烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)依赖性组蛋白去乙酰化酶Sirtuin在新陈代谢、氧化应激、炎症及线粒体功能等方面发挥重要作用[1]。Sirtuin利用NAD+依赖性去乙酰化酶消除很多组蛋白与非组蛋白中的乙酰基,以调控下游转录因子。Sirtuins共含7种亚型,分别是位于细胞质的沉默信息调节因子2相关酶(silent information regulator 2 related enzyme,SIRT)2,位于细胞核的SIRT1、SIRT6、SIRT7,以及位于线粒体的SIRT3、SIRT4、SIRT5[2]。过去针对Sirtuin家族的研究主要集中于SIRT1,目前其他成员的研究同样成为焦点,特别是在机体内部多个器官均有分布的SIRT3,在细胞代谢、生物合成、细胞凋亡和氧化应激等方面均可以发挥调控作用[3]。近年来,有研究证实SIRT3介导奶牛乳腺炎的发病过程,炎症的发病过程与SIRT3的丰度相关,而SIRT3的丰度受到底物与表达水平的双重调控。因此,了解SIRT3的调控机制及在奶牛乳腺炎中发挥的作用对于靶向防治炎性疾病有重要意义。
1 Sirtuin结构和催化机制
沉默信息调节因子2(silent information regulator 2,SIR2)是在20世纪70年代于酿酒酵母细胞沉默转录时被发现的蛋白家族,其性质高度保守,产物对基因组稳定性存在影响[4],后将真核生物中与SIR2同源的蛋白称为Sirtuin。Sirtuin属于Ⅳ类组蛋白去乙酰化酶(histone deacetvlase,HDAC)中的第Ⅲ类。Sirtuin蛋白家族在不同的生物学过程如细胞凋亡、脂质代谢、线粒体合成、细胞应激、胰岛素分泌和衰老等都发挥着重要的作用[5]。对真核生物和原核生物的催化核心区域进行系统分类可将Sirtuin分为5个主要类型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和U)[6]。SIRT3属于第Ⅰ类,通常被认为分布于线粒体中,但最近的研究发现SIRT3在线粒体外也有分布,在受到应激刺激的细胞内全长型SIRT3可被酶裁剪为成熟SIRT3,因成熟SIRT3缺乏线粒体定位信号,会非特异性地分布于细胞的细胞核、细胞质以及线粒体中[3]。
哺乳动物Sirtuin的催化核心区域包含一大一小2个基本结构域,较大的结构域具有较强的保守性,由Rossmann折叠构成,较小的结构域包含1个锌指结构和螺旋构件[7]。大小结构域之间的催化口袋包括A、B、C 3个活性位点,其中A点参与NAD+腺嘌呤-核糖部分的结合,B点参与烟酰胺-核糖部分的结合,C点是NAD+结合口袋深处。底物乙酰基被Sirtuin去乙酰化后转移到NAD+的二磷酸腺苷(ADP)-核糖基部分,同时1分子NAD+连接的ADP-核糖部分与烟酰胺之间的糖苷键被切断,分裂为1分子O-乙酰基-ADP-核糖(O-acetyl-ADP-ribose)和1分子烟酰胺(nicotinamide,NAM)[8]。Sirtuin偶联了去乙酰基和NAD+断裂2种催化活性,并产生了重要产物——O-乙酰基-ADP-核糖。上文提到并非所有Sirtuin蛋白都具有去乙酰化酶活性,SIRT1、SIRT2、SIRT3和SIRT7具有去乙酰化酶活性,但SIRT7的活性较弱或检测不到,而SIRT4则主要表现ADP-核糖基转移酶活性[9]。
2 SIRT3参与的主要调控机制
2.1 SIRT3与核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)
