Chinese Journal of Animal Nutrition >

2023 , Vol. 35 >Issue 4: 2369 - 2382

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2023.223

RESEARCH PAPER

Effects of Rutin on Rumen Fermentation Parameters, Microflora, Lactic Acid Metabolite Contents and Enzyme Activities of Dairy Cows in Vitro

  • QIAO Linhui , 1, 2, 3 ,
  • XING Jie 1, 2 ,
  • XU Zixuan 1, 2 ,
  • GAO Min 3 ,
  • LIU Dacheng , 1, 2, * ,
  • HU Honglian , 3, *
Expand
  • 1 College of Veterinary, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
  • 2 Key Laboratory of Clinical Diagnosis and Treatment Technology in Animal Disease, Ministry of Agriculture, Hohhot 010018, China
  • 3 Institute of Animal Nutrition and Feed, Inner Mongolia Academy of Agricultural & Animal Husbandry Sciences, Hohhot 010031, China
*LIU Dacheng, professor, E-mail: ;
HU Honglian, professor, E-mail:

Received date: 2022-09-16

  Online published: 2023-04-12

Fold

Abstract

This experiment was conducted to investigate the effects of rutin supplementation on rumen fermentation parameters, microflora, lactic acid metabolite contents and enzyme activities of dairy cows in vitro under the condition of high-concentrate substrate. Using in vitro batch culture method and single factor experimental design, 0.7 g mixed concentrate (corn∶soybean meal=4∶1) and 0.3 g mixed hay (alfalfa∶oat =1∶1) with concentrate to roughage ratio of 7∶3 were used as fermentation substrates, and were divided into 4 groups according to the supplemental levels of rutin [0 (control), 1.5%, 3.0% and 4.5%], and each group had 3 parallels. At the same time, the rumen fluid was collected from 4 healthy Holstein dairy cows with similar body conditions before morning feeding to prepare the artificial rumen culture medium, which was subjected to anaerobic fermentation at 39 ℃, and the corresponding indices were measured at 3, 6, 9, 12, 18 and 24 h, respectively. The results showed as follows: 1) under the condition of high-concentrate substrate, the rumen fermentation fluid pH<5.80 lasted for 6 h, indicating that subacute rumen acidosis (SARA) model was successfully established. Moreover, compared with the control group, the supplementation of 1.5% and 3.0% rutin significantly increased the pH of rumen fermentation fluid at 18 to 24 h (P<0.05), significantly decreased the contents of propionic acid, isobutyric acid, valeric acid and lactic acid at 24 h (P<0.05), and significantly decreased the methane production at 24 h (P<0.05). The results of multiple-factor associative effects index (MFAEI) showed that the rutin supplemental level at 4.5% had a positive combined effect on rumen fluid fermentation parameters, and had a good in vitro fermentation effect. 2) Compared with the control group, the supplementation of 1.5% and 3.0% rutin significantly decreased the numbers of Methanogens at 6 to 12 h, Lactobacillus at 6 h and Streptococcus bovis at 6 to 12 h (P<0.05), the supplementation of 3.0% rutin significantly decreased the Lactobacillus number at 6 to 24 h (P<0.05), and the supplementation of 4.5% rutin significantly increased the numbers of Selenomonas ruminantium and Megacoccus escheriensis at 12 h (P<0.05). 3) Compared with the control group, the supplementation of 1.5% rutin significantly decreased the pyruvate content at 12 h (P<0.05), and the supplementation of 1.5% and 4.5% rutin significantly decreased the activities of lactate dehydrogenase (LDH), pyruvate kinase (PK) and amylase (AMS) at 6 h (P<0.05). 4) Compared with the control group, the rutin supplementation significantly decreased the lipopolysaccharide (LPS) content at 6 to 12 h (P<0.05). In conclusion, the rutin supplementation can improve the in vitro fermentation of dairy cows and inhibit the methane production under the condition of high-concentrate, and the appropriate supplemental level is 4.5%. In addition, the rutin can reduce the lactic acid production by reducing LPS content, inhibiting lactic acid producing bacteria and lactic acid metabolization-related enzyme activities, slow down the decrease of the rumen fermentation fluid pH, and relieve the SARA induced by high concentrate.

