链格孢菌广泛分布和存在于各种环境中,是污染食物和饲料的真菌之一,链格孢霉毒素由链格孢菌产生,是一类有毒的真菌次生代谢产物[1-2]。目前已经分离出数十种链格孢霉毒素,其中有4类链格孢霉毒素——交链孢酚(alternariol,AOH)、交链胞酚单甲醚(alternariol monomethyl ether,AME)、细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid,TeA)及腾毒素(tentoxin,TEN),由于毒性较强,污染广泛,具有基因毒性等多种原因而被深入研究。AOH和AME具有基因毒性,可以导致DNA的损伤,AOH具有胚胎毒性,能影响胚胎的发育[3⇓-5]。TeA对家禽的生长有抑制作用,对鸡胚具有致死性[6-7]。在我国,小麦、小麦粉等都有链格孢霉毒素检出的报道[8⇓-10],但玉米中链格孢霉毒素检出的报道较少。山东省作为畜牧大省,玉米是主要的饲料原料之一,在畜禽养殖的日常中有重要的地位。链格孢霉毒素未经降解和处理,对家禽具有潜在的风险,链格孢霉毒素通过食物链的积累甚至可能对人类有潜在的危害。
高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法与超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)法常被应用于分析水果和谷物基质中AOH、AME、TeA和TEN的污染情况[11-12]。QuEChERS(quick, easy, cheap, effective, rugged and safe)是一种最早被应用于水果与蔬菜基质中农药残留回收的前处理方法,之后该方法很快应用在多种基质中,用于提取不同物质[13]。与传统的固相萃取(SPE)法相比较,QuEChERS法有着简单、快速、低价和高效等多种优点,因此被广泛的应用。国内配合饲料及其原料中缺乏链格孢霉毒素的检测方法、毒素污染的背景值及链格孢霉毒素对畜禽健康影响的相关研究。因此,本试验旨在建立一种对玉米中4种链格孢霉毒素AOH、AME、TeA和TEN同时检测的QuEChERS-UHPLC-MS/MS法,使用检出限(LOD)和定量限(LOQ)试验、准确度和精密度试验及基质效应(matrix effects,ME)试验验证该方法,并检测山东省30份饲用玉米中4种链格孢霉毒素污染的背景值,以期为我国饲料链格孢霉毒素的风险评估提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂
主要仪器:AR224CN电子分析天平(奥豪斯仪器常州有限公司)、1290/6460三重4级杆液质联用仪(Agilent公司)、N-EVAP 11203030138型氮吹仪(Organomation公司)、SPH-211β型控温摇床(上海世平试验设备有限公司)、3K15型高速离心机(Sigma公司)、涡旋仪(北京大龙公司)、超纯水仪(MilliQ公司)。
主要试剂:TEN(纯度值>99%,CAS编号28540-82-1,生产批号20210403)、AOH(纯度值>99%,CAS编号641-38-3,生产批号20210403)、AME(纯度值>99%,CAS编号26894-49-5,生产批号20210205)、TeA(纯度值>99%,CAS编号610-88-8,批号20210709),青岛普瑞邦生物工程有限公司;甲酸(色谱纯,生产批号20210710)和乙腈(色谱纯,生产批号20210806),天津市科密欧化学试剂有限公司;氯化钠(分析纯,生产批号20210909),国药集团;津隆® 0.22 μm有机相滤膜,天津市科亿隆实验设备有限公司。
1.2 样品采集
按照《饲料采样》(GB/T 14699.1—2005)中方法,2021年5月至2022年5月期间收集山东省不同地区饲料厂和养殖场的饲用玉米样品30份。首先将玉米充分粉碎,然后过40目筛,自封袋密封,-20 ℃冻存。
1.3 样品前处理
称取约5 g(精确至1 mg)充分粉碎的饲用玉米样品,置于50 mL聚丙烯无菌离心管中,添加10 mL超纯水后摇匀,添加10 mL 0.1%甲酸-乙腈混合溶液,水平摇床300 r/min提取1 h,添加1 g氯化钠,涡旋3 min,8 000 r/min离心10 min,提出上清液,过有机相滤膜,待测。
1.4 标准溶液的准备
标准储备液:分别准确称取AOH、AME、TeA、TEN 1.000 mg,用乙腈配成20 mg/L单标贮备液,-20 ℃保存。使用时,各吸取2 mL储备液,混合配成4种链格孢霉毒素浓度均为5 mg/L的混标溶液。