NF-κB是包含p65(RelA)、RelB、c-Rel、NF-κB1(p105/p50)以及NF-κB2(p100/p52)7位成员的蛋白家族[10]。NF-κB信号通路是调节炎症的关键信号通路,NF-κB主要通过参与炎性反应建立的基因转录而调节炎性疾病[11]。NF-κB与SIRT3存在拮抗关系,上调SIRT3的表达可以抑制NF-κB信号通路,还可以同时抑制高浓度非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acids,NEFA)诱导的核易位和促炎反应的信号通路。奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)的NF-κBp65磷酸化水平会被NEFA诱导而上升,激活NF-κB信号通路,增加炎性因子如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的mRNA水平,说明高浓度的NEFA会激活BMEC内的炎性通路。在大多数情况下,静止中的NF-κB最主要的异源二聚体NF-κBp50/p65与核因子κB抑制因子α(IκBα)结合于细胞质中;NF-κBp50/p65在机体受到刺激时与IκBα分离,易位后进入细胞核内作为转录因子调节炎性因子表达[12]。在此过程内,NF-κBp65诱导的磷酸化对NF-κB的转录活性有十分关键的作用,患病奶牛磷酸化p65(p-NF-κBp65)与NF-κBp65比值的升高是NF-κB信号通路被激活的证明[13]。高浓度的NEFA具有脂毒性,奶牛脂解产生的NEFA约有1/2被BMEC吸收,促进乳腺炎性反应,NEFA在肝细胞和中性粒细胞等多种细胞中也可激活炎性通路,BMEC中的IL-6、IL-1β和p-NF-κBp65的表达对NEFA的反应表现出剂量依赖性[14]。NF-κBp65的乙酰化可以调节炎性反应,使RelA/p65亚基的赖氨酸-310脱乙酰化抑制RelA/p65亚基的转导,从而抑制NF-κB依赖性基因表达的转录[15]。BMEC中SIRT3的过表达显著降低IL-6、IL-1β和p-NF-κBp65的丰度,证实SIRT3可以抑制NF-κB信号通路的激活[13]。
2.2 SIRT3与活性氧(reactive oxygen species,ROS)
机体新陈代谢的过程中会产生有未配对电子的分子和原子,称为自由基,正常情况下自由基的产生和清除是动态平衡的。奶牛泌乳期的代谢非常旺盛,BMEC会产生大量的ROS。高浓度的NEFA会影响到ROS的生成,围产期奶牛耗氧量大幅增加,耗氧量越大生成的自由基也就越多,最后导致机体产生氧化应激[16]。细胞膜脂质层被ROS过氧化产生的大量丙二醛(malondialdehyde,MDA)会引起和加重DNA氧化损伤和蛋白质变性等,属于不可逆损伤[17],对细胞造成严重损害。添加抗氧化剂后,NEFA的促氧化作用得到了抑制,说明NEFA是导致氧化应激的主要原因[18]。SIRT3是ROS生成的主要调控因子,可直接去乙酰化并激活抗异柠檬酸脱氢酶2(isocitrate dehydrogenase 2,IDH2)以及氧化因子锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD),启动抗氧化,防止细胞内累积ROS[19]。转录因子叉形头转录因子O亚型3a(forkhead box O3a,FOXO3a)会被SIRT3去乙酰化诱导表达,激活的FOXO3a可进一步促进MnSOD和IDH2的表达,消除已积累的ROS[3]。
2.3 SIRT3与单磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)
作为机体内重要的信号通路,AMPK同时也是主要由单磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)激活和调控的一种调节细胞物质和能量平衡稳定的重要蛋白,通过使其下游的多种蛋白包括SIRT3和叉头盒(forkhead box,Fox)磷酸化达到调控分解与合成代谢的效果[20]。叉头框蛋白O1(forkhead box protein O1,FoxO1)的转录活性会随着SIRT3去乙酰化而增强,达到缓解线粒体氧化损伤的目的。SIRT3与AMPK关系密切,AMPK通过增加NAD+激活SIRT3抑制NF-κB途径中的p65,阻止促炎细胞因子的转录[21],同时也可促进MnSOD表达减轻机体氧化应激[22],而SIRT3也会去乙酰化从而激活AMPK,在脂质代谢中发挥重要作用。
