Effects of Diets with Different Neutral Detergent Fiber Levels on Rumen Microbial Population Structure of Tarim Wapiti

GUAN Peng; REN Jiangang; HUANG Jianzhi; SHENG Yueyun; JIA Cunhui; TURSUN Saimaiti; QIAN Wenxi

doi:10.12418/CJAN2023.113

Chinese Journal of Animal Nutrition >

2023 , Vol. 35 >Issue 2: 1206 - 1218

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2023.113

RESEARCH PAPER

Effects of Diets with Different Neutral Detergent Fiber Levels on Rumen Microbial Population Structure of Tarim Wapiti

GUAN Peng ^,¹ ,
REN Jiangang ¹ ,
HUANG Jianzhi ¹ ,
SHENG Yueyun ¹ ,
JIA Cunhui ³ ,
TURSUN Saimaiti ⁴ ,
QIAN Wenxi ^,¹^,²^,^*

Expand

¹ Collage of Animal Science and Technology， Tarim University， Alar 843300， China
² Tarim Key Laboratory of Animal Husbandry Science and Technology of Xinjiang Construction Corps， Alar 843300， China
³ Jimsar District Grid Service Management Centre， Changji 831700， China
⁴ China People’s Property Insurance Co.， Ltd. Kizilsu Kirgiz Branch， Kizilsu 845350， China

* professor， E-mail： qianwenxizj@163.com

Received date: 2022-08-05

Online published: 2023-02-13

Fold

Abstract

This experiment was conducted to study the effects of effects of diets with different neutral detergent fiber （NDF） levels on rumen microbial population structure of Tarim wapiti. Five female Tarim wapiti with similar body weight [（180±3） kg]， the same age （5 years） and permanent rumen fistula were selected and fed five experimental diets which contained 47%， 42%， 37%， 32% and 27% NDF， respectively， in a 5×5 Latin square design. Each experiment lasted for 21 days， and the total experiment lasted for 105 days. The total fecal collection method was used to determine the nutrient apparent digestibility of Tarim wapiti， and the population structure of bacteria and protozoa was studied by high-throughput sequencing technology and morphological observation. The results showed as follows： 1） there was no significant difference in apparent digestibility of NDF and organic matter （OM） among all groups （P>0.05）. The apparent digestibility of acid detergent fiber （ADF） and crude protein （CP） of 27% NDF level group was significantly higher than that of 47% NDF level group （P<0.05）. 2） A total of 10 genera of protozoa were counted in the experiment， and the Entodinium， Diplodinium， Epidinium， Metadinium and Dasytricha were the dominant populations. The rumen protozoa activity of 47% and 42% NDF level groups was significantly higher than that of other groups （P<0.05）. The rumen protozoa density of 47% NDF level group was significantly higher than that of 37%， 32% and 27% NDF level groups （P<0.05）. 3） The protozoa proportion of Entodinium in rumen of 47% and 42% NDF level groups was significantly lower than that of 32% and 27% NDF level groups （P<0.05）， and the protozoa proportion of Diplodinium in rumen of 47% NDF level group was significantly higher than that of 37%， 32% and 27% NDF level groups （P<0.05）. 4） At phylum level， the Bacteroidetes， Fibrobacteres， Firmicutes and Proteobacteria were the dominant phyla. The relative abundance of Bacteroidetes in rumen of 27% NDF level group was significantly higher than that of other groups （P<0.05）， and the relative abundance of Fibrobacteres in rumen of 32% and 27% NDF level groups was significantly lower than that of 47% and 42% NDF level groups （P<0.05）. At genus level， the Prevotella_1， Rikenellaceae_RC9_gut_group and Fibrobacter were the dominant genus. The relative abundance of Prevotella_1 in rumen of 32% and 27% NDF level groups was significantly higher than that of 47% and 42% NDF level groups （P<0.05）， and the relative abundance of Fibrobacter in rumen of 47% and 42% NDF level groups was significantly higher than that of 37%， 32% and 27% NDF level groups （P<0.05）. In conclusion， diets with different NDF levels have little effect on the nutrient apparent digestibility of Tarim wapiti， the overall structure of the rumen population of Tarim wapiti is stable and has strong tolerance to high fiber diets.

Key words： Tarim wapiti; rumen population; rumen protozoa; Fibrobacter

Cite this article

GUAN Peng , REN Jiangang , HUANG Jianzhi , SHENG Yueyun , JIA Cunhui , TURSUN Saimaiti , QIAN Wenxi . Effects of Diets with Different Neutral Detergent Fiber Levels on Rumen Microbial Population Structure of Tarim Wapiti[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2023 , 35(2) : 1206 -1218 . DOI: 10.12418/CJAN2023.113

塔里木马鹿是新疆重点养殖的特色经济动物，也是马鹿22个亚种中唯一栖息在荒漠环境中的亚种^[1]，其对粗纤维水平高的荒漠植物（如芦苇、柽柳、骆驼刺等）有很强的消化和适应能力，这可能与其瘤胃内环境和微生物菌群结构有关。饲粮结构是影响瘤胃微生物数量、结构的重要因素^[2]。吐尔逊阿依·赛买等^[3]研究表明，高纤维水平饲粮可显著提高塔里木马鹿瘤胃原虫的活力，但对原虫总数影响不显著。方翟等^[4]通过用青绿饲料代替粗饲料后对塔里木马鹿瘤胃原虫进行形态学观察，结果显示添加青绿饲料后，瘤胃内原虫总数、原虫活力及原虫比例均未出现显著变化。本试验利用高通量测序等技术手段，对瘤胃微生物优势菌群（原虫、细菌）结构进行检测，探讨不同中性洗涤纤维（NDF）水平饲粮对塔里木马鹿瘤胃菌群的影响，以期为塔里木马鹿对高纤维水平饲粮的适应提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点与时间