标准工作液:将4种链格孢霉毒素浓度均为5 mg/L的混标溶液用2%甲酸-乙腈溶液配制成浓度分别为1、5、10、50、100 μg/L的标准工作液。
基质标准溶液:饲用玉米样品经1.3步骤前处理后,提取液使用氮吹仪吹干,用标准工作液重新溶解,获得1、5、10、50、100 μg/L基质标准溶液。
1.5 色谱和质谱条件
1.5.1 色谱条件
试验色谱柱选用安捷伦EC-C18柱(100 mm×2.1 mm,2.7 μm);设置试验柱温为30 ℃;设置进样体积为20 μL;设置流速为0.2 mL/min;流动相A与B分别选用乙腈与超纯水;设置梯度洗脱程序,时间与流动相0~0.5 min 90% A,0.5~3 min 60% A,3~5 min 5% A,5~7 min 90% A。
1.5.2 质谱条件
电喷雾离子源(ESI);电压(IS):35 00 V;将监测模式设置为多反应监测模式检测(MRM),TeA、AOH、AME和TEN的电离模式均采用ESI-,母离子/子离子对设为单位分辨,4种链格孢霉毒素的保留时间均为2 min,高纯氮气为碰撞气。TeA、AOH、AME和TEN的质谱测定参数见表1 。
表1 TeA、AOH、AME和TEN的质谱测定参数Table 1 Mass spectrometry parameters of TeA, AOH, AME and TEN |
| 毒素 Toxins | 电离模式 Ionization mode | 母离子 Parent ion/ (m/z) | 子离子 Daughter ion/ (m/z) | 碰撞能量 Collision energy/eV | 锥孔电压 Cone voltage/ V |
|---|---|---|---|---|---|
| 细交链孢菌酮酸TeA | ESI- | 196 | 139 | 18 | 140 |
| 交链孢酚AOH | ESI- | 257 | 213 | 22 | 140 |
| 交链胞酚单甲醚AME | ESI- | 271 | 256 | 14 | 130 |
| 腾毒素TEN | ESI- | 413 | 141 | 12 | 140 |
1.6 UHPLC-MS/MS检测AOH、AME、TeA和TEN的标准曲线
用UHPLC-MS/MS检测AOH、AME、TeA、TEN不同浓度梯度标准溶液,读取峰面积值,以4种链格孢霉毒素的浓度(X,μg/L)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标,得出4种链格孢霉毒素的回归方程,确定线性范围和相关系数(R2)。
1.7 基质效应
在链格孢霉毒素检测的过程中,由于检测的基质不同,导致在实际检测的过程中,4种链格孢霉毒素的实际测量值会出现偏大和偏小2种不同的情况,这2种变化异常的情况都是由基质效应造成的。当实际的测量值偏大时,定义为基质增强效应,当实际的测量值偏小时,定义为基质抑制效应。基质效应定义为基质标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率:当基质效应值<0.8时,基质抑制效应对试验过程造成影响,实际的测量值偏小;当基质效应值>1.2时,基质增强效应对试验过程会造成影响,实际的测量值偏大;当0.8<基质效应值<1.2时,试验中基质效应形成的影响不大,可以省略不计[14]。当存在基质增强和抑制效应影响时,测量值会出现偏大和偏小的情况,此时应对基质效应值进行判断,如果基质效应对试验造成了影响,则应使用基质标准曲线作为回归方程,对测量值进行校准,通过校准后的曲线计算来消除基质效应的影响,使得实际测量结果准确。
1.8 检出限与定量限
检出限和定量限的计算公式如下:
LOD=3N/K;
LOQ=10N/K。
式中:LOD为检出限;LOQ为定量限;N为仪器噪声水平;K为标准曲线的斜率。
1.9 准确度试验
准确称量5 g粉碎后的饲用玉米样品15个,随机分成3组,每组5个样品。分别加入含4种链格孢霉毒素的混标溶液,制备出5、10和50 μg/kg 3种浓度的玉米添加样品。样品经1.3步骤前处理后上机检测样品中AOH、AME、TeA、TEN含量,以空白样为对照。最后通过公式推算出4种链格孢霉毒素的准确度(加标回收率)。
P(%)=[(X1-X0)/m]×100。
式中:P为准确度;m为加入4种链格孢霉毒素的标准物质的量;X1为加标后饲用玉米试样中的测量值;X0为未加标试样的测量值。
