近年来,随着人们对高品质畜产品需求的不断提升,绿色、安全的植物源饲料添加剂成为动物营养研究的热点。黄酮类化合物由于具有增强机体免疫功能和缓解应激的作用,且在提高奶牛泌乳性能、改善乳品质方面效果显著而得到广泛关注。国内外研究表明,饲粮中添加黄酮类物质能够有效提高奶牛产奶量,增加乳中乳糖、乳脂、乳蛋白等营养成分含量,同时还能减少乳中体细胞数,提高乳品质。目前的研究一方面是通过动物试验,探究补饲黄酮类化合物对奶牛泌乳性能以及乳品质的影响;另一方面是通过细胞培养试验,探究黄酮类化合物的添加对乳腺上皮细胞活性、免疫和抗氧化能力以及泌乳相关基因表达的影响。关于添加黄酮类化合物对奶牛泌乳性能和乳腺细胞影响的研究较多,但对其潜在的作用途径的研究较为分散,因此,本研究综述了黄酮类化合物改善乳品质的潜在作用途径,并对其在应用中存在的问题进行了展望,以期对黄酮类化合物的应用提供理论基础。
1 黄酮类化合物
1.1 来源
1.2 结构和功能
1.2.1 结构和分类
黄酮类化合物主要指基于母核2-苯基色原酮而衍生的,以C6-C3-C6为碳架的一类化合物。天然黄酮类化合物多以苷类的形式存在,由于苷元不同,以及碳的种类、数目、连接位置和连接方式的不同,可将黄酮类化合物分为以下几类:1)黄酮类,以2-苯基色原酮为基本母核,且3位上无含氧基团取代的一类化合物,常见的主要有芹菜素、木樨草素和黄芩苷等;2)黄酮醇类,在母核基础上,3位连有羟基和其他含氧基团,常见化合物有山奈酚、槲皮素、杨梅素和芦丁等;3)异黄酮类,以3-苯基色原酮为母核结构,如豆类植物中的大豆素、大豆苷、葛根素等;4)黄烷醇类,在C环的3、4位存在羟基结构,如儿茶素、表儿茶素和无色矢车菊素等;5)双黄酮类,由2分子黄酮衍生物聚合而成的二聚体,常见的有2分子的芹菜素;6)其他黄酮类。黄酮类衍生物在自然界中很常见,衍生类型也很多样,包括糖苷化、乙酰化、甲基化。部分黄酮类化合物结构见图1 。不同的结构特征导致黄酮类化合物的生物活性和体内代谢发生变化。
1.2.2 生理功能
1.2.2.1 雌激素样作用
含有杂环酚羟基结构的黄酮类化合物因相似于机体内雌激素结构,能结合体内雌激素受体(ERs),发挥较弱的雌激素样作用而被称为植物类雌激素,如大豆苷元对α-酪蛋白、β-酪蛋白和脂质合成及细胞周期转化和细胞数量的促进作用呈剂量依赖性,大豆苷元还能刺激哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的激活以及细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)的表达,诱导雌激素受体α(ERα)的表达和核定位,而ERα表达的下调可阻断大豆苷元对上述信号通路的刺激来刺激乳合成和乳腺上皮细胞的增殖[5]。另有研究报道,染料木素的类雌激素作用具有雌激素受体的亲和力,但对表皮生长因子受体(EGFR)通路有抑制作用,与乳腺上皮细胞共培养24 h,能够下调乳腺上皮细胞中乳成分合成相关因子的表达能力、降低信号传导及转录激活蛋白5(STAT5)的磷酸化,以此调节乳蛋白的合成[6]。
1.2.2.2 抗菌、抗炎、增强免疫力作用
后抗生素时代,对治疗微生物感染和对抗抗生素耐药性,开发有效药物的需求日益增加。由于多种黄酮类化合物对病原微生物具有一定的抑制作用,对黄酮类化合物的研究越来越受到人们的关注,Biharee等[7]指出,黄酮类化合物能够通过抑制细胞膜的合成、抑制核酸的合成、抑制电子传递链和ATP的合成、降低细菌依赖酶的毒性和抑制细胞群体感应等途径发挥抗菌、抗病毒的作用,且有效减少耐药性的产生。例如,给乳房炎奶牛饲喂槲皮素,8 d后即可显著降低牛乳中体细胞数,改善牛奶品质[8];Niu等[9]试验表明,在无乳链球菌诱导的乳腺上皮细胞中添加60 μg/mL的大豆异黄酮后,无乳链球菌数量呈剂量依赖式下降,乳腺上皮细胞活力显著增加,最大限度地减少细胞毒性;另外,差异蛋白在免疫途径中显著富集,主要为调节细胞免疫功能,抵抗微生物感染,使细胞保持健康状态,表明大豆异黄酮能够调节乳腺上皮细胞增殖、分化、凋亡和迁移,从而提高乳腺上皮细胞的抗感染能力。