本试验于2019年7—9月在塔里木大学动物科学学院试验站鹿场进行，试验分5期进行，每个试验期21 d，总试验期105 d。

1.2 试验动物与试验设计

本试验选择体重[（180±3） kg]接近、年龄（5岁）相同且安装永久瘤胃瘘管的雌性塔里木马鹿5头，采用5×5拉丁方试验设计，以干物质采食量3.2 kg/d为标准设计5组试验饲粮，饲粮NDF水平分别为47%、42%、37%、32%和27%，试验分5期进行，每个试验期21 d，每期预试期15 d，正试期6 d，并于每期正试期第5~6天上午饲喂完2 h后分别收集粪便和采集瘤胃液，并更换下一组试验饲粮。

1.3 试验饲粮与饲养管理

试验饲粮参照《中国养鹿学》^[5]和《新疆马鹿饲养技术》^[6]中建议的马鹿营养需要进行配方设计，其组成及营养水平见表1。将5头塔里木马鹿分别单独饲养在5个代谢笼中，试验开始前使用阿托品驱虫。每天09：00和20：00各饲喂1次，饮水自由。

表1 试验饲粮组成及营养水平（风干基础）

Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets （air-dry basis）

项目 Items	NDF水平 NDF levels/%
项目 Items	47	42	37	32	27
原料 Ingredients
棉籽壳 Cottonseed hull	20.5	25.8	23.2	22.0	14.8
苜蓿干草 Alfalfa hay	39.4	21.6	23.5	13.0	7.5
杨树叶 Poplar leaves	20.1	22.9	18.1	15.0	17.7
豆粕 Soybean meal	10.7	7.5	8.1	5.1	4.9
玉米粉 Corn flour	4.8	10.2	11.4	22.0	18.4
小麦麸 Wheat bran	3.0	5.2	8.1	12.5	20.1
棉籽粕 Cottonseed meal		5.3	6.1	8.9	15.1
食盐 NaCl	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
预混料 Premix^1）	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
合计 Total	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0
营养水平 Nutrient levels^2）
消化能 DE/（MJ/d）	36.5	36.5	36.5	36.5	36.5
粗蛋白质 CP	14.31	14.31	14.31	14.31	14.31
钙 Ca	0.55	0.55	0.55	0.55	0.55
磷 P	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30

1）预混料为每千克饲粮提供 Premix provided the following per kg of diets：VA 940 IU，VE 20 IU，S 200 mg，Fe 24 mg，Cu 8 mg，Mn 40 mg，Zn 40 mg，I 0.3 mg，Se 0.2 mg，Co 0.1 mg。

2）鹿用饲料缺失消化能数据，配方中参照了羊用饲料消化能，其余为实测值。The DE data of deer feed lacked， and the formula referred to the DE of sheep feed， while the others were measured values.

1.4 样品采集与处理

粪样、饲料样采集：每期试验正试期的第5~6天08：00饲喂2~3 h后采用全收粪法收集粪便和剩料；称重备用，选取未污染粪样喷洒少量的10%硫酸，保存于-20 ℃，用于营养物质表观消化率的测定。

瘤胃液采集：用无菌瘤胃采样塑料管从瘤胃的前、中、后3个部位取瘤胃液，用2层纱布过滤，尽快对原虫活性进行检测，其余瘤胃液用固定液固定后于-80 ℃保存，用以微生物多样性的测定。

1.5 指标测定

1.5.1 营养物质表观消化率的测定

将饲料样和粪样在65 ℃干燥48 h，回潮24 h后称重，计算水分含量，风干的样品粉碎过40目筛。粗灰分含量采用灼烧法测定，粗蛋白质（CP）含量采用凯氏定氮法测定，NDF和酸性洗涤纤维（ADF）含量采用范式纤维分析法测定，具体测定方法参照《饲料分析及饲料质量检测技术》^[7]。相关计算公式如下：

有机物（OM）含量（%）=饲料总质量（%）-水分含量（%）-粗灰分含量（%）；

某营养物质表观消化率（%）=[（该营养物质摄入量-粪中该营养物质含量）/该营养物质摄入量]×100。

1.5.2 塔里木马鹿瘤胃原虫种类形态学鉴定及种群结构测定

参照《反刍动物营养学》^[8]做染色处理并在显微镜下观察对比鉴定塔里木马鹿瘤胃原虫形态。采集的瘤胃液用2层纱布过滤，将过滤的瘤胃液保存在39 ℃条件下，5 min内用显微镜进行活力检测，具体方法参照吐尔逊阿依·赛买提^[9]原虫活力的观察方法。用5倍固定液稀释经2层纱布过滤的样品，用血球计数板在显微镜下观察计数，具体方法参照王梦芝等^[10]原虫计数法计数。

