Chinese Journal of Animal Nutrition >

2023 , Vol. 35 >Issue 3: 1996 - 2003

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2023.187

RESEARCH PAPER

A Technique Establishing for Installating Femoral Artery and Femoral Vein Vascular Fistula in Pig Hind Limbs

  • REN Ying , 1, 2 ,
  • WU Taotao 1, 2 ,
  • FENG Zhi 1, 2 ,
  • ZHANG Hui 1, 2 ,
  • ZHANG Dandan 1, 2 ,
  • LEI Long 1, 3 ,
  • XU Xuewen 1, 3 ,
  • ZHAO Shengjun , 1, 2, *
Expand
  • 1 Hubei Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China
  • 2 Hubei Collaborative Innovation Center for Animal Nutrition and Feed Safety, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China
  • 3 Haida Research Institute, Guangdong Haida Group Co., Ltd., Guangzhou 511442, China
*associate professor, E-mail:

Received date: 2022-09-09

  Online published: 2023-03-16

Fold

Abstract

The aim of this study was to establish a vascular fistula surgical installation method for investigating the muscle metabolism of pig hind limbs, and to explore the changes of blood flow in the hind limbs of pigs at different time for verifying the feasibility of the proposed method. Seven Duroc×Landrace×Large Yorkshire ternary crossbred pigs with an average body weight of (20.07±2.14) kg were selected, and the carotid, femoral artery and femoral vein vascular fistulas were surgically installed. After a week of recovery of the test pigs, 1% p-amino hippurate (PAH) was perfused through the femoral artery, and samples were continuously collected per hour to measure the blood flow velocity of the femoral vein within 6 h. The results showed that the body condition of the test pigs recovered well and the feed intake was normal, which could be used for the test. The femoral venous blood flow at different time points was significantly different (P<0.05). The porcine carotid-femoral artery-femoral vein vascular fistulas installation technique established in this experiment provides effective means for studying the metabolism of nutrients in the hind limbs of growing pigs.

Key words： growing pig; hind limb muscle metabolism; femoral artery; femoral vein; vascular fistula

Cite this article

REN Ying , WU Taotao , FENG Zhi , ZHANG Hui , ZHANG Dandan , LEI Long , XU Xuewen , ZHAO Shengjun . A Technique Establishing for Installating Femoral Artery and Femoral Vein Vascular Fistula in Pig Hind Limbs[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2023 , 35(3) : 1996 -2003 . DOI: 10.12418/CJAN2023.187

肌肉组织是产肉动物外周组织的最重要组成部分。研究营养物质在肌肉组织中的代谢,对于调控营养物质在肌肉中沉积和改善肉品质具有十分重要的意义。因此,建立一个使动物应激降至最低的后肢动-静脉连续采血的方法显得至关重要。最早,Dougherty等[1]给试验猪安装了股动脉-股静脉导管,可以在活体连续采血。后来Weirich等[2]给猪安装了可长期留置的动-静脉导管。Deutz等[3]通过安装血管瘘测定猪后肢血流量和营养物质浓度,研究了猪后肢肌肉的营养物质代谢。这些技术的建立,为研究猪后肢营养物质代谢提供了有效手段。在国内,任明强等[4]应用安装血管瘘技术,研究了添加海南霉素后山羊后肢对游离氨基酸(FAA)利用的影响。目前,国内鲜见猪后肢肌肉代谢的动-静脉血管瘘具体安装方法的研究报道。因此,本试验拟建立猪后肢股动脉-股静脉血管瘘管安装方法,并通过测定猪后肢股静脉血流量在不同时间的变化验证该方法的可行性,为无应激条件下对猪后肢股动脉-股静脉的连续采血提供可靠的技术手段。

1 材料与方法

1.1 动物和饲粮

选用7头健康状况良好、平均体重为(21.07±2.14) kg的试验猪,单独饲养于试验代谢笼中。自由采食,自由饮水。所有试验猪饲喂同种基础饲粮,参照NRC(2012)饲养标准配制,其组成及营养水平见表1。待试验猪恢复并适应7 d后,实施股动脉、股静脉、颈动脉血管瘘安装手术。
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)%

