而且肌肉中肌苷酸的含量也增加,肉质的口感得到了改善。将发酵桑叶作为部分蛋白质原料应用到猪的基础饲粮中可以减少豆粕、玉米的添加量,应用发酵桑叶作为生猪饲粮中部分蛋白质原料,经计算,1头重30~110 kg的生长育肥猪,可节约5.44 kg的豆粕,占对照组饲粮豆粕用量的13.85%,10 000头可减少54.40 t豆粕用量,可在一定程度上缓解进口大豆的压力[13]。
2.2 发酵桑叶替代部分蛋白质饲料原料在牛生产中的应用
吴配全等[14]用10%和20%的发酵桑叶分别替代饲粮中的部分玉米、豆腐渣和青贮玉米秸秆,用于生长育肥牛的饲养,结果表明,在肉牛的日增重和干物质摄入量方面差异并不显著,其中试验组与对照组间存在类似的日增重比率,说明用发酵桑叶替代部分精料对肉牛的增长没有影响,而且在一定量范围内替代部分蛋白质饲料原料是可行的。Zhou等[15]报道,用8%的桑叶青贮饲料代替肉牛饲粮中的玉米、棉花籽粉对其生长性能无显著影响。Niu等[16]指出,桑叶青贮饲料可增加反刍动物瘤胃中的细菌数量,有助于提高饲料的消化率和微生物蛋白的合成。肖建中等[17]用30%的发酵桑叶替代饲粮中的部分豆粕和酒糟来喂养新晁黄牛,发现黄牛生长性能、抗氧化指标及肉质都有明显改善,自身免疫功能也得到了增强。李昊帮等[18]发现,饲粮中30%比例的发酵桑叶粉能增加肉牛肌肉中苏氨酸、蛋氨酸和酪氨酸的含量。此外,发酵后的桑叶片其苦涩感减少,可以使牛的食欲增强,更有利于对饲粮的采食。
2.3 发酵桑叶替代部分蛋白质饲料原料在羊生产中的应用
发酵后的桑叶口味酸甜,适口性好,消化率高,作为非常规饲料应用地越来越广泛。刘自新等[19]用青贮桑叶与青贮玉米混合饲料饲喂杂交肉羊,发现肉羊的料重比显著下降,日增重也有所增高,认为青贮混合饲粮的饲喂效果比单一性青贮饲粮饲喂效果较好。凌浩等[20]发现,用青贮桑叶同比例替代青贮玉米饲喂奶山羊,其粗蛋白质的表观消化率显著增加,山羊的泌乳量和干物质摄入量也有所增加。根据反刍动物的消化特征,大部分的营养物质聚集在瘤胃内,然后经过发酵消化分解,最后被消化道吸收利用。Wang等[21]研究发现,用桑叶青贮可以取代苜蓿青贮改善羔羊瘤胃内微生物区系,增加双歧杆菌和乳酸杆菌的数量;同时,桑叶青贮使瘤胃内Schwartzia菌群增加,Schwartzia菌群被发现与甲烷排放量呈负相关,能使甲烷气体的排放受到抑制。而且,桑叶在瘤胃发酵过程中可以提高瘤胃中乙酸盐的浓度,促进瘤胃上皮基底层和颗粒层细胞的发育,增加代谢消化能力[22]。
2.4 发酵桑叶替代部分蛋白质饲料原料在鸡生产中的应用
大量的研究结果表明,发酵后的桑叶粉能显著提高鸡的肉品质、生长性能以及鸡群对氨基酸和蛋白质等营养物质的吸收和利用。黄静等[23]研究发现,饲喂发酵桑叶粉比普通桑叶粉能更有效地促进肉鸡生长,他们用不同桑叶品种和发酵桑叶分别替代3%的次粉,发现二者之间存在差异,发酵桑叶在提高胡须鸡日均采食量和降低料重比方面的效果好于桑叶粉。这可能与桑叶经微生物发酵后,其营养价值提高,单宁等抗营养因子被降解,鸡群的食欲增加等有关。Ding等[24]在研究发酵桑叶对肉鸡肉品质的影响时发现,发酵桑叶粉可显著增加肉鸡胸肌和大腿肌中肌苷单磷酸(IMP)、总氨基酸(TAA)、必需氨基酸(EAA)和鲜味氨基酸(DAA)的含量,改善胸肌中多不饱和脂肪酸(PUFA)和必需脂肪酸(EFA)含量,且以6%和9%的剂量效果较为显著。此外,发酵桑叶还具有降低胸肌剪切力的作用,可以避免在蒸煮过程中造成的营养流失,对肉的嫩度有一定的改善作用。Chen等[25]报道,在饲粮中添加4%的桑叶粉可以显著增加鸡肠道中拟杆菌属、普氏菌属和巨单胞菌属的相对丰度,改善了鸡肠道健康。
3 发酵桑叶提高畜禽生产性能及畜产品品质的机制研究