1.2.2.3 抗氧化作用
部分黄酮类化合物在黄酮母核的3位上连有羟基或其他含氧基团,B环的O-酚基团作为氢供体接受自由基,并与半喹啉自由基产生稳定的分子内氢键,从而阻断自由基链式反应,因此具有较强的抗氧化性,如银杏黄酮、大豆异黄酮、芦丁和槲皮素等。Chen等[3]通过对紫花苜蓿中的黄酮类化合物进行研究发现,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的清除率和苜蓿黄酮浓度呈正相关,当苜蓿黄酮浓度为1.78 mg/mL时,其清除率可达到50%。实际上,黄酮类化合物不仅可以清除自由基,还可以抑制超氧离子的形成,间接抑制氧化还原敏感的转录因子和促氧化酶,而多酚类化合物可以通过羟基来激活抗氧化酶,从而终止由脂质氧化导致的自由基损伤和其他生物反应[10]。
1.2.2.4 其他生理功能
2 黄酮类化合物对奶牛产奶量和乳品质的影响
黄酮类化合物因其具有雌激素样作用、抗炎、抗菌等生理功能,在奶牛养殖中对牛奶产量和乳品质有良好的改善作用,例如,每天补饲30 mg/kg的大豆异黄酮,能够使奶牛日平均产奶量提高20.77%,且在试验全期内,试验组的乳脂含量均高于对照组,同时牛乳体细胞数显著降低[16];补饲竹叶提取物(含41.2%的总黄酮)能够极显著提高热应激奶牛的产奶量和乳脂率,降低乳中体细胞数,缓解热应激对奶牛产生的负面影响[17];在奶牛泌乳早期,饲粮中补充黄芩提取物(含有黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等黄酮类化合物)能够降低牛奶体细胞数,并增加奶牛的全周期泌乳量,调控乳脂、乳蛋白的合成,进而改善乳品质[18];在乳腺上皮细胞中添加王不留行黄酮苷,结果表明,王不留行黄酮苷通过刺激Cyclin D1和SREBP-1c以及细胞增殖相关的mTOR信号通路,增加催乳素受体,从而调控乳糖、乳蛋白的合成[19];Kekana等[20]研究发现,奶牛补饲60 g/d的辣木叶粉可以刺激血液能量相关代谢物和血清抗氧化能力,减少氧化应激,提高乳脂含量,并降低乳中体细胞数,从而改善牛奶质量。近年来,黄酮类化合物对奶牛产奶量和乳品质影响的研究主要围绕大豆异黄酮、竹叶黄酮、桑叶黄酮等植物黄酮类化合物展开,相关研究成果如表1 所示。
表1 黄酮类化合物对奶牛产奶量和乳品质的影响Table 1 Effects of flavonoids on milk quality of dairy cows |
| 黄酮类化合物种类 Types of flavonoids | 添加物及饲喂剂量 Additives and feeding dose | 对产奶量的影响 Effects on milk quality | 对乳品质的影响 Effects on milk quality | 参考文献 References |
|---|---|---|---|---|
| 大豆异黄酮 Soy isoflavones | 大豆异黄酮, 30 mg/kg | 平均日产奶量提高了 20.77% | 乳蛋白含量极显著增加, 体细胞数显著下降 | [16] |
| 竹叶黄酮 Bamboo leaf flavonoids | 竹叶提取物, 1.3 g/kg | 产奶量显著提高 | 乳脂率极显著升高 | [17] |