1.10 精密度试验
准确称取粉碎后的空白样饲用玉米5 g,加入含4种链格孢霉毒素的混标溶液至样品终浓度为10 μg/kg,制备10个平行样。样品经1.3步骤前处理后上机检测样品中AOH、AME、TeA、TEN含量,计算精密度[相对标准偏差(RSD)]。
RSD(%)=(S/ )×100。
式中:RSD为相对标准偏差;S为标准差; 为算数平均值。
1.11 山东省30份饲用玉米样品中AOH、AME、TeA和TEN的UHPLC-MS/MS检测
完成上述1.5~1.10步骤后,建立玉米中4种链格孢霉毒素的QuEChERS-UHPLC-MS/MS检测方法。对1.2中采集的30份饲用玉米样品,使用1.3中的前处理方法处理,试验中每个饲用玉米样品设置3个平行样,然后上机检测,得到饲用玉米中AOH、AME、TeA和TEN的检出率、含量范围、平均值和中位数。
1.12 数据统计与分析
运用Excel 2019进行数据处理和绘图。
2 结果与分析
2.1 QuEChERS-UHPLC-MS/MS法检测AOH、AME、TeA、TEN的检出限、定量限及玉米基质效应
由表2 可知,4种链格孢霉毒素的基质效应值<0.8,4种链格孢霉毒素在玉米基质中均存在基质抑制作用。通过对基质效应值进行判断,本试验需要使用基质标准曲线作为回归方程进行校准,以抵消基质抑制作用带来的影响。以混标溶液的基质标准曲线浓度为横坐标(X,μg/L),以相应的峰面积为纵坐标(Y)作图,AOH、AME、TeA和TEN回归方程的相关系数全部高于0.995 8,线性关系良好。试验得到的AOH、AME、TeA和TEN的检出限分别为0.73、0.57、0.92和0.25 μg/L,定量限分别为2.45、1.90、3.06和0.83 μg/L。
表2 AOH、AME、TeA和TEN的线性范围、回归方程、相关系数、基质效应、检出限和定量限Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients, matrix effects, LOD and LOQ for AOH, AME, TeA and TEN |
| 毒素 Toxins | 线性范围 Linear ranges/ (μg/L) | 回归方程 Regression equations | 相关系数 Correlation coefficients | 基质效应 Matrix effects | 检出限 LOD/ (μg/L) | 定量限 LOQ/ (μg/L) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 细交链孢菌酮TeA | 1~100 | y=5.144 8x+1.992 7 | 0.995 8 | 0.09 | 0.92 | 3.06 |
| 交链孢酚AOH | 1~100 | y=38.015x-5.686 2 | 0.999 8 | 0.22 | 0.73 | 2.45 |
| 交链胞酚单甲醚AME | 1~100 | y=694.69x-463.94 | 0.999 2 | 0.42 | 0.57 | 1.90 |
| 腾毒素TEN | 1~100 | y=77.282x-2.150 4 | 0.999 2 | 0.35 | 0.25 | 0.83 |
2.2 准确度和精密度
由表3 可知,在5、10和50 μg/kg 3种加标情况下,TeA、AOH、AME和TEN的加标回收率分别为74.70%~84.60%、77.94%~103.84%、72.61%~102.14%,71.16%~73.16%,RSD分别为4.08%~8.36%、2.03%~4.07%、1.80%~4.61%、1.99%~2.40%。
表3 TeA、AOH、AME和TEN毒素的加标回收率和相对标准偏差Table 3 Spiked recoveries and RSD of TeA, AOH, AME and TEN |
| 毒素 Toxins | 添加浓度 Added concentrations/(μg/kg) | 加标回收率 Spiked recoveries/% | 相对标准偏差 RSD/% |
|---|---|---|---|
| 细交链孢菌酮酸TeA | 5 10 50 | 74.70 77.39 84.60 | 5.70(n=5) 8.36(n=10) 4.08(n=5) |
| 交链孢酚AOH | 5 10 50 | 103.84 89.12 77.94 | 2.03(n=5) 5.80(n=10) 4.07(n=5) |