1.6 样本DNA的提取及PCR扩增

使用Hipure Soil DNA提取试剂盒按照说明提取瘤胃液微生物总DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度计法检测DNA质量；使用细菌通用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'）和806R（5'-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3'）对细菌16S rRNA可变区V4区进行PCR扩增，对定量合格的文库纯化后采用llumina MiSeq平台进行测序。使用Uparse软件（Uparse v7.0.1001， http：//drive5.com/uparse/）进行操作分类单元（OTU）聚类。基于均一化的OTU丰度表，使用QIIME软件分析多样性指数。

1.7 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 21.0软件中ANOVA模型进行单因素方差分析，多重比较用Duncan氏法进行统计分析。试验数据用平均值和均值标准误（SEM）表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿营养物质表观消化率的影响

由表2可见，NDF、ADF、CP和OM表观消化率均随着饲粮NDF水平的降低而增加。各组之间NDF和OM表观消化率差异不显著（P>0.05）。27% NDF水平组的ADF、CP表观消化率最高，且显著高于47% NDF水平组（P<0.05）；但37%、32%和27% NDF水平组之间ADF、CP表观消化率差异不显著（P>0.05）。

表2 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿营养物质表观消化率的影响（风干基础）

Table 2 Effects of diets with different NDF levels on nutrient apparent digestibility of Tarim wapiti （air-dry basis）%

项目 Items	NDF水平 NDF levels/%					SEM	P值 P-value
项目 Items	47	42	37	32	27	SEM	P值 P-value
中性洗涤纤维 NDF	67.88	68.51	69.22	69.71	70.19	0.79	0.101
酸性洗涤纤维 ADF	49.99^c	50.44^bc	52.34^ab	52.91^ab	53.22^a	0.42	0.039
粗蛋白质 CP	71.51^b	72.81^ab	73.89^a	73.96^a	74.14^a	0.23	0.043
有机物 OM	63.99	64.48	65.84	66.41	67.02	1.49	0.081

	同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同或无字母表示差异不显著（P>0.05）。下表同。
	In the same row， values with different small letter superscripts mean significant difference （P<0.05）， while with the same or no letter superscripts mean no significant difference （P>0.05）. The same as below.

2.2 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿瘤胃原虫种类形态学及瘤胃原虫结构的影响

2.2.1 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿瘤胃原虫种类形态学的影响

由图1可见，瘤胃原虫形态学不受饲粮NDF水平的影响。在不同NDF水平饲粮条件下，塔里木马鹿瘤胃中均观察到以下原虫形态，2个目，分别为内毛目和毛口目；4个亚科，分别为内毛亚科、头毛亚科、双毛亚科和等毛科；10个属，分别为内毛属（Entodinium）、双毛属（Diplodinium）、单甲属（Eremoplastron）、多甲属（Polyplastron）、后毛属（Metadinium）、鞘甲属（Elytroplastron）、前毛属（Epidinium）、厚毛属（Dasytricha）、等毛属（Isotrichicha）、真双毛属（Eudiplodinium）。

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图1 塔里木马鹿瘤胃部分原虫形态结构

Fig.1 Morphology and structure of some protozoan in rumen of Tarim wapiti （400×）

2.2.2 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿瘤胃原虫活力和密度的影响

由表3可见，随着饲粮NDF水平的降低，塔里木马鹿瘤胃原虫活力呈降低趋势。47%和42% NDF水平组瘤胃原虫活力均在83%以上，显著高于其他各组（P<0.05）；27% NDF水平组瘤胃原虫活力为79.21%，显著低于除32% NDF水平组的其他各组（P<0.05）。随着饲粮NDF水平的降低，塔里木马鹿瘤胃原虫密度呈下降趋势。47% NDF水平组瘤胃原虫密度显著高于37%、32%和27% NDF水平组（P<0.05）。

表3 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿瘤胃原虫活力和密度的影响

Table 3 Effects of diets with different NDF levels on rumen protozoa activity and density of Tarim wapiti

项目 Items	NDF水平 NDF levels/%					SEM	P值 P-value
项目 Items	47	42	37	32	27	SEM	P值 P-value
原虫活力 Protozoa activity/%	84.33^a	83.21^a	81.25^b	80.01^bc	79.21^c	0.011	0.033
原虫密度 Protozoa density/（×10⁵个/mL）	6.12^a	5.66^ab	5.13^b	4.68^bc	4.05^c	0.008	0.041

2.2.3 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿瘤胃原虫种群结构的影响

由表4可见，瘤胃内毛属、双毛属、前毛属、后毛属和厚毛属比例较高，是优势种群，尤其是内毛属原虫比例最高，占到总数的90%以上。瘤胃内毛属和鞘甲属原虫比例随着饲粮NDF水平降低而增多，其中，47%和42% NDF水平组瘤胃内毛属原虫比例显著低于32%和27% NDF水平组（P<0.05）。瘤胃双毛属、前毛属原虫比例随着饲粮NDF水平降低而降低，其中，47% NDF水平组瘤胃双毛属原虫比例显著高于37%、32%和27% NDF水平组（P<0.05）。47%和42% NDF水平组瘤胃多甲属比例显著高于37%、32%和27% NDF水平组（P<0.05）。37%NDF水平组瘤胃等毛属原虫比例最高，显著高于其他各组（P<0.05）。