3.1 提高机体的抗氧化能力
抗氧化能力的提高对改善动物机体健康有重要的意义。机体在氧化反应过程中会生成大量的自由基,这些自由基会破坏组织细胞,导致身体老化和一些慢性疾病的发生。发酵桑叶的抗氧化能力主要来自以下2个方面。
3.1.1 发酵桑叶中的抗氧化物质
3.1.1.1 黄酮类物质
桑叶黄酮类化合物如黄酮醇、二氢黄酮、桑酮醇等在抗氧化方面发挥着重要的作用。黄酮类物质不仅能降低自由基的产生,还能清除氧化过程中的游离基,从而阻止链反应的继续进行,达到延缓衰老的作用。研究证实,桑叶总黄酮被认为是潜在的抗氧化活性剂,对1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)和羟基自由基(·OH)清除的半数抑制浓度(IC50)分别能达到60.51和156.05 mg/mL,且清除速率与浓度之间存在着一定的量效关系[26]。在机体内自由基的清除能力主要取决于黄酮类化合物的结构,当黄酮类化合物捕捉到自由基时,其分子结构上的酚羟基可以向自由基提供氢离子,使自由基变得不活跃,而自身转变为类黄酮苯氧基,也可再与第2个自由基进行反应,生成稳定的醌式结构,中断自由基的氧化过程[27]。此外,维生素C和黄酮类化合物组合的复合抗氧化剂能表现出协同作用,这可能与二者之间相互反应,彼此之间相互修复再生,形成了稳定的循环系统有关。
3.1.1.2 多酚类物质
Sun等[28]发现,使用酶解法(碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性酶、胰蛋白酶)对桑叶蛋白有限水解可增强其抗氧化效率,使桑叶中总酚和总糖的含量显著增加,同时1%的酶底物水平和2 h的水解时间是利用中性酶获得更高抗氧化水解物的最佳条件。Khan等[29]从桑叶甲醇萃取物中提取的酚类物质能显著清除DPPH·和·OH,增加Fe2+的还原能力,其多酚含量与抗氧化电位之间存在高度相关性。Fe、Cu等金属离子可催化多种自由基产生,尤其以Fe2+介导的脂质过氧化过程,是羟基等自由基产生的信使,许多多酚类物质结构中的配位基团较多,可与这些金属离子形成稳定的络合物,使含有这些金属离子的酶活性受到抑制,终止自由基的产生,而且酚羟基结构还能供给活性氧自由基活泼氢,使自由基失活,抑制氧化反应的进行。桑叶中富含多种多酚类化合物,其含有绿原酸成分的多酚化合物组合通常具有抗氧化协同作用,而不含有绿原酸的组合则具有相反的作用,表明绿原酸可能是桑叶发挥抗氧化作用的主要成分之一。
3.1.2 发酵桑叶可以提高动物机体抗氧化物质的产生
总抗氧化能力(T-AOC)是评价机体抗氧化能力的总体指标;超氧化物歧化酶(SOD)是机体防御氧化应激最主要的抗氧化酶之一,对氧自由基的清除有着高度的专一性,在维持机体抗氧化功能方面发挥重要作用。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)能够消除多种过氧化物,进而保护细胞免受损伤。桑叶中的活性物质能上调机体GSH-Px和SOD的mRNA表达,增强抗氧化能力[30]。研究证实,发酵桑叶有提高T-AOC的趋势,20%比例的发酵桑叶能使GSH-Px活性增加18.3%,10%比例的发酵桑叶能使SOD活性提升3.6%,影响机体的抗氧化机能[31]。此外,发酵桑叶粉可以改变肉质的外观表现。据分析,这可能是由于桑叶具有的抗氧化作用减慢了氧合肌红蛋白的氧化程度,从而维持了肉色的新鲜度[32]。这表明,增加抗氧化能力可能减缓肉类的腐败和变质,改善肉品质量。
3.2 调节机体的糖、脂代谢
3.2.1 调控糖、脂代谢的相关途径