项目 Items 含量 Content
原料 Ingredients
玉米 Corn 70.09
豆粕 Soybean meal 10.70
乳清粉 Whey powder 5.00
鱼粉 Fish meal 4.00
大豆浓缩蛋白 Soy protein concentrate 5.00
豆油 Soybean oil 0.40
精氨酸 Arg 0.48
蛋氨酸 Met 0.23
苏氨酸 Thr 0.22
色氨酸 Trp 0.06
丙氨酸 Ala 0.42
磷酸氢钙 CaHPO4 1.30
石粉 Limestone 0.60
食盐 NaCl 0.30
膨润土 Bentonite 0.20
预混料 Premix1) 1.00
合计 Total 100.00
营养水平 Nutrient levels2)
粗蛋白质 CP 16.70
赖氨酸 Lys 1.32
蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys 0.71
苏氨酸 Thr 0.87
色氨酸 Try 0.21
异亮氨酸 Ile 0.06
亮氨酸 Leu 1.45
缬氨酸 Val 0.76
组氨酸 His 0.74
苯丙氨酸 Phe 0.42
净能 NE/(MJ/kg) 10.40

1)预混料为每千克饲粮提供 Premix provided the following per kg of the diet: VA 15 000 IU,VD3 4 000 IU,VE 45 mg,VK3 3.5 mg,VB3 2 mg,VB2 6.5 mg,VB6 5 mg,VB12 0.05 mg,烟酸 niacin 25 mg,泛酸 pantothenic acid 9.5 mg,叶酸 folate 0.65 mg,生物素 biotin 0.5 mg,氯化胆碱 choline chloride 500 mg,VC 288 mg,Fe 180 mg,Cu 140 mg,I 1 mg,Se 0.27 mg,Zn 150 mg,Mg 68 mg,Co 0.3 mg。

2)粗蛋白质为实测值,其余为计算值。CP was a measured value, while the others were calculated values.

1.2 手术主要器材

手术耗材和药品:单腔中心静脉导管包,供货商北京天地和协科技有限公司,14Ga 1个,18Ga 2个。异氟烷(麻醉剂,25 mL装,购自瑞沃德生命科技有限公司)、2%戊巴比妥钠溶液、200 IU/mL肝素钠溶液、破伤风抗毒素等药品以及其他常规医疗手术必备品。
试验器械与设备:动物专用吸入式麻醉机(MATRX Matrx,购自美国MATRX公司)、专业冷光源以及常规医疗手术设备,20 cm止血钳、20 cm持针器、手术针等手术器械(术前高压灭菌后烘干,购自瑞沃德生命科技有限公司)。
灌注设备:医用双通道微量注射泵。50 mL注射器以及灌注常用管道。