表4 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿瘤胃原虫种群结构的影响

Table 4 Effects of diets with different NDF levels on rumen protozoa population structure of Tarim wapiti%

项目 Items	NDF水平 NDF levels/%					SEM	P值 P-value
项目 Items	47	42	37	32	27	SEM	P值 P-value
内毛属 Entodinium	79.54^b	80.49^b	82.18^ab	82.92^a	83.41^a	0.11	0.041
双毛属 Diplodinium	4.21^a	3.66^ab	2.35^b	2.01^b	1.87^b	0.08	0.043
单甲属 Eremoplastron	0.49	0.31	0.20	0.20	0.33	0.18	0.067
鞘甲属 Elytroplastron	0.43	0.44	0.45	0.47	0.51	0.22	0.083
多甲属 Polyplastron	0.94^a	0.88^a	0.48^b	0.51^b	0.55^b	0.03	0.021
后毛属 Metadinium	2.91	2.52	3.02	2.81	2.61	0.15	0.081
真双毛属 Eudiploinium	0.61	0.68	0.29	0.42	0.78	0.17	0.078
前毛属 Epidinium	7.87	7.87	7.05	6.88	6.11	0.87	0.099
厚毛属 Dasytricha	2.31	2.57	2.89	2.99	3.14	0.47	0.053
等毛属 Isotrichicha	0.66^b	0.58^c	1.09^a	0.80^b	0.69^b	0.01	0.024

2.3 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿瘤胃细菌种群结构的影响

2.3.1 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿瘤胃门水平细菌种群结构的影响

由表5可见，在门水平上，塔里木马鹿瘤胃细菌相对丰度在0.1%以上的有7个，其中拟杆菌门（Bacteroidetes）、纤维杆菌门（Fibrobacteres）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）为优势菌门，相对丰度占到了总菌群的90%以上。瘤胃Bacteroidetes相对丰度占到了总菌群的50%以上，27% NDF水平组瘤胃Bacteroidetes相对丰度极显著高于其他各组（P<0.05）。瘤胃Fibrobacteres相对丰度随着饲粮NDF水平降低而降低，32%和27% NDF水平组瘤胃Fibrobacteres相对丰度显著低于47%和42% NDF水平组（P<0.05）。Firmicutes、Proteobacteria和螺旋菌门（Spirochaetes）平均相对丰度分别在15%、4%和1%左右，饲粮NDF水平对瘤胃Firmicutes、Proteobacteria和Spirochaetes相对丰度影响不显著（P>0.05）。27% NDF水平组瘤胃无壁菌门（Tenericutes）相对丰度显著低于其他各组（P<0.05）。37% NDF水平组瘤胃广古菌门（Euryarchaeota）相对丰度显著高于其他各组（P<0.05）。

表5 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿瘤胃细菌种群结构的影响

Table 5 Effects of diets with different NDF levels on rumen bacterial population structure of Tarim wapiti%

项目 Items	NDF水平 NDF levels/%							SEM	P值 P-value
项目 Items	47	42	37		32	27		SEM	P值 P-value
门水平 Phylum levels
拟杆菌门 Bacteroidetes	54.40^bc	49.48^c	61.39^bc		66.58^b	83.57^a		2.73	<0.001
纤维杆菌门 Fibrobacteres	23.78^a	26.91^a	11.45^ab		2.70^b	1.06^b		1.99	<0.001
厚壁菌门 Firmicutes	16.16	17.21	13.28		18.08	10.72		1.33	0.404
变形菌门 Proteobacteria	2.47	3.58	7.31		5.67	2.99		0.77	0.237
无壁菌门 Tenericutes	2.01^a	1.61^a	3.46^a		4.52^a	0.25^b		0.56	0.013
螺旋菌门 Spirochaetes	0.94	1.08	1.69		1.73	1.18		0.28	0.882
广古菌门 Euryarchaeota	0.23^b	0.14^b	1.42^a		0.71^b	0.23^b		0.16	<0.001
属水平 Genus levels
普雷沃氏菌属1 Prevotella_1	21.83^b	19.27^b	22.31^ab		29.96^a	40.62^a		1.78	<0.001
理研菌科RC9肠道群 Rikenellaceae_RC9_gut_group	19.17	17.22	22.12		17.94	17.48		1.55	0.110
纤维杆菌属 Fibrobacter	23.78^a	26.91^a	11.45^b		2.70^c	1.06^c		1.99	<0.001
琥珀酸弧菌科UCG-002 Succinivibrionaceae_UCG-002	0.68^b	0.85^b	4.47^a		2.31^a	0.46^b		0.36	0.041
厌氧原菌属 Anaeroplasma	1.18^b	1.23^b	4.34^a		3.09^a	0.21^c		0.06	0.021
克里斯滕森菌科R7群 Christensenellaceae_R7_group	3.78	4.11	2.35		3.57	3.06		0.33	0.771
普雷沃氏菌科UCG-003 Prevotellaceae_UCG-003	2.69	3.23	4.45		6.15	5.27		0.21	0.079
普雷沃氏菌科UCG-001 Prevotellaceae_UCG-001	0.92	0.86	3.04		2.72	2.66		0.31	0.051
鳞球菌属 Sphaerochaeta	0.24	0.40	1.33		1.11	1.03		0.09	0.054
丛毛单胞菌属 Comamonas	0.15^c	0.38^b	0.39^b		0.74^a	1.13^a		0.08	0.041
链球菌属 Streptococcus	0.40	0.51	1.76		0.86	0.39		0.10	0.071
琥珀酸弧菌属 Succinivibrio	0.51	0.56	1.54		1.05	0.44		0.21	0.055
脱硫弧菌属 Desulfovibrio	0.85	1.41	0.69		0.91	0.64		0.22	0.061
肉桂乳突杆菌属 Papillibacter	1.11	1.17	0.23		0.35	0.44		0.12	0.051
丁酸弧菌属2 Butyrivibrio_2	0.76	0.73	0.93		1.74	0.51		0.10	0.059
项目 Items	NDF水平 NDF levels/%							SEM	P值 P-value
项目 Items	47	42		37	32		27	SEM	P值 P-value
瘤胃球菌科NK4A214群 Ruminococcaceae_NK4A214_group	1.27	1.42		1.12	1.33		0.72	0.40	0.058
Saccharofermentans	0.74	0.98		0.20	0.47		0.45	0.09	0.071
Candidatus_Methanomethylophilus	0.23^b	0.14^b		1.42^a	0.71^a		0.23^b	0.03	0.041
毛螺旋菌科XPB1014群 Lachnospiraceae_XPB1014_group	0.64	0.55		0.74	1.18		0.73	0.11	0.055
解琥珀酸菌属 Succiniclasticum	0.89	1.07		1.06	1.41		0.85	0.12	0.088