Key words： rutin; dairy cows; in vitro fermentation; microflora; SARA

Cite this article

QIAO Linhui , XING Jie , XU Zixuan , GAO Min , LIU Dacheng , HU Honglian . Effects of Rutin on Rumen Fermentation Parameters, Microflora, Lactic Acid Metabolite Contents and Enzyme Activities of Dairy Cows in Vitro[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2023 , 35(4) : 2369 -2382 . DOI: 10.12418/CJAN2023.223

在高度集约化养殖的现代牧场,为了提高奶牛的产奶潜力,往往给奶牛饲喂高精料饲粮来满足其高产的能量需求,然而饲喂高精料易引起瘤胃异常发酵、微生物群落失衡、挥发性脂肪酸(VFA)蓄积、pH降低以及脂多糖(LPS)、组胺(HIS)等异常代谢产物增多等,导致亚急性瘤胃酸中毒(SARA)的发生[1],甚至引发机体局部乃至系统的炎症反应,诱发蹄叶炎、乳房炎和肝脓肿等诸多常见疾病,最终影响奶牛健康与福利,降低生产性能,并对奶牛养殖业造成重大经济损失等诸多负面影响[2]。因此,对其进行有效地预防和缓解尤为重要。植物提取物作为一种天然、安全的新型饲料添加剂,在一定程度上能够调控瘤胃发酵模式,减弱由于长期饲喂高精料饲粮对机体产生的一系列负面影响[3],其包括黄酮类、皂苷、单宁和生物碱等,这些活性物质能够缓解SARA,其主要作用体现在减缓瘤胃pH下降、维持瘤胃内环境稳态[3⇓-5]。芦丁,化学式为C27H30O(分子结构见图1),相对分子质量为610.52,是一种天然黄酮类化合物,广泛分布于芸香科以及豆科植物全株,其特殊的分子结构赋予了芦丁抗炎、抗氧化、抗病原微生物等多种生物活性功能[6],并能通过促进免疫器官的发育来提高机体免疫力[7]。近年来的研究表明,芦丁能够改善机体抗氧化能力,提高生产性能[8],影响瘤胃微生物多样性[9],提高瘤胃VFA及菌体蛋白(BCP)含量,调控瘤胃发酵[10]。不过,这些研究主要集中于羊上,芦丁在奶牛上是否也发挥着类似的作用还鲜有报道,尤其在高精料饲粮模式下,芦丁是否能调控奶牛体外瘤胃发酵模式尚没有相关研究结果。因此,本试验旨在通过体外法研究芦丁对高精料饲粮条件下奶牛瘤胃发酵参数、微生物区系、乳酸代谢产物含量及酶活性的影响,以期为芦丁在奶牛生产实践中的应用和后续相关研究提供理论依据。
图1 芦丁的分子结构

Fig.1 Molecular structure of rutin

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用芦丁购自上海某生物科技有限公司,货号为S13033,纯度≥95%。

1.2 试验设计

本试验采用单因素试验设计,选用玉米、豆粕、苜蓿干草和燕麦干草4种奶牛常用饲草料,配制成精粗比为7∶3的发酵底物,该底物组成为玉米0.56 g、豆粕0.14 g、苜蓿干草0.15 g和燕麦干草0.15 g,共计1.00 g,均粉碎后过40目筛。根据底物中芦丁添加水平的不同,将试验分为4组,芦丁添加水平分别为0(对照)、1.5%、3.0%和4.5%,每组设3个平行,于39 ℃下厌氧发酵培养。底物组成及营养水平见表1。
表1 底物组成及营养水平(干物质基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of substrate (DM basis) %

原料Ingredients 含量Content 营养水平Nutrient levels 含量Content
玉米Corn 56.00 干物质DM 94.43
豆粕Soybean meal 14.00 粗蛋白质CP 14.65
苜蓿干草Alfalfa hay 15.00 中性洗涤纤维NDF 38.58
燕麦干草Oat hay 15.00 酸性洗涤纤维ADF 10.48
合计Total 100.00 钙Ca 0.32
磷P 0.34

营养水平均为实测值。

Nutrient levels were measured values.