1.3 股动脉-股静脉血管瘘管的安装

1)术前准备:试验猪禁食12 h。2)麻醉:肌肉注射阿托品(8 mg/kg),15 min后通过耳缘静脉注射戊巴比妥钠(注射剂量25 mg/kg),然后使用呼吸麻醉机持续通入异氟烷维持麻醉。3)保定:使试验猪以背侧仰卧固定于手术台上,用绳子保定四肢。4)备皮:用肥皂水润洗手术部位后刮毛,刮净后用清水清洗术部,络合碘消毒,75%酒精脱碘,铺好创布。5)开创:在腿根腹股沟处,用手指感触股动脉搏动,确定腿部血管的位置及走向。与腹股沟垂直,沿着血管纵向切开皮肤4~5 cm。用止血钳钝性分离肌肉至慢慢暴露血管,分离动静脉血管表面的筋膜。6)血管瘘管安装:用医用5.0无损伤缝合线在动脉血管周围的筋膜上做个荷包缝合。在荷包缝合中心,将穿刺针斜面向上,向着近心端,以60度角方向穿破动脉(注意勿对穿),从穿刺针处导入导丝至股动脉。用止血钳夹住穿刺针前端的导丝,固定导丝,防止其脱出股动脉。彻底退出穿刺针后,马上在导丝后端套上中心静脉导管(18G,30 cm),慢慢推进,直到贴近止血钳为止。去掉止血钳,将中心静脉导管沿导丝插入血管,深度约5 cm。用止血钳贴近股动脉外侧,轻轻夹住导管。从导管后端,慢慢抽出导丝。中心静脉导管后端安装肝素帽。回抽血液,确认导管畅通。向导管内注入含肝素钠的生理盐水(250 U/mL) 3 mL。拉紧预先做荷包缝合的无损伤缝合线,反复打结,固定导管。7)按上述步骤安装股静脉血管瘘管。8)股动脉、股静脉瘘管导管的体外固定:在保证导管顺畅的前提下,将股动脉、股静脉瘘管的导管固定在后肢外侧。逐层缝合创口处肌肉、皮下筋膜和皮肤。创口处涂抹磺胺消炎粉,以防感染。9)颈动脉安装:在颈部找到颈静脉沟,在颈静脉沟中心纵向做一切口,长度7~8 cm。切开皮肤后,垂直向下钝性剥离肌肉组织,直到找到颈动脉。颈动脉与迷走神经伴行,用手触碰会有明显的跳动感。将颈动脉拉出体外,然后将其与迷走神经分离,剥离动脉鞘,暴露出一段长为3~4 cm的颈动脉。在血管下侧穿入2根短线。结扎血管的远心端。在近心端剥离血管外侧筋膜暴露血管壁,小心剪破血管,向近心端方向插入硅胶管,深度8~10 cm,至颈静脉窝(可以预先估测导管插入位点与颈静脉窝之间的距离,以便导管能插入预先选定位置)。用近心端的短线将血管和导管同时打结、固定导管。在导管上向后多次打结,延长固定导管。肝素钠封管、清理纱布和血块。然后将导管从颈部穿出至背部,并在背部缝合固定导管。缝合颈部肌肉、皮下筋膜和皮肤,在创口上撒上消炎粉。给试验猪穿上护理衣,防止试验猪因刮擦将导管蹭掉。手术结束后,给猪注射1针破伤风抗毒素。具体安装过程见图1。
图1 仔猪股动脉/股静脉/颈动脉血管瘘管安装示意图

Fig.1 Illustration of implanted catheters in femoral artery, femoral vein and carotid artery in piglets

1.4 术后护理

术后需要给试验猪注射抗生素每天2次(每次每只160万单位青霉素+100万单位链霉素),持续1周。术后4~5 h,试验猪禁食、禁水,防止在吞咽时发生意外,造成异物性肺炎。待试验猪能恢复站立后,先饲喂少量饲粮,让它慢慢恢复咀嚼和吞咽功能。然后再给清洁饮用水。每天用肝素钠生理盐水疏通血管导管2次,以防导管堵塞。每次疏通时,肝素帽先用酒精棉消毒,再用空5 mL注射器将导管内的肝素钠溶液和积血抽出,然后注入2~3 mL肝素钠溶液(250 IU/mL)封管。灌注的肝素钠生理盐水以导管容量为限,防止肝素钠溶液进入体内过多,导致机体肝素化。