2.3.2 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿瘤胃属水平细菌种群结构的影响

由表5可见，在属水平上，平均相对丰度大于1%的细菌有普雷沃氏菌属1（Prevotella_1）、理研菌科RC9肠道群（Rikenellaceae_RC9_gut_group）、纤维杆菌属（Fibrobacter）、琥珀酸弧菌科UCG-002（Succinivibrionaceae_UCG-002）、厌氧原菌属（Anaeroplasma）、克里斯滕森菌科R7群（Christensenellaceae_R7_group）、普雷沃氏菌科UCG-003（Prevotellaceae_UCG-003）、普雷沃氏菌科UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）、瘤胃球菌科NK4A214群（Ruminococcaceae_NK4A214_group）和解琥珀酸菌属（Succiniclasticum）10个菌属，其中，Prevotella_1、Rikenellaceae_RC9_gut_group和Fibrobacter平均相对丰度占到了58%，属于优势菌属。32%和27%NDF水平组瘤胃Prevotella_1相对丰度显著高于47%和42% NDF水平组（P<0.01）。瘤胃Fibrobacter相对丰度随着饲粮NDF水平降低而降低，47%和42% NDF水平组瘤胃Fibrobacter相对丰度显著高于37%、32%和27% NDF水平组（P<0.05），但47%和42% NDF水平组之间显著不显著（P>0.05）。37%和37% NDF水平组瘤胃Succinivibrionaceae_UCG-002、Candidatus_Methanomethylophilus、Anaeroplasma相对丰度显著高于47%、32%和27% NDF水平组（P<0.05）。瘤胃丛毛单胞菌属（Comamonas）相对丰度随着饲粮NDF水平降低而增加，47% NDF水平组瘤胃Comamonas相对丰度显著低于其他各组（P<0.05）。各组之间瘤胃Rikenellaceae_RC9_gut_group、Christensenellaceae_R7_group、Prevotellaceae_UCG-003、Prevotellaceae_UCG-001、鳞球菌属（Sphaerochaeta）、链球菌属（Streptococcus）、琥珀酸弧菌属（Succinivibrio）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、肉桂乳突杆菌属（Papillibacter）、丁酸弧菌属2（Butyrivibrio_2）、Ruminococcaceae_NK4A214_group、Succiniclasticum和毛螺旋菌科XPB1014群（Lachnospiraceae_XPB1014_group）相对丰度均差异不显著（P>0.05）。

2.3.3 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿瘤胃几种纤维降解菌相对丰度的影响

由表6可见，本试验共检测到Fibrobacter、梭菌属（Clostridium）、黄色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）、白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）、溶纤维丁酸弧菌（Butyriuihrio fibrisoluens）、小瘤胃杆菌（Ruminobczcter paruum）6种与纤维降解相关的菌类。瘤胃Fibrobacter、Ruminococcus flavefaciens、Ruminococcus albus和Butyriuihrio fibrisoluens相对丰度随着饲粮NDF水平降低而降低，其中，47%和42% NDF水平组瘤胃Fibrobacter相对丰度显著高于37%、32%和27% NDF水平组（P<0.05），47% NDF水平组瘤胃Ruminococcus flavefaciens和Ruminococcus albus相对丰度显著高于32%和27% NDF水平组（P<0.05），47%和42% NDF水平组瘤胃Butyriuihrio fibrisoluens相对丰度显著高于32%和27% NDF水平组（P<0.05）。各组之间瘤胃Clostridium和Ruminobczcter paruum相对丰度无显著差异（P>0.05）。

表6 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿瘤胃几种纤维降解菌相对丰度的影响

Table 6 Effects of diets with different NDF levels on relative abundances of several cellulolytic bacteria in rumen of Tarim wapiti