| 桑叶黄酮 Mulberry leaf flavonoids | 桑叶提取物, 45 g/d | 日产奶量显著提高 | 乳蛋白含量增加,生长激素、 胰岛素等乳中激素水平增加 | [21] |
| 柑橘黄酮 Citrus flavonoids | 柑橘提取物, 4.5 g/d | 产奶量无 显著变化 | 乳中总多酚和黄酮含量增加,同时 乳的抗氧化能力显著升高 | [22-23] |
| 苜蓿黄酮 Alfalfa flavonoids | 苜蓿黄酮提取物, 100 mg/d | 对产奶量的影响 不显著 | 乳前体物及乳脂含量增加 | [24] |
| 沙棘黄酮 Seabuckthorn flavonoids | 沙棘黄酮, 100 g/d | 显著提高了4%乳脂 校正奶产量和能量 校正奶产量 | 乳蛋白率、乳脂率显著升 高,乳中溶菌酶、乳铁蛋白、 β-乳球蛋白含量和过氧化 物酶活性显著提高 | [25] |
| 王不留行黄酮苷 Vaccarin | 王不留行提取物, 38 g/d | 产奶量提高了11.3% | 乳糖含量提高1.3% | [26] |
| 芦丁 Rutinum | 芦丁,3 g/d | 产奶量显著升高 | 乳蛋白率与乳糖率均显著 升高,乳脂率无显著变化 | [27] |
| 黄芩苷 Baicalin | 黄芩提取物, 10 g/d | 全泌乳产奶量提高了 1 419 kg,约13% | 乳蛋白、乳糖和乳脂产量增加, 体细胞数减少了10% | [18] |
3 黄酮类化合物改善奶牛乳品质的潜在途径
较多研究指出,黄酮类化合物能够显著提高牛奶中乳糖、乳脂、乳蛋白等营养成分含量,因此本文结合乳腺上皮细胞的相关研究,推测黄酮类化合物改善奶牛乳品质主要从以下5个途径发挥作用。
3.1 促进乳成分前体物质合成与利用
3.1.1 促进乳成分前体物的合成
瘤胃是奶牛体内最大的消化器官,在乳成分合成过程中发挥重要作用。有研究表明,瘤胃微生物蛋白是反刍动物小肠可吸收蛋白质的主要来源,占70%~80%,是重要的乳蛋白前体物[28]。而影响瘤胃微生物蛋白合成的因素主要有饲粮中氮源的含量、瘤胃中微生物的组成及饲粮中碳水化合物含量。研究表明,饲粮中添加黄酮类化合物能够通过调节瘤胃中原虫、细菌和真菌的比例,提高瘤胃对氮源的利用效率[29];在奶牛饲粮中添加60 g/(d·头)沙棘黄酮显著提高了牛乳中蛋白率、乳脂率、4%乳脂校正奶产量和能量校正奶产量[25];进一步研究显示,添加沙棘黄酮同时提高了乙酸浓度和乙酸/丙酸,降低了戊酸浓度,提高了奶牛瘤胃中拟杆菌目RF16菌群、理研菌科-RC9-肠道菌群、瘤胃梭菌属的相对丰度,同时提高了泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃中与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路相关的代谢物含量,为脂质的合成提供了更多的前体物[30]。补饲30 g/d的竹叶黄酮具有类似的效果,瘤胃内微生物变化表现为厚壁菌门数量的显著增加及葡萄球菌等有害菌群数量的减少,经16S核糖体RNA(rRNA)基因测序和液相色谱-质谱(LC-MS)代谢分析,黄酮类化合物通过调节奶牛瘤胃中菌群结构,影响鞘脂信号途径以及甘油磷脂代谢、鞘脂代谢,增加乳脂、乳糖、乳蛋白前体物的生成[31]。
3.1.2 增加乳腺对乳成分前体物的利用