1.3 体外发酵

选取4头体况相近的健康荷斯坦奶牛,晨饲前采集瘤胃液,混匀,收集于39 ℃预热并充满二氧化碳(CO2)的保温瓶内,迅速返回实验室。将瘤胃液在39 ℃水浴锅中经4层纱布过滤,滤液与人工唾液按1∶2(体积比)混合,人工唾液参照Menke等[11]的方法配制,制成混合人工瘤胃培养液,在此过程中持续通入CO2以保持厌氧环境。
准确称取1.0 g发酵底物及对应比例的芦丁于提前预热好的150 mL发酵瓶中,向每个发酵瓶中加入上述混合人工瘤胃培养液90 mL,立即盖严瓶塞,并置于39 ℃恒温水浴摇床中(HZ-8812S,常州朗越仪器制造有限公司),以90 r/min速率振荡,进行体外发酵培养。分别于培养3、6、9、12、18和24 h时,在冰水浴中终止发酵,发酵液经4层纱布过滤,收集滤液,待测定pH后,分为2部分,分别存于-20和-80 ℃冰箱,待测瘤胃发酵参数等以及瘤胃微生物区系;另配1份相同培养液置于微生物发酵微量产气自动记录仪中记录实时累计产气量。

1.4 指标测定及方法

1.4.1 瘤胃发酵液发酵参数的测定

分别于培养3、6、9、12、18和24 h时,收集各组发酵液,并立即使用pHs-3c型酸度计[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]测定pH;参照李敏[12]的气相色谱法测定总挥发性脂肪酸(TVFA)及各组分含量;采用冯宗慈等[13]改进的比色法测定氨态氮(NH3-N)含量;采用考马斯亮蓝染色法[14]测定BCP含量。应用多项指标综合指数(MFAEI)对瘤胃发酵参数进行综合评定,计算公式如下[15]:
单项指标综合指数(SFAEI)= ∑ n n = 1 ( A 2 - A 1 ) / n A 3;
MFAEI=各指标SFAEI之和。
式中:A1为对照组各时间点各指标数值;A2为1.5%、3.0%和4.5%芦丁组各时间点各指标数值;A3为各时间点A2之和的平均值;n为时间点数。

1.4.2 产气量和甲烷产量

采用沈英等[16]研制的AGRS-Ⅲ微生物发酵微量产气自动记录仪测定产气量,产气测定时统计各时间点(3、6、9、12、18和24 h)的产气量。采集发酵24 h时的气体,根据中华人民共和国国家环境保护标准(HJ 38-2017),使用气相色谱法测定气体中的甲烷产量。

1.4.3 细菌总DNA提取及相对定量

取发酵液200 μL,使用粪便基因组DNA提取试剂盒(DP328,TIANGEN)提取发酵液总DNA。荧光定量PCR引物设计参考文献[17⇓⇓-20],由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列见表2。按SuperReal PreMix Plus试剂盒(FP205,TIANGEN)说明书建立20 μL反应体系及反应条件,使用荧光定量PCR仪(Quant Studio 7,Applied Biosystems)上机测定。测定结果以占总菌16S rDNA的百分比表示[21]。
表2 引物序列

Table 2 Primer sequences

细菌
Bacteria		 引物序列
Primer sequences
(5'—3')		 扩增长度
Amplification
length/bp		 参考文献
References
总菌16S rDNA
Total bacteria 16S rDNA		 F:CGGCAACGAGCGCAACCC
R:CCATTGTAGCACGTGTGTAGCC		 130 [17]
产甲烷菌
Methanogens		 F:TTCGGTGGATCDCARAGRGC
R:GBARGTCGWAWCCGTAGAATCC		 140 [18]
牛链球菌
Streptococcus bovis		 F:ATTCTTAGAGATAGGGTTTCTCTT
R:ACCTTATGATGGCAACTAACAATA		 128 [19]
乳酸杆菌
Lactobacillus		 F:AGCAGTAGGGAATCTTCCA
R:CGCCACTGGTGTTCYTCCATATA		 376 [20]
反刍兽月形单胞菌
Selenomonas ruminantium		 F:CAATAAGCATTCCGCCTGGG
R:TTCACTCAATGTCAAGCCCTGG		 139 [19]
埃氏巨型球菌
Megasphaera elsdenii		 F:AGATGGGGACAACAGCTGGA
R:CGAAAGCTCCGAAGAGCCT		 95 [19]

1.4.4 瘤胃发酵液乳酸代谢产物含量及酶活性的测定

丙酮酸含量及乳酸脱氢酶(LDH)、丙酮酸激酶(PK)及淀粉酶(AMS)活性均采用试剂盒测定,试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.4.5 瘤胃发酵液异常代谢物质含量的测定

LPS和HIS含量均采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒测定,试剂盒由泉州市睿信生物科技有限公司提供。