项目 Items	NDF水平 NDF levels/%					SEM	P值 P-value
项目 Items	47	42	37	32	27	SEM	P值 P-value
纤维杆菌属 Fibrobacter	23.78^a	26.91^a	11.45^b	2.70^c	1.06^c	1.99	<0.001
黄色瘤胃球菌 Ruminococcus flavefaciens	0.17^a	0.18^a	0.14^ab	0.07^b	0.05^b	0.01	0.011
白色瘤胃球菌 Ruminococcus albus	0.07^a	0.04^b	0.02^b	0.02^b	0.02^b	0.01	0.044
溶纤维丁酸弧菌 Butyriuihrio fibrisoluens	0.18^a	0.12^a	0.09^ab	0.06^b	0.06^b	0.01	0.040
梭菌属 Clostridium	0.07	0.04	0.02	0.02	0.02	0.02	0.062
小瘤胃杆菌 Ruminobczcter paruum	0.001	0.001	0.001	0.001	0.001	1.00	0.899

3 讨论

3.1 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿营养物质表观消化率的影响

本试验中，塔里木马鹿在饲喂不同NDF水平饲粮时，NDF、ADF、CP和OM表观消化率均随着饲粮中NDF水平的降低而增加，但各组之间NDF和OM表观消化率差异不显著。47% NDF水平组的ADF、CP表观消化率显著低于37%、32%和27% NDF水平组，37%、32%和27% NDF水平组之间差异均不显著。田祖光等^[11]选用装有永久瘘管的牦牛饲喂不同NDF水平的玉米秸秆（49.26% NDF水平的发酵玉米秸秆和63.38% NDF水平的青贮玉米），结果发现，发酵玉米秸秆的干物质（DM）、ADF和NDF有效降解率均显著高于青贮玉米，可能是因为发酵玉米秸秆较青贮玉米秸秆有更高的非纤维性碳水化合物含量。这与本试验研究结果相近，也就是说饲粮NDF水平在40%及以下时，NDF水平对饲料各营养物质表观消化率影响并不显著。

门小明等^[12]用小尾寒羊母羊测定了不同精粗比（2∶8、3∶7和4∶6）饲粮在自由采食情况下的营养物质表观消化率，结果表明，随粗饲料饲喂比例增加，DM和OM表观消化率显著降低。导致这种结果差异的原因可能是因为在其研究中只提到了精粗比的变化，而并未说明粗饲料中ADF和NDF在饲粮中的比例，有可能是因为选择了品质比较差的低质粗饲料，精粗比在2∶8和3∶7时，NDF水平已经过高或者超过45%所致。通常减少饲粮中精料比例，增加粗饲料比例，NDF水平相应提高，总的结构性碳水化合物含量增加，易消化的碳水化合物（如淀粉）含量降低，从而降低了瘤胃微生物对营养物质消化利用。本试验饲粮NDF水平超过42%时，可能超过了马鹿对饲料NDF消化和利用的上限，ADF和CP表观消化率降低；在采食量相同且等能等氮时，塔里木马鹿对低质粗饲料有一定适应能力，当饲粮NDF水平不超过42%时，NDF水平对饲粮各营养物质表观消化率影响不显著，此次研究结果与上述试验结果有所不同，这可能由于塔里木马鹿长期对低质粗饲料的适应的结果。

3.2 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿瘤胃原虫形态学及瘤胃原虫结构的影响

3.2.1 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿瘤胃原虫形态学的影响

此次显微镜下只观察到纤毛虫，饲喂不同NDF水平饲粮，塔里木马鹿瘤胃内毛属、双毛属、前毛属、后毛属和厚毛属比例较多，尤其是内毛属原虫是绝对优势菌群。谭翠^[13]利用高通量技术研究用茶皂素处理的肉牛瘤胃原虫区系，发现内毛属、后毛属、真双毛属、多甲属和等毛虫属原虫是肉牛瘤胃中的优势原虫，但其属和种数量相对较少。王梦芝等^[14]研究徐淮白山羊瘤胃原虫，发现了双毛属、内毛属、前毛属、等毛属和头毛属5个属的原虫，其中内毛属所占比例最高，其结果与本研究结果基本一致。与王梦芝等^[14]相比，本试验发现原虫属比其多5个，这可能与塔里木马鹿生活在干旱少雨荒漠环境以及采食高盐高粗饲草料有关，但具体原因还需要进一步研究。

瘤胃原虫活力是根据显微镜下观察的快速运动纤毛虫与总纤毛虫比值计算^[15]。本试验通过显微镜观察计数，发现瘤胃原虫活力极高。原虫活力可影响到反刍动物对饲料的利用效率，一般反刍动物对粗饲料消化效率越高，微生物活力也越高^[16]。由此可见，马鹿在饲粮NDF水平达到47%时饲料消化率也仅略以下降，这可能与瘤胃微生物特性，尤其原虫活力有很大关系。马鹿瘤胃原虫活力随饲粮NDF水平增加而有增加的趋势。当饲粮NDF水平为47%和42%时，马鹿瘤胃原虫活力均在80%以上，显著高于其他各组；当饲粮NDF水平为27%时，瘤胃原虫活力仅为79.21%，显著低于其他各组。这可能是因为随着精饲料水平增加，饲粮中淀粉所占比例增加，瘤胃pH下降，抑制了微生物活力，从而导致马鹿瘤胃原虫活力有所下降。