| 交链胞酚单甲醚AME | 5 10 50 | 102.14 95.11 72.61 | 1.80(n=5) 4.20(n=10) 4.61(n=5) |
| 腾毒素TEN | 5 10 50 | 73.16 72.45 71.16 | 2.31(n=5) 2.40(n=10) 1.99(n=5) |
2.3 山东省30份饲用玉米样品中AOH、AME、TeA和TEN的背景值
由表4 可知,在检测的山东省30份饲用玉米样品中,有96.67%(29/30)的玉米样品至少受到1种链格孢霉毒素的污染,4种链格孢霉毒素中AOH和AME的检出率较高,分别为96.67%和93.30%,TEN未检出,4种链格孢霉毒素的含量平均值为AOH>TeA>AME>TEN。
表4 玉米样品中TeA、AOH、AME和TEN的检测结果Table 4 Detection results of TeA, AOH, AME and TEN in maize samples (n=30) |
| 毒素 Toxins | 检出率 Positive rate/% | 含量范围 Content ranges/ (μg/kg) | 平均值 Mean values/ (μg/kg) | 中位数 Median/ (μg/kg) |
|---|---|---|---|---|
| 细交链孢菌酮酸TeA | 40.00(12/30) | 2.45~54.96 | 16.41 | 11.98 |
| 交链孢酚AOH | 96.67(29/30) | 2.51~71.21 | 23.61 | 20.25 |
| 交链胞酚单甲醚AME | 93.30(28/30) | 1.63~13.01 | 7.20 | 6.91 |
| 腾毒素TEN | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 |
3 讨论
3.1 饲用玉米基质中AOH、AME、TeA和TEN的QuEChERS-UHPLC-MS/MS检测方法的建立
QuEChERS法可以根据基质的变化而做出相应的调整,通过调整无水硫酸镁的用量和吸附剂的用量,使得QuEChERS法更适合处理玉米。在QuEChERS法进行前处理时,添加一定量的无水硫酸镁的目的是为了消除前处理步骤中多余的水份。预试验分别尝试添加4、3、2和1 g无水硫酸镁,发现加入无水硫酸镁后,饲用玉米容易结块。提取液加入无水硫酸镁后,无水硫酸镁和水发生反应的同时会放出大量热量,饲用玉米样品受热后容易发生结块。因此,本试验在使用QuEChERS法进行前处理时选择不添加无水硫酸镁。QuEChERS法前处理所得的提取液在乙腈初步提取后,一般提取液需要使用吸附剂净化,以达到更好的提取效果。QuEChERS法常用的吸附剂有3类,即N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)和十八烷基硅烷(ODS,C18),应用PSA和GCB可以用于抵消糖类、脂肪酸和色素等物质的影响,而C18对非极性物质吸附效果较好。玉米中糖类和色素等物质含量较少,有报道说PSA和GCB对AOH和AME有很强的吸附作用,因此本试验不再添加PSA和GCB[14]。本试验尝试在每毫升提取液中添加25 mg C18的吸附剂,结果发现C18吸附剂对TeA有明显的吸附作用,鉴于此,本试验中不添加任何吸附剂。本试验中流动相B尝试设置为0.1%甲酸、0.1%甲酸铵和水,结果发现甲酸和甲酸铵的加入都会导致TeA受到抑制,因此本试验选取超纯水为流动相B。
在样品中,4种链格孢霉毒素在不同的基质条件下建立的检测方法中,检出限和定量限也不同。在不同基质中面对相同的链格孢霉毒素,基质效应造成的影响也不同。程家兴等[11]利用UHPLC-MS/MS法测定了红枣的TEN、AME、AOH和TeA,检出限的区间是0.5~12.4 μg/kg,基质效应对AOH、AME、TeA和TEN造成的影响较小。王硕等[15]对小麦制品中的4种链格孢霉毒素使用UHPLC-MS/MS法进行了检测,得到的TEN、AME、AOH和TeA检出限的区间是0.01~0.1 μg/kg,定量限的区间是0.02~0.3 μg/kg,AOH、AME、TeA和TEN全部受到了基质抑制效应的影响。而在本试验中,AME、AOH、TeA和TEN检出限的区间是0.25~0.92 μg/kg,定量限的区间是0.83~3.06 μg/kg,AME、AOH、TeA和TEN全部受到了基质抑制效应的影响。