1.5 氨基马尿酸(PAH)灌注及血样采集

参照方正锋等[5]的方法,称取5.00 g PAH,用0.9% NaCl溶液溶于500 mL容量瓶中,超声波溶解,定容至500 mL。然后调节pH为7.45,再通过0.45 μm滤膜过滤,现配现用。在采样当天的08:00通过肠系膜静脉连续灌注1% PAH 7 h。灌注方法为:首先将注满1% PAH的50 mL注射器安装在注射泵上,注射器针头连接约2 m长的硅胶管,再将硅胶管通过注射针头与股动脉血管瘘管连接。灌注开始5 min内,以3.820 mL/min的速度进行注射,然后以0.788 mL/min的速度连续注射7 h。在第1次饲喂开始前15 min,即采样当天的07:45,采集基线血样。然后从09:00开始每隔1 h采集1次,连续采集6次(不包括基线血样)。采集方法为:用一次性注射器缓慢均匀地从动、静脉血管瘘管抽取血液,从每个导管抽取的前1 mL均丢弃,然后换新的注射器抽取动、静脉血液各5 mL,装入预先加了数滴肝素溶液(200 IU/mL)的离心管中,立即将离心管置于冰瓶中送往实验室离心(3 000 r/min,15 min)。离心后取上清液分装于1.5 mL小管中,-80 ℃冷冻保存。

1.6 PAH浓度测定

标准曲线制作:首先配制0.1 g/L的PAH储备液。分别移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL PAH储备液配制成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/L的PAH标准溶液;空白管加2 mL蒸馏水,其余各测定试管分别加以上PAH标准溶液2 mL;加1 mol/L HCl 2 mL、用滴管加入0.50 g/100 mL亚硝酸钠溶液1滴,振荡后放置3 min;加0.50 g/100 mL氨基磺酸铵溶液1 mL,振荡后放置2 min;加0.50 g/100 mL萘乙二胺盐酸盐溶液2 mL,摇匀后静置15 min备用;分光光度计于波长540 nm处测定吸光度,记录吸光度,以标准液内PAH浓度与相应的吸光度绘制标准曲线。
血样测定:分析前血液与0.3 mol/L Ba(OH)2和5% ZnSO4按1:1:1比例混合,4 500 r/min离心15 min,制成无蛋白血液;空白管加2 mL蒸馏水,其他试管加无蛋白血液2 mL;其他步骤同标准曲线的制作。

1.7 股静脉血流量(FPF)的计算

FPF=Ci×IR×[(PAHv-PAHa)×BW]-1。
式中:Ci为PAH灌注浓度(g/L);IR为灌注速度(L/h);PAHv为股静脉PAH浓度;PAHa为颈动脉PAH浓度(g/L);BW为体重(kg)。

1.8 数据处理

使用Excel 2007绘制吸光度(OD)和PAH浓度的回归曲线,计算从开始饲喂猪后每小时的FPF。采用SAS 8.0统计软件,对不同时间点的股静脉和股动脉的PAH浓度、FPF进行单因素方差分析,以P<0.05作为差异显著性标准。

2 结果与分析

2.1 术后恢复情况

术后1周,试验猪活动恢复正常,采食量也恢复正常。采血期间,除1头猪体内1根颈动脉导管脱落外,其他导管都保持通畅,可以正常采血。

2.2 PAH标准曲线

以PAH(mg/L)的浓度为横坐标,OD为纵坐标绘制标准曲线。如图2所示,标准曲线的线性回归方程如下:y=0.215 6x+0.026 0(R2=0.999 7),然后根据该方程确定样品的PAH浓度。
图2 PAH的标准曲线

Fig.2 Standard curve for PAH

2.3 股静脉和颈动脉血液中PAH浓度

表2显示不同时间点股静脉和颈动脉血液中PAH的浓度。从表中可看出,试验猪在采食5 h后,股静脉和颈动脉的血液PAH浓度均达到最高,且在采食3 h后最低。饲喂后不同时间股静脉PAH浓度存在显著差异(P<0.05),但颈动脉PAH浓度无显著差异(P>0.05)。
表2 饲喂后不同时间股静脉和颈动脉血液中PAH的浓度

Table 2 Concentration of PAH in femoral vein and carotid arterial blood at different time after feedingmg/L