桑叶中多糖和1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)等活性成分具有良好的降血糖和降血脂的效果,可以调节机体的代谢紊乱。Li等[33]研究发现,桑叶多糖和1-DNJ的混合使用可通过上或下调节肝脏中的限速酶,上调胰腺中胰岛素-1和胰岛素-2的表达,调节肝脏葡萄糖代谢的功能。而且适量范围内的桑叶水提取物可减少脂肪酸合成代谢酶的表达,动员脂肪氧化[34]。胡雪芹[35]研究报道,1-DNJ可显著降低代谢相关基因极长链酰基辅酶A脱氢酶(ACADVL)、磷脂酸磷酸酶(PAP)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)、细胞色素P4504A(CYP4A)、ATP酶(ATPase)、载脂蛋白A4(APOA4)的表达,减少胆固醇和脂类的合成,而且尿液代谢组分析发现,1-DNJ可显著减少尿液中3-磷酸甘油醛、半乳糖醇的含量,提高顺乌头酸的含量,有效促进葡萄糖进入三羧酸循环途径,同时降低尿液中乙酰乙酸和棕榈酰肉碱等含量,减少酮体物质的生成。研究发现桑叶水提取物通过调节脂联素(ADPN)/腺苷单磷酸活化蛋白激酶(AMPK)介导的信号通路和参与相关代谢(不饱和脂肪酸的生物合成、花生四烯酸代谢和甘油磷脂代谢)可抑制3T3-L1前脂肪细胞分化和成熟脂肪细胞发育过程中的脂质积累,降低脂滴的聚集[36]。这表明,发酵桑叶中的活性成分可调控相关代谢途径的某一环节或关键酶,维持血脂水平的稳定。
3.2.2 调节脂类的运输
血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量的高低直接反映了机体的健康状况,可作为脂代谢的评价指标。当动物血液中TC的含量升高时,会影响血液的黏稠度,严重时会堵塞血管,导致动脉粥样硬化的发生。桑叶中的活性成分可通过影响TC、TG及其他相关指标,改善机体血脂水平。Chan等[37]发现,桑叶提取物可显著降低饲喂高脂饲粮白兔血清中TC、TG和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量,调节血脂水平。而且研究发现,桑叶水提取物可影响构成高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和LDL-C的主要载脂蛋白——载脂蛋白A1(ApoA1)和载脂蛋白B(ApoB)的成分,通过升高血清ApoA1含量,降低ApoB的含量,进而影响胆固醇的代谢转运,从而达到降血脂的功效[38]。发酵桑叶中的活性成分可影响脂类的运输,降低胆固醇含量,保护动物机体的健康。
3.3 增强机体免疫力
桑叶中的活性物质具有防止癌细胞产生,提高机体免疫机能,抑制染色体变异和基因突变等作用,其多糖成分具有良好的免疫增强作用,主要表现在可以提高细胞免疫和体液免疫[39]。李维[40]研究发现,桑叶多糖不仅增强了巨噬细胞吞噬活性和小鼠体液免疫水平,还激活了脾脏内淋巴细胞的增殖,促使T细胞发挥细胞免疫作用。用DEAE-52纤维素和SephadexG-100柱色谱提取和纯化桑叶中的多糖成分发现,多糖可作为免疫增强剂,提高接种新城疫(ND)疫苗鸡群的血清抗体滴度、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白A(IgA)抗体水平,激活T淋巴细胞群参与细胞免疫[41-42]。Zhao等[43]发现,桑叶多糖可提升仔猪胸腺和脾脏等免疫器官指数,增加IgG和其他细胞因子的含量。此外,桑叶可促进外周淋巴器官的增殖,进一步提升免疫机能,适宜剂量的桑叶还有助于血清酸性磷酸酶(ACP)和溶菌酶活性的增加,对机体起着防御保护作用。上述研究结果说明桑叶多糖可通过影响免疫器官和外周免疫器官来保护动物机体,诱发机体产生免疫应答反应。