1.5 数据处理与统计分析

采用SPSS 22.0软件对试验数据进行单因素方差分析,采用Duncan氏法进行多重比较,并采用曲线估计(curve estimation)程序对芦丁不同添加水平对体外瘤胃发酵参数的影响进行线性和二次曲线比较。结果用平均值和均值标准误(SEM)表示,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 高精料底物中添加芦丁对奶牛瘤胃发酵液pH的影响

由表3可知,与对照组相比,发酵9、18和24 h时,1.5%和3.0%芦丁组奶牛瘤胃发酵液pH显著提高(P<0.05),且发酵液pH随芦丁添加水平的升高呈显著的二次曲线变化(P<0.05);各组间pH在发酵其他时间点时则无显著差异(P>0.05)。
表3 高精料底物中添加芦丁对奶牛瘤胃发酵液pH的影响

Table 3 Effects of rutin supplement in high-concentrate substrate on pH in rumen fermentation fluid of dairy cows

时间
Time/h		 芦丁添加水平Rutin supplemental levels/% SEM P值P-value
0(对照
Control)		 1.5 3.0 4.5 处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic
3 6.64 6.62 6.68 6.67 0.01 0.324 0.175 0.416
6 6.43 6.43 6.42 6.43 0.01 0.970 0.775 0.941
9 6.17b 6.33a 6.29a 6.26ab 0.02 0.031 0.243 0.032
12 6.05 6.12 6.09 6.06 0.02 0.513 0.950 0.380
18 5.79b 5.96a 5.93a 5.88ab 0.03 0.045 0.358 0.020
24 5.71b 5.85a 5.84a 5.80ab 0.02 0.039 0.165 0.018

同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 高精料底物中添加芦丁对奶牛瘤胃发酵液VFA和乳酸含量的影响

由表4可知,与对照组相比,发酵18和24 h时,1.5%和3.0%芦丁组奶牛瘤胃发酵液丙酸、异丁酸和戊酸含量显著降低(P<0.05);各芦丁添加组乙酸、丁酸、异戊酸和TVFA含量及乙酸/丙酸值呈降低趋势,但无显著差异(P>0.05)。1.5%芦丁组乳酸含量在各发酵时间点均显著低于对照组、3.0%和4.5%芦丁组(P<0.05);发酵24 h时,3.0%芦丁组乳酸含量显著低于对照组(P<0.05),且随芦丁添加水平的升高呈显著二次曲线变化(P<0.05)。
表4 高精料底物中添加芦丁对奶牛瘤胃发酵液VFA和乳酸含量的影响

Table 4 Effects of rutin supplement in high-concentrate substrate on contents of VFA and lactic acid in rumen fermentation fluid of dairy cows