反刍动物瘤胃原虫密度不仅受到动物种类、不同的生理时期、个体差异、饲粮类型等因素的影响。健康反刍动物瘤胃内纤毛虫种类和数量会因宿主的饲喂条件、生理等因素的变化而发生变动，一般每毫升瘤胃内容物含10⁵~10⁶个纤毛虫^[17]。本试验中，饲粮NDF水平由47%降到27%，马鹿瘤胃原虫密度随饲粮NDF水平减少而有减少的趋势。47% NDF水平组瘤胃原虫密度显著高于37%、32%和27% NDF水平组。47% NDF水平组每毫升瘤胃液原虫数量比27% NDF水平组高出了21.7万个。纤毛虫也可直接利用植物纤维素和淀粉，将其转变成挥发性脂肪酸（VFA）^[18]。本试验中，随着饲粮NDF水平增加，马鹿瘤胃原虫密度也随之增加，尤其是在粗饲料水平达到80%时，马鹿瘤胃原虫密度达到最高6.12×10⁵个/mL。塔里木马鹿对粗饲料高效利用是否与瘤胃原虫较高的密度有关，还需要后续通过相关消化试验来进一步验证。

3.2.2 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿瘤胃原虫种群结构的影响

瘤胃纤毛虫是成年反刍动物瘤胃微生物生态系统中的主要类群之一。饲粮成分改变会影响原虫数量和密度，从而影响动物对饲料的利用效率。刘翔^[19]在山羊瘤胃中发现了7个属的原虫，其中内毛属、双毛属、等毛属和头毛属为优势种，这与本试验研究结果基本一致。但本试验没有鉴定到头毛属原虫，这可能与物种之间差异有关。本试验发现，内毛属、厚毛属和鞘甲属原虫比例随着粗饲料比例的增加而减少，这与前者研究绵羊瘤胃内容物中内毛属和厚毛属原虫随着饲粮中纤维性物质含量的增加而密度有所上升结果一致，至于为何没有发现鞘甲属原虫有此规律，可能是因为鞘甲属原虫密度仅为0.5%左右，相对密度较低。

等毛属原虫比例随着饲粮NDF水平降低而先增后减，这主要原因可能与饲粮中可溶性碳水化物比例变有化关，NDF水平由47%降低到27%，瘤胃pH呈现下降的趋势，pH在6.0左右时，适宜等毛虫的增殖而使其密度增加，但随着精饲料水平进一步增加，pH继续下降，可能又抑制了等毛虫的增殖，从而出现了其密度先增后减的变化莫测规律。刘烨彤^[20]研究发现，随着饲粮中精料比例的增加，原虫的数量先高后降低。研究发现，随着粗饲料水平增加，头毛属、前毛属和双毛属都能不同程度的降解纤维物质，提高纤维素的消化率。郭健等^[21]报道，大部分瘤胃纤维的降解可能是由于纤毛虫死亡所释放出来的酶在起作用，瘤胃去纤毛虫可使绵羊瘤胃纤维素降解率下降50%。原虫一方面是有对植物组织的物理性裂解作用，从而能促进植物细胞间的分离，使富含纤维素的细胞壁破裂成碎片，而后被其直接吞噬消化；另一方面瘤胃原虫能够生成分解纤维素、半纤维素和果胶的酶类，分解纤维素提高饲料的利用效率。大量体内体外试验都已证明纤毛虫直接参与降解细胞壁多糖的过程^[22]。内毛目纤毛虫中的头毛属、前毛属和双毛属都能不同程度的降解纤维物质，提高纤维素的消化率^[4]。王丹丹等^[23]研究表明，粗饲料类型和黏附程度会影响奶牛瘤胃内微生物多样性，与本试验对原虫种类影响结果相似。关于粗纤维比例上升导致原虫比例发生变化的内在原因，还需要通过对原虫纯培养和其酶活性的测定来进一步研究。

3.3 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿瘤胃细菌种群结构的影响

3.3.1 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿瘤胃细菌门水平种群结构的影响

相关研究表明，Bacteroidetes和Firmicutes为反刍动物瘤胃微生物区系的优势菌群。本试验中，瘤胃Fibrobacteres相对丰度在饲粮NDF水平达到42%时已超过了Firmicutes，其原因是Fibrobacteres相对丰度随着饲粮NDF水平增加而升高，最高达到了23%左右，而使Fibrobacteres成为优势菌群。另外，相关报道大多数研究都主要针对奶牛和肉羊瘤胃微生物，这些动物饲粮中精饲料水平一般在50%左右，NDF水平相对较低，这也可能是造成这种差异的一个原因。