3.4 调节肠道菌群
肠道菌群是机体健康的守护者,有助于肠道消化和吸收各种营养物质,维持肠道的生态平衡。研究发现,发酵桑叶可影响肠道菌群的变化,使肠道中乳酸菌等有益菌的数量增加,改善肠道内的菌群环境。分析其原因可能是桑叶发酵后pH降低,为机体肠道益生菌提供了适宜生长的环境条件,从而促进了肠道中有益菌的增殖,有益菌通过制造细菌素、过氧化氢和有机酸类物质,来阻断致病菌对肠道黏膜的攻击。而且桑叶中黄酮成分可与肠道菌群相互作用,调节微生态失衡,促进益生菌的增殖。桑叶槲皮素等成分可增加肠道菌群的多样性。桑叶多糖成分可减少大肠杆菌数量,增加肠道内双歧杆菌和乳酸杆菌的增殖,降低仔猪在断奶早期的腹泻率[44]。发酵桑叶还可通过促进优势菌群的增殖,调节肠道内环境,改变肠道菌群组成。
3.5 抗炎作用
桑叶活性成分是天然的抗炎、抗氧化剂[45],可保护机体免受细菌与病毒的侵袭。当机体防御系统受到破坏时,可诱发酰基水解酶(AH)和磷脂酶A2(PLA2)的活化,使细胞膜磷脂在脂肪氧化酶(LOX)和环氧合酶(COX)的参与下,激活花生四烯酸代谢途径,其反应产物如前列腺素等会导致机体不适,造成疼痛、发热和白细胞渗出等炎症,而桑叶中的多酚类化合物可通过抑制LOX和COX的活性,抑制花生四烯酸代谢,从而起到消除炎症的作用[46]。新绿原酸是桑叶中的一种酚类化合物,研究发现它对脂多糖(LPS)刺激的A549细胞产生的炎症反应表现良好的抗炎特性,可抑制炎症激活物的表达[47]。其机制表现为多酚类物质可抑制核因子-κB(NF-κB)的传导通路,从而激活巨噬细胞参与炎症反应过程,或通过抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)途径中氨基末端激酶、胞外信号调节激酶的产生,减少炎症介质的释放[48-49]。Chao等[50]还发现,富含槲皮素和山奈酚的桑叶提取物可抑制DNA的氧化损伤和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的单核白细胞黏附,并减少NF-κB的表达。TNF-α是一种多效性促炎细胞因子,可激活肝细胞生成急性期蛋白,引发急性反应,适量范围内的TNF-α可对机体产生保护作用,但过量的TNF-α可增强中性粒细胞的功能,对周围细胞产生毒性作用。白细胞介素-1(IL-1)可分为IL-1α和IL-1β 2种分型,主要由淋巴细胞、巨噬细胞以及单核细胞诱导分泌,可刺激产生白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)等炎性因子,放大炎症效应。Lim等[51]指出,桑叶中的活性成分可减少促炎标志物的生成,终止其介导的炎症反应,从而保护组织细胞免受到损伤。此外,桑叶可对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌等产生抑菌环,影响细菌细胞壁和细胞膜的通透性以及蛋白质的合成,其中以绿原酸、芦丁、柚柑等多酚成分效果显著。
4 小结
发酵桑叶的营养物质组成优于多种畜禽饲料,是一种潜在的蛋白质原料。目前,我国桑叶资源丰富,具有广阔的开发前景,将发酵桑叶投入到畜牧生产中,不仅有助于节省部分豆粕等蛋白质饲料的用量,还能促进动物生长,调节肠道菌群的生态平衡和机体脂质代谢,提高机体免疫力,发挥抗炎作用。此外,发酵桑叶的添加还能减少反刍动物甲烷的排放,保护生态环境。但桑叶在不同品种、不同采收时期、不同叶位、不同发酵菌剂、不同发酵时间等条件下,所得发酵桑叶蛋白质含量不同,今后还需从桑树品种、采收方式等方面进行深入研究,摸索出最优的发酵方法,熟化加工工艺,以保证发酵桑叶可作为绿色安全的饲粮蛋白质源,科学研制配合饲料,用作畜牧生产。