项目
Items		 芦丁添加水平Rutin supplemental levels/% SEM P值P-value
0(对照
Control)		 1.5 3.0 4.5 处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic
乙酸Acetic acid/(mmol/L)
6 h 28.57 25.56 25.07 24.94 0.93 0.530 0.184 0.320
12 h 40.14 34.57 35.37 37.15 1.82 0.771 0.640 0.579
18 h 55.36 47.20 48.68 49.97 1.02 0.458 0.742 0.458
24 h 65.07 56.11 57.30 62.14 1.86 0.311 0.871 0.348
丙酸Propionic acid/(mmol/L)
6 h 8.73 8.73 7.83 7.74 0.27 0.399 0.101 0.280
12 h 11.56 9.72 9.92 10.58 0.47 0.562 0.537 0.361
18 h 19.07a 15.93b 16.09b 17.40ab 0.33 0.023 0.342 0.015
项目
Items		 芦丁添加水平Rutin supplemental levels/% SEM P值P-value
0(对照
Control)		 1.5 3.0 4.5 处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic
24 h 25.37a 20.05b 19.91b 22.68ab 0.79 0.011 0.264 0.004
异丁酸Isobutyric acid/(mmol/L)
6 h 0.37 0.35 0.34 0.34 0.01 0.721 0.296 0.502
12 h 0.75 0.65 0.66 0.66 0.03 0.694 0.370 0.514
18 h 1.12a 0.88b 0.79b 0.97b 0.12 0.042 0.571 0.051
24 h 1.61a 1.05b 1.07b 1.36a 0.08 <0.001 0.006 0.001
丁酸Butyric acid/(mmol/L)
6 h 3.40 2.76 3.23 3.14 0.12 0.257 0.774 0.518
12 h 9.02 7.66 8.03 7.93 0.36 0.626 0.395 0.496
18 h 11.28 9.37 10.03 10.89 0.65 0.534 0.375 0.261
24 h 13.06 12.74 12.80 13.40 0.24 0.818 0.296 0.585
异戊酸Isovaleric acid/(mmol/L)
6 h 0.57 0.50 0.51 0.53 0.02 0.451 0.474 0.271
12 h 1.33 1.14 1.17 1.19 0.06 0.695 0.471 0.518
18 h 1.87 1.71 1.63 1.65 0.09 0.264 0.431 0.530
24 h 2.45 2.17 2.13 2.13 0.06 0.138 0.035 0.085
戊酸Valeric acid/(mmol/L)
6 h 0.42 0.32 0.37 0.37 0.02 0.178 0.527 0.280
12 h 1.01 0.86 0.90 0.93 0.04 0.676 0.574 0.503
18 h 1.89a 1.33b 1.39b 1.78a 0.02 0.023 0.758 0.016
24 h 2.26a 1.76b 1.91b 2.18a 0.07 0.007 0.944 0.010
总挥发性脂肪酸TVFA/(mmol/L)
6 h 42.07 38.23 37.35 37.06 1.30 0.556 0.181 0.338
12 h 63.81 54.60 56.05 58.44 2.76 0.720 0.578 0.529
18 h 89.72 74.11 77.24 85.39 1.79 0.650 0.591 0.477
24 h 109.83 93.89 95.12 103.58 2.96 0.179 0.654 0.164
乙酸/丙酸Acetic acid/propionic acid
6 h 3.27 2.93 3.20 3.22 0.06 0.084 0.784 0.258
12 h 3.46 3.55 3.55 3.51 0.03 0.786 0.668 0.120
18 h 2.90 2.96 3.02 2.87 0.17 0.650 0.553 0.721
24 h 2.75 2.65 2.87 2.74 0.06 0.713 0.670 0.872
乳酸Lactic acid/(mmol/L)
6 h 0.43b 0.30c 0.51a 0.41a 0.03 <0.001 0.080 0.127
12 h 0.50a 0.33b 0.56a 0.49a 0.03 0.001 0.169 0.175
18 h 0.61a 0.38b 0.57a 0.56a 0.10 0.009 0.439 0.125
24 h 0.68a 0.44c 0.59b 0.62ab 0.03 0.001 0.978 0.039

2.3 高精料底物中添加芦丁对奶牛瘤胃发酵液NH3-N及BCP含量的影响

由表5可知,与对照组相比,高精料底物中添加芦丁对奶牛瘤胃发酵液NH3-N含量无显著影响(P>0.05)。发酵6 h时,4.5%芦丁组BCP含量显著高于其他各组(P<0.05);发酵12 h时,3.0%芦丁组BCP含量显著高于其他各组(P<0.05);发酵18和24 h时,1.5%和3.0%芦丁组BCP含量均有高于对照组的趋势(P>0.05)。
表5 高精料底物中添加芦丁对奶牛瘤胃发酵液NH3-N和BCP含量的影响

Table 5 Effects of rutin supplement in high-concentrate substrate on contents of NH3-N and BCP in rumen fermentation fluid of dairy cows mg/dL

项目
Items		 芦丁添加水平Rutin supplemental levels/% SEM P值P-value
0(对照
Control)		 1.5 3.0 4.5 处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic
氨态氮NH3-N
6 h 12.04 12.03 12.55 12.44 0.19 0.744 0.340 0.645
12 h 12.52 11.16 12.84 12.42 0.29 0.165 0.619 0.663
18 h 12.57 11.65 13.01 12.98 0.37 0.301 0.461 0.337
24 h 12.46 12.05 13.12 13.30 0.27 0.339 0.134 0.295
菌体蛋白BCP
6 h 18.87bc 20.56b 16.67c 24.56a 0.95 0.001 0.125 0.062
12 h 41.83b 38.73b 52.71a 35.44b 2.31 0.014 0.815 0.329
18 h 50.51 55.99 56.03 47.76 3.11 0.053 0.775 0.340
24 h 56.00 62.33 60.04 53.31 1.42 0.080 0.441 0.030