项目
Items		 编号
Number		 时间 Time/h
0 1 2 3 4 5 6 7 8
股静脉
Femoral
vein		 1 16.41 30.97 30.85 - 27.60 20.12 22.73 20.01 22.68
2 29.34 32.13 45.05 - 16.70 29.81 28.76 20.59 32.01
3 11.72 32.30 14.96 8.53 20.30 29.11 - 12.41 11.02
4 - 35.20 - 24.65 31.78 34.91 31.02 48.32 -
5 31.72 22.85 18.73 15.85 20.76 20.01 18.56 21.23 19.66
6 24.53 15.78 16.47 14.91 26.62 - - 12.24 13.63
7 37.69 19.89 24.70 14.33 23.55 43.72 33.17 30.62 19.43
n 6 7 6 5 7 6 5 7 6
平均值Mean value 25.24ab 27.02a 25.13ab 15.65b 23.90ab 29.61a 26.85ab 23.63ab 19.74b
SEM 3.98 2.81 4.65 2.59 1.94 3.70 2.71 4.74 3.01
颈动脉
Carotid
artery		 1 2.33 15.60 16.82 - 6.21 4.70 8.07 2.56 9.92
2 3.54 4.12 17.17 - 2.56 1.98 2.38 2.62 3.60
3 1.22 6.27 4.93 1.28 6.50 11.37 - 1.57 4.07
4 - 15.60 - 7.89 7.14 19.43 14.31 34.10 -
5 4.18 7.08 7.02 3.72 6.04 6.50 5.05 5.05 5.80
6 9.28 4.47 9.98 3.54 11.43 - - 4.65 2.96
7 21.86 11.49 9.57 5.34 6.21 23.49 3.89 15.43 4.65
n 6 7 6 5 7 6 5 7 6
平均值 Mean value 7.07 9.23 10.92 4.36 6.58 11.24 6.74 9.42 5.17
SEM 3.17 1.88 2.06 1.10 0.98 3.50 2.11 4.48 1.03

同行平均数肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。“-”表示未采到血样或样品缺失。

Mean values within a row with different letter superscripts mean significant different (P<0.05). “-”represents that no blood samples were taken or that the samples were missing.

2.4 FPF

表3所示的是从开始试验到8 h猪股静脉FPF随时间的变化。饲喂1~2 h的FPF与0 h相比,有明显上升,但无显著差异(P>0.05);在饲喂3 h的FPF达到最大值1.65 L/(kg·h),与0 h相比提高了58.65%,差异显著(P<0.05)。此后饲喂4~6 h的FPF显著下降(P<0.05),在饲喂6 h时降至最低,与饲喂3 h的FPF相比下降了40.62%。随后FPF开始再次增加,饲喂8 h的FPF比饲喂6 h的提高66.33%,差异显著(P<0.05)。
表3 猪股静脉FPF随时间的变化

Table 3 Changes in FPF of pigs femoral veins over timeL/(kg·h)

项目
Item		 时间 Time/h
0 1 2 3 4 5 6 7 8
股静脉血流量FPF 1.04a 1.14ab 1.47ab 1.65b 1.06a 1.01a 0.98a 1.34ab 1.63b