Kim等^[24]和Petri等^[25]利用高通量测序技术检测饲喂不同饲粮肉牛粪便和瘤胃的微生物区系变化，研究表明饲喂粗料组粪便和瘤胃Bacteroidetes相对丰度显著低于饲喂高比例谷物组，这与本试验结果一致；Shanks等^[26]利用高通量测序技术检测研究饲喂不同饲粮肉牛的粪便菌群结构，结果表明饲喂未加工的谷物组粪便Bacteroidete相对丰度显著高于饲喂牧草组，与本试验结论一致。韩旭峰^[27]研究发现，陕北白绒山羊饲喂不同水平粗饲料，瘤胃Bacteroidetes相对丰度随着粗饲料水平增加而升高。这与本试验结果差异较大，认为可能原因是测序检测的区域不同而导致结果出现了偏差。Bacteroidetes是瘤胃中非纤维植物成分的主要降解者，该菌门中的普雷沃氏菌属（Prevotella）在瘤胃中相对丰度最高，有报道称Prevotella相对丰度可达瘤胃微生物数量的60%~70%^[28]，它拥有高活性的半纤维素分解菌，并对植物非纤维多糖和蛋白质的降解至关重要，但是不能降解纤维素^[29]。Bacteroidetes相对丰度理论上也随着纤维含量高的饲料在饲粮中比例的增加而下降，随着饲粮中非结构性碳水化合物比例增加而下降。

3.3.2 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿瘤胃细菌属水平种群结构影响

本研究表明，瘤胃Prevotella_1相对丰度随着饲粮NDF水平增加而降低。传统培养以及各种分子生物学方法的研究报道均证实Prevotella为瘤胃的优势菌群^[30-31]。Petri等^[24]利用高通测序技术研究饲粮对肉牛细菌种群结构的影响，研究结果表明饲喂高谷物组瘤胃Prevotella_1相对丰度显著高于饲喂干草组；Kim等^[25]在研究饲喂不同精粗比饲粮对肉牛粪便细菌多样性影响的试验中也发现了相似的结果。这表明Prevotella_1适合在饲喂高精料的瘤胃环境中生存，并且对消化分解饲料中的精料具有重要的作用，这在羊瘤胃微生物的研究中得到了证实。普氏杆菌在瘤胃中可降解和利用淀粉和植物细胞壁多糖，如木聚糖和果胶，但是不能降解和利用纤维素^[32]，这也完全支持本试验研究结论。

刘垚等^[33]和马丽琴等^[34]对西门塔尔牛和奶牛瘤胃微生物研究发现，Rikenellaceae_RC9_gut_group为瘤胃优势菌，其相对丰度在8%~18%，与本试验相似。Zened等^[35]研究结果显示，与低谷物饲粮组相比，高淀粉组奶牛瘤胃中理研菌科相对丰度下降，与本试验在低饲粮NDF水平时研究结果类似，当饲粮NDF水平在37%以下时，瘤胃Rikenellaceae_RC9_gut_group相对丰度随饲粮NDF水平下降而呈现下降趋势，但其在消化生理中的作用报导相对较少。陈秀琴等^[36]报道，肠道微生物区系发生异常时，病原菌的数量会增加，使肠道菌群失调。因此，为了深入了解塔里木马鹿瘤胃发酵特点，对Fibrobacter和Rikenellaceae_RC9_gut_group变化规律的进一步研究非常重要。

3.3.3 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿瘤胃几种纤维降解菌相对丰度的影响

在瘤胃中可降解纤维素的细菌主要有产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）、Ruminococcus flavefaciens、Ruminococcus albus、Butyriuihrio fibrisoluens、Ruminobczcter paruum以及Clostridium^[17]。Fibrobacter succinogenes是严格的厌氧型革兰氏阴性菌，具有很强的纤维素降解能力，是瘤胃中主要的纤维降解菌。Rumincoccus flavefaciens也是研究较多的纤维降解菌之一。Rumincaccus albus在瘤胃中的数量大于Rumincoccus flavefaciens，是瘤胃中的主要纤维分解菌，能分泌大量的纤维素酶和半纤维素酶。Ruminobczcter paruum属于瘤胃杆菌属（Ruminobacter），能发酵纤维二糖、纤维素和木聚糖等，其相对丰度较低，在0.001%~0.000 1%，且饲粮NDF水平对其相对丰度无显著影响。

本试验中，瘤胃Fibrobacter、Ruminococcus flavefaciens、Ruminococcus albus、Butyriuihrio fibrisoluens相对丰度均随着饲粮NDF水平增加呈现上升趋势，主要可能是因为高精料的情况下，瘤胃微生物发酵短时间内产生大量的VFA，使瘤胃内环境pH急剧下降，这可能造成瘤胃纤维降解菌减少、饲料消化率降低。孙云章等^[37]研究表明，高精料引起了瘤胃pH的急剧下降，进而抑制纤维降解菌数量生长，与本试验结果一致。

4 结论

① 饲粮NDF水平由27%增加到47%，塔里木马鹿对饲粮中NDF、OM表观消化率虽有下降趋势，但组间差异不显著，表现出塔里木马鹿对高纤维粗饲料较强的消化能力。

② 不同NDF水平饲粮对塔里木马鹿瘤胃原虫结构影响小，整体结构稳定，这也说明塔里木马鹿对不同程度的粗饲料适应性强。

③ 不同NDF水平饲粮条件下塔里木马鹿瘤胃细菌种群结构稳定，几种纤维降解菌在塔里木马鹿消化过程中起关键作用。

④ 综上所述，不同水平NDF饲粮对塔里木马鹿的营养物质表观消化率影响较小，塔里木马鹿瘤胃种群整体结构稳定，对高纤维饲粮有较强的耐受性。

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