2.4 高精料底物中添加芦丁对奶牛瘤胃发酵液产气量和甲烷产量的影响

由表6可知,发酵12、18和24 h时,4.5%芦丁组奶牛瘤胃发酵液产气量显著高于其他各组(P<0.05);发酵24 h时,1.5%芦丁组产气量显著高于对照组(P<0.05);发酵12 h时,产气量随芦丁添加水平的升高呈显著的线性和二次曲线变化(P<0.05)。1.5%和3.0%芦丁组24 h甲烷产量显著低于对照组(P<0.05),且随芦丁添加水平的升高呈极显著的二次曲线变化(P<0.01)。
表6 高精料底物中添加芦丁对奶牛瘤胃发酵液产气量和甲烷产量的影响

Table 6 Effects of rutin supplement in high-concentrate substrate on gas production and methane production in rumen fermentation fluid of dairy cows

项目
Items		 芦丁添加水平Rutin supplemental levels/% SEM P值P-value
0(对照
Control)		 1.5 3.0 4.5 处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic
产气量Gas production/mL
6 h 53.15 51.95 50.17 57.91 1.20 0.106 0.265 0.076
12 h 90.84b 93.92b 90.97b 100.43a 1.24 <0.001 0.011 0.010
18 h 100.21b 105.76b 102.10b 110.34a 1.46 <0.001 0.150 0.124
24 h 104.98c 109.31b 105.77c 115.37a 1.25 <0.001 0.060 0.090
24 h甲烷产量
Methane production
at 24 h/%		 5.73a 4.73b 3.50c 5.05ab 0.27 0.003 0.190 0.007

2.5 高精料底物中添加芦丁对奶牛瘤胃发酵液发酵参数影响的综合评定

由表7可知,在高精料底物条件下,芦丁添加水平的MFAEI自低到高为1.5%芦丁组<3.0%芦丁组<4.5%芦丁组,且4.5%芦丁组产生了正组合效应,因此,以4.5%芦丁添加水平对体外发酵效果最佳。
表7 高精料底物中添加芦丁对奶牛瘤胃发酵液发酵参数影响的综合评定

Table 7 Comprehensive evaluation of rutin supplement in high-concentrate substrate on fermentation parameters in rumen fermentation fluid of dairy cows

项目
Items		 芦丁添加水平Rutin supplemental levels/%
1.5 3.0 4.5
单项指标综合指数SFAEI/×10-2
pH 1.39 1.18 0.81
氨态氮NH3-N -5.76 3.75 3.03
菌体蛋白BCP 5.75 9.73 -3.94
总挥发性脂肪酸TVFA -17.92 -14.93 -7.37
产气量Gas production 3.26 -0.05 9.08
多项指标综合指数MFAEI -13.28 -0.32 1.61

2.6 高精料底物中添加芦丁对瘤胃发酵液微生物区系的影响

由表8可知,发酵6和12 h时,各芦丁添加组奶牛瘤胃发酵液产甲烷菌(Methanogens)数量均显著低于对照组(P<0.05),并随芦丁添加水平的升高呈显著的线性和二次曲线变化(P<0.05);而在发酵18和24 h时,1.5%芦丁组产甲烷菌数量均低于其余各组,且显著低于4.5%芦丁组(P<0.05)。与对照组相比,发酵6 h时,1.5%和3.0%芦丁组乳酸杆菌(Lactobacillus)数量显著降低(P<0.05);发酵12、18和24 h时,3.0%和4.5%芦丁组乳酸杆菌数量显著降低(P<0.05),且在4个发酵时间点乳酸杆菌数量均随芦丁添加水平的升高呈显著的二次曲线变化(P<0.05)。发酵6和12 h时,各芦丁添加组牛链球菌(Streptococcus bovis)数量均显著低于对照组(P<0.05)。发酵12 h时,4.5%芦丁组反刍兽月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)数量显著高于其他各组(P<0.05),其他时间点各组间无显著差异(P>0.05)。与对照组相比,发酵6 h时,各芦丁添加组埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)数量均显著降低(P<0.05);发酵12 h时,3.0%和4.5%芦丁组埃氏巨型球菌数量显著提高(P<0.05);发酵18和24 h时,1.5%芦丁组埃氏巨型球菌数量显著降低(P<0.05)。
表8 高精料底物中添加芦丁对奶牛瘤胃发酵液微生物区系的影响

Table 8 Effects of rutin supplement in high-concentrate substrate on microflora in rumen fermentation fluid of dairy cows %

项目
Items		 芦丁添加水平Rutin supplemental levels/% SEM P值P-value
0(对照
Control)		 1.5 3.0 4.5 处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic
产甲烷菌Methanogens