3 讨论

本试验旨在建立一种猪后肢股动脉和股静脉血管瘘管的手术安装方法,即在股动脉和股静脉中安装导管,并通过测定猪后肢FPF在不同时间的变化验证该方法的可行性。有研究表明,采血前是否对动物进行麻醉,其血液分析结果会有所不同[6]。Dougherty等[1]首次报道了在没有麻醉或压力约束的情况下,将导管置于动物体内采集血液样本的技术。这种瘘管技术的优点有很多:方便注射药物或通过采血检测血液成分;导管可以长时间留在动物体内,从而将由手术引起的生理应激最小化;可以在不同时间都快速采集大量的血液[7]。目前,许多国内学者已经报道了将导管植入肝门静脉或猪肠系膜静脉的相关试验研究[8-9],但迄今为止鲜见将导管植入猪的股静脉和股动脉方法的报道。本研究使用了7头平均体重为21.07 kg猪,通过建立的方法给所有试验猪成功地安装了后肢股动脉和股静脉血管瘘管以及颈动脉血管瘘管,而且在无应激的条件下通过瘘管从猪体内成功采集了血液。这说明本研究建立的猪后肢股动脉和股静脉血管瘘管安装方法是有效的。
利用本研究建立的后肢股动脉和股静脉血管瘘管以及颈动脉血管瘘管,可以测量颈动脉和后肢股静脉血中PAH浓度,从而可以根据动脉静脉浓度差确定后肢FPF。许多报道已经证明了应用PAH灌注法测定血流量的可行性[10⇓-12]。Yen等[13]使用PAH灌注法作为标记来估计门静脉血流量。尽管Rémond等[14]验证了使用超声波流量计测量羊门静脉血流量(PBF)的可行性,但是超声波流量计需要安全地将探头正确植入猪体内,导致此方法可操作性差,且需花费较高的费用。Katz等[15]证明PAH方法在测量门静脉血流量方面比磺基溴代苯酞(BSP)具有明显的优势。因此,本研究选择了PAH灌注法。通常,静脉血液中PAH浓度高于动脉血液。如果静脉血液的PAH浓度低于动脉血液浓度,说明出现数据异常。这种数据异常产生的原因可能是血液PAH浓度测定产生错误或采血时间不同步导致的。先收集静脉血样,持续灌注PAH,再收集动脉血,就比较容易发生数据异常。在本研究中,对猪开始每小时连续饲喂后,发现基线颈动脉样本与每小时采样血液之间的PAH平均浓度无差异,但在股静脉血液中存在显著差异。这主要是因为颈动脉血液源于心脏,并循环到外周组织,它的血液成分变化相对较小。相比之下,股静脉收集后肢回流的血液,它的血液成分会由于后肢的运动和代谢变化而发生明显变化。
本研究结果表明,股静脉FPF在饲喂后1 h内迅速增加,这与以前的研究结果[16]相一致。并有研究表明,母羊所有肌肉达到平衡所需的时间随着后肢FPF的总体速度而变化,从灌注开始时间介于40~60 min[17]。本研究中,股静脉的FPF的变化趋势呈先上升后下降再上升的趋势。我们发现其下降与猪午休时间相关。本研究借鉴门静脉内脏(PDV)组织研究的间隔1 h进行连续饲喂的方案,以确保所有试验猪均获得相等的摄食量(以每单位BW为基础表示)和稳定的食糜流动,减少进食量变化的影响,从而使血液流动主要受猪运动或休息的影响。试验得出了FPF的测量值,如果将它们乘以营养物质动静脉(A-V)浓度差,就可以得出猪后肢对营养成分的净吸收量[18-19]。
在整个试验过程中,瘘管导管有时会被阻塞。在这些情况下,有以下解决问题的方法:1)通常在手术1周左右,导管非常容易堵塞,原因主要是由于细菌感染或免疫排斥,导致血管中产生纤维化的组织块。当这种情况发生时,可用中心静脉导管配套的导丝,消毒后缓慢插入导管,进行疏通,使导管恢复通畅。2)有时在采血样期间,也会发生导管阻塞。这可能是导管在腹腔内牵拉扭结引起的。此时可通过调整试验猪的体位,如从躺卧改为站立、尝试使血管畅通。3)颈动脉导管脱落或阻塞。正常的试验操作,应该是通过股动脉导管灌注,从颈动脉和股静脉导管中采血。但如果发生颈动脉导管脱落或阻塞,可以在股动脉导管完成PHA灌注后,立即采集股动脉血,以替代颈动脉血;血管瘘管装好后,为防止导管脱落,术后护理至关重要。在前人的研究中,出现过由于猪在隔离笼的剐蹭,导致导管脱落或者断裂的现象。本研究中,我们改进了导管的固定方法,将其固定在猪大腿外侧,并用胶带粘住,以便将导管固定在猪身上,并给猪穿上了手术隔离衣,进行保护,大大减少了意外的发生[20]。

4 结论

本试验建立了猪后肢股动脉-股静脉血管瘘管安装的方法,并用该方法测定了猪FPF在不同时间的变化存在显著差异,从而证明该方法可用于猪后肢肌肉营养物质代谢的研究。

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