3 SIRT3在奶牛乳腺炎中的作用
围产前期(产前3周),胎儿压迫瘤胃,与营养代谢、激素紊乱等共同降低奶牛的干物质采食量,瘤胃内发酵物不足使丙酸缺乏,从而导致葡萄糖缺乏并上调脂肪分解信号,激活激素敏感脂肪酶(hormone-sensitive triglyceride lipase,HSL)[29]。HSL磷酸化后转移到脂滴促进脂肪动员,并将脂肪内的甘油三酯(triglyceride,TG)水解为NEFA和甘油[30-31]。奶牛能否成功度过能量负平衡(negative energy balance,NEB)阶段取决于NEFA的浓度是否超出肝脏代谢上限[32]。当NEFA浓度超出肝脏分解代谢能力的上限时会进行不完全β-氧化,此时就会产生β-羟丁酸(beta hydroxy butyric acid,BHBA),同时机体又会处于严重的NEB状态,此时奶牛机体易患乳腺炎。
目前已知SIRT3在治疗奶牛乳腺炎中发挥的作用主要包括:一是SIRT3对BMEC氧化应激产生的ROS的抑制和清除。BMEC氧化应激会使细胞受损导致奶牛乳腺炎,ROS水平的上升属于BMEC氧化应激时的特征之一,可以激活NF-κB信号通路并诱导促炎细胞因子表达[13]。已有研究证实SIRT3是ROS生成的主要调控因子[33],通过促进MnSOD的mRNA的表达,将MnSOD去乙酰化以清除ROS[34]。同时,SIRT3可以激活氨基酸代谢中的谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)、三羧酸循环中的琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)等的活性,增强线粒体呼吸作用,减少ROS的生成[35]。BMEC的氧化应激程度因SIRT3抑制清除ROS而恢复正常水平,减少细胞受损,从而降低奶牛乳腺炎的发病率。二是SIRT3对NF-κB信号通路的抑制。患病奶牛体内通常出现NEFA激活NF-κB信号通路,受到刺激后NF-κB的p65亚基迅速与IκBα解离,转移至细胞核与靶基因相应位点结合,增强细胞内的炎性应答,也增加促炎因子的释放,最终导致机体产生炎性损伤。在BMEC中,SIRT3的过表达可以显著降低p-NF-κBp65、IL-6和IL-1β的丰度,为SIRT3抑制NF-κB信号通路的作用提供支持[13]。NF-κB信号通路受到抑制后可减轻奶牛乳腺炎的发病。三是SIRT3对NEFA的抑制。NEB状态是导致奶牛患乳腺炎的主要原因之一,此状态下脂解产生的NEFA约1/2会被BMEC吸收[36]。NEFA不仅会激活NF-κB信号通路,同时高浓度的NEFA具有脂毒性,造成BMEC炎性水平增加。研究表明,SIRT3通过去乙酰化调节长链酰基辅酶A脱氢酶(long chain acyl-coA dehydrogenase,LCAD)的活性,促进脂肪酸氧化,从而减少TG和脂肪酸氧化中间产物的累积[37]。TG是NEFA的主要来源,SIRT3的过表达可以减少体内NEFA的累积,减弱NEFA的脂毒性及其对NF-κB信号通路的影响,减少奶牛乳腺炎的发病。
4 小结
SIRT3通过去乙酰化调控下游蛋白质,并与NF-κB、AMPK等底物和NEFA、ROS等物质相互作用,在细胞能量代谢、生物合成、细胞凋亡、热量限制及氧化应激等方面发挥作用。目前对SIRT3的研究还未达到其同家族SIRT1的深度,对SIRT3与乳腺炎之间的确切调控关系及机制还有着很大的空白,通过深层次研究SIRT3与乳腺炎发病可为SIRT3靶向治疗乳腺炎提供新的方向。