张子庚等[16]对芒果中的6种链格孢霉毒素进行了检测,检出限的区间为0.6~3 μg/kg,6种链格孢霉毒素中交链孢烯(altenuene,ALT)、TEN、细格菌素(altenusin,ATS)以及带皮芒果全果AME存在基质增强效应,TeA、AOH以及去皮芒果中AME存在基质抑制效应。鲁玲玲等[17]对红枣及其制品中链格孢霉毒素进行检测发现,红枣酒中TeA为基质抑制效应,AOH为基质增强效应,红枣提取物中TEN为基质抑制效应。本试验建立的QuEChERS-UHPLC-MS/MS检测方法有着较低的检出限和定量限,AOH、AME、TeA和TEN的检出限分别为0.73、0.57、0.92、0.25 μg/L,定量限分别为2.45、1.90、3.06和0.83 μg/L。基质为玉米情况下,AOH、AME、TeA和TEN全部受到了基质抑制效应的影响,测量值偏小,通过对基质效应值的计算,判定需要使用基质标准曲线进行校准。
由于前处理方法的差异和试验所选择的基质不同,AOH、AME、TeA和TEN的回收率和精密度也不相同。Xing等[18]选用UHPLC-MS/MS法测定了果泥中的多种链格孢霉毒素,其中AOH、AME、TeA和TEN的回收率为79.5%~106.7%,RSD低于9.78%。吴希等[19]选用UHPLC-MS/MS法测定了麦类中的多种链格孢霉毒素,其中AOH、AME、TeA和TEN的回收率为70.7%~101.3%,RSD低于4.11%。邢家溧等[20]用UHPLC-MS/MS法测定了奶粉中的多种链格孢霉毒素,其中AOH、AME、TeA和TEN的回收率为86.4%~114.3%,RSD低于7.13%。而使用本试验所建立的QuEChERS-UHPLC-MS/MS检测方法,4种链格孢霉毒素的加标回收率为71.16%~103.84%,RSD低于8.36%。因此,与麦类和奶粉等含水较少的基质进行对比,本试验所建立的检测方法有着较低的RSD和较高的回收率,符合方法建立的相关要求。
3.2 山东省饲用玉米中AOH、AME、TeA和TEN的污染情况
苏爽等[21]选用UHPLC-MS/MS法,检测了2018年10月郑州市超市和农贸市场47份玉米中4种链格孢霉毒素的污染情况,其中66.0%(31/47)的样品至少受1种链格孢霉毒素污染,TeA、AOH、TEN和AME的检出率分别为23.4%、10.6%、4.3%和63.8%。本试验中,山东省30份饲用玉米中TeA、AOH和AME的检出率分别为40.00%、96.67%和93.30%,TEN未检出。与苏爽等[21]的报道相比较,本试验中AOH、AME和TeA的检出率明显升高。出现这3种链格孢霉毒素检出率升高的原因可能是由于采用时间和采样地不同,本试验的采样地选取了养殖场和饲料厂,饲用玉米贮存过程中容易遭到链格孢霉毒素的污染,导致养殖场和饲料厂的饲用玉米品质变差。
目前主要使用的饲料原料是玉米和小麦,而在小麦粉中,链格孢霉毒素的检出率也很高。卢素格等[22]检测了河南省182份小麦粉样品,其中AOH的检出率为10.4%(19/182),AME的检出率为42.9%(78/182),TeA的检出率为91.2%(166/182),TEN的检出率为45.6%(83/182)。代永霞等[23]检测了赤峰地区120份小麦粉样品,其中TeA的检出率达到90%,TEN的检出率高达100%,AOH和AME的检出率达到96.7%。与玉米相比,小麦粉中TEN的检出率明显升高,这表明在不同的饲料原料中,链格孢霉毒素的污染程度不完全相同,比如玉米可能不容易受到TEN的污染,而在小麦中TEN却很容易检出。食用油也是链格孢霉毒素污染源之一,Bansal等[24]报道了食用油中AOH和AME的污染情况,兰丰等[25]报道了食用油中存在AME的污染。综上所述,在饲料原料玉米和小麦中链格孢霉毒素存在广泛的污染情况,食用油中也存在链格孢霉毒素污染。因此,根据饲料原料的污染情况,可以推测家禽和家畜的配合饲料中也会存在链格孢霉毒素的污染。遗憾的是,目前家禽和家畜的相关毒理和毒性报道很少,无法对链格孢霉毒素的风险进行综合评估,相关的试验和工作仍然需要开展,才能消除这种潜在的风险。
4 结论
通过检出限和定量限试验、准确度和精密度试验及基质效应试验验证,本试验运用QuEChERS-UHPLC-MS/MS法检测玉米中4种链格孢霉毒素AOH、AME、TeA和TEN,具有精密度高、稳定性好、易于操作和价格低廉等多种优点。通过对山东省30份饲用玉米样品进行检测,发现AOH、AME和TeA这3种链格孢霉毒素的检出率较高,存在潜在风险,应当引起重视。