乳腺是乳合成和分泌的重要器官,可以从血液中选择性地摄取乳成分前体物并在乳腺腺泡的分泌细胞中合成乳蛋白、乳脂和乳糖。进入腺泡的乳蛋白前体物包括游离氨基酸和小肽,乳脂前体物包括乙酸、β-羟丁酸和长链脂肪酸,乳糖前体物主要是葡萄糖[32]。Stoldt等[33]每天给泌乳奶牛补充100 mg/kg BW的芦丁,发现芦丁可提高血糖、β-羟丁酸和白蛋白含量,表明芦丁可能对奶牛的能量代谢产生促进作用,通过增加血液中葡萄糖的含量来促进乳糖合成。占今舜[34]给奶牛补饲苜蓿黄酮,结果显示苜蓿黄酮能够上调乳腺上皮细胞中葡萄糖转运体8(Glut8)的表达,提高血糖转运到胞内的能力,推测苜蓿黄酮可能通过提高血液中葡萄糖的含量来促进乳糖合成,进而提高产奶量。
3.2 改善瘤胃内环境
瘤胃内环境是影响奶牛健康和乳品质的重要环节之一。研究表明,黄酮类化合物与奶牛瘤胃微生物之间存在相互关系,例如,饲喂槲皮素等类黄酮可提升瘤胃发酵水平、瘤胃微生物多样性以及饲粮养分消化率,进而提高乳品质和奶牛机体免疫力[35]。在奶牛饲粮中补充富含槲皮素、异槲皮苷、山奈酚等黄酮成分的桑叶黄酮,能够增加奶牛瘤胃中纤维降解菌的丰度,进而提高瘤胃挥发性脂肪酸含量以及淀粉分解菌、牛乳球菌和嗜淀粉瘤胃杆菌等的数量[21]。另有研究表明,奶牛饲粮中添加竹叶提取物(40%竹叶黄酮)可以提高瘤胃内总细菌、厌氧真菌以及黄化瘤胃球菌、白色瘤胃球菌的数量,当添加量为30 g/d时能够使瘤胃pH稳定在5.5~6.3,且显著降低氨态氮(NH3-N)含量,提高微生物蛋白含量,降低丙酸含量和乙丙比,提高总挥发性脂肪酸含量,说明黄酮类化合物可提高饲粮纤维物质的消化率,从而提高乳糖含量,其中30 g/d的添加量能够显著提高乳蛋白含量,90 g/d的添加量能够显著降低乳中体细胞数量,改善乳品质[36]。
3.3 调节乳腺上皮细胞中乳合成相关基因表达量
乳腺上皮细胞是乳腺的产乳单位,能够合成乳蛋白、乳脂、乳糖及其他乳成分,乳腺中乳腺上皮细胞的数量对产奶量和乳品质起到决定性作用。目前,已经确定mTOR和SREBP-1c分别是影响乳腺上皮细胞乳蛋白、乳脂合成的主要信号通路,能够一定程度上调节牛乳的合成和细胞增殖,促进催乳素、游离脂肪酸和氨基酸等的合成[37]。研究表明,Cyclin D1是乳腺上皮细胞增殖的积极调节因子,mTOR是乳蛋白合成的主要调节因子,SREBP-1c是调节乳脂合成的关键转录因子[19]。当用(0、5、10、20、40和80 μmol/L)剂量的大豆黄酮处理乳腺上皮细胞后,大豆黄酮剂量依赖性地促进α-酪蛋白、β-酪蛋白和脂质合成、细胞周期转换,大豆黄酮还刺激mTOR的激活以及Cyclin D1和SREBP-1c的表达[38]。另有研究表明,竹叶黄酮作用于牛乳腺上皮细胞能够显著降低环氧合酶-2(COX-2)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)基因相对表达量,极显著提高真核翻译起始因子4E结合蛋白1(EIF-4EBP1)基因相对表达量;此外,还可以极显著提高牛乳腺上皮细胞中mTOR信号通路关键调控基因mTOR、核糖体p70s6(S6K1)、Cyclin D1和β-酪蛋白基因相对表达量,以此调控乳脂和乳蛋白的合成[39]。
3.4 提高机体的免疫和抗氧化水平
奶牛乳房炎是是造成乳产量降低和乳品质下降的重要原因。黄酮类化合物因其具有抗炎、抗菌、提高免疫等生理功能,能减缓奶牛乳房炎,进而影响奶牛的产奶性能和乳品质。栗明月[36]在对泌乳期奶牛饲粮添加竹叶提取物的试验中发现,饲喂30 g/d的竹叶提取物可以提高奶牛血浆中免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)含量及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性,降低血浆中丙二醛(MDA)含量,显著降低乳中体细胞数,减少奶牛乳房炎的发生率。较高剂量的黄芩素处理的乳腺上皮细胞的活性氧水平降低,并且这种减少的产生与细胞内CAT活性和核因子-E2相关因子-2(Nrf-2)含量的增加有关,表明黄芩素对牛乳腺细胞具有保护性抗氧化作用[18],因此推测黄酮类化合物可能通过降低奶牛乳腺上皮细胞中活性氧水平减少氧化应激,调节乳腺健康,提高乳品质。据报道,黄酮类化合物可抑制细胞壁和细胞膜合成,对特定细胞内或表面的酶产生干扰,从而对引起奶牛乳房炎的细菌起到抑制作用。此外,黄酮类化合物可在一定程度上影响血液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-4(IL-4)的含量,诱导白细胞蛋白酶抑制剂的表达,影响血液中CD4+和CD8+ T淋巴细胞比例以及细胞因子基因的表达来调节机体的免疫性能[8,40-41],进一步提高产奶量及乳品质。
3.5 抑制饲料中黄曲霉菌生长
动物饲料在储存过程中会因水分含量过高、热量产生、雨水淋湿等储存管理不当产生霉菌污染,而饲料的安全与奶牛健康及乳品质息息相关。研究表明,饲料中黄曲霉毒素B1(AFB1)的污染会对奶牛的生理生化指标及瘤胃发酵功能造成不良影响,并且由于AFB1在奶牛体内可以经肝脏代谢形成黄曲霉毒素M1(AFM1),而AFM1可以通过牛奶排出,影响乳品质,给乳制品带来安全隐患[42]。王倩[43]利用代谢组学探究了饲料中的AFB1对奶牛健康和乳品质的影响,结果表明,AFB1能够显著影响血液中SOD活性、MDA含量以及总抗氧化能力,进一步影响瘤胃中挥发性脂肪酸和NH3-N的含量,通过氨基酸代谢途径影响18种瘤胃代谢物、11种血浆代谢物及9种乳代谢物含量,增加乳中黄曲霉毒素的含量,并对产奶量、乳成分、和乳中微生物含量产生影响。
综上所述,黄酮类化合物通过其抑菌作用,抑制和减少饲料中霉菌的产生来保障乳品质;通过调节瘤胃微生物的菌群结构,促进乳腺细胞对乳成分前体物的合成与利用来提高乳品质;通过调控乳腺上皮细胞mTOR和SREBP-1c信号通路上相关基因的表达来调控乳脂、乳蛋白的合成;通过发挥抗菌、抗炎、提高机体免疫力功能减少乳腺的炎症反应,降低乳中体细胞数等多维度来提高乳品质。
4 黄酮类化合物在应用中存在的问题
黄酮类化合物作为后抗生素时代的一类天然稳定的替抗物质具有很大的开发潜力,但是在实际生产中应用还存在诸多问题:1)植物中黄酮类化合物的种类和含量易受到植物种植地土壤、温度、品种等多种因素的影响,黄酮类化合物的主效成分因植物原料的来源不同而差异较大,这使得其质量稳定性较差。通过现代分析技术,对不同批次和品种的黄酮类化合物的主效成分进行表征,是对黄酮类化合物质量稳定性进行评价的有效方法。2)黄酮类化合物经过口腔咀嚼、瘤胃消化、反刍、肠道等多个消化吸收过程,其中的主效成分在奶牛瘤胃及肠道微生物的作用下是如何消化吸收到达奶牛乳腺并发挥生理功能以及黄酮成分是如何分解代谢的还需进一步研究。3)目前黄酮类化合物对奶牛乳品质的研究主要集中在乳糖、乳脂、乳蛋白等泌乳常规指标上,还需进一步加强对于乳中维生素、矿物质、脂肪酸等营养物质影响的研究。
5 小结与展望
本文汇总了添加黄酮类化合物影响奶牛产奶量和乳品质的作用途径,表明黄酮类化合物是从多靶点、多系统、多维度、多层次共同影响乳合成和乳品质,直接或间接地作用于牛乳的合成。结合黄酮类化合物目前的应用现状和存在问题,今后应继续完善植物中黄酮类化合物的成分检测、质量评价系统,明确黄酮类化合物的最适添加量,进一步研究黄酮类化合物在奶牛体内的药代规律和作用机制,深入探讨黄酮类化合物对乳中风味物质的影响等研究,为黄酮类化合物应用于奶牛生产实际奠定坚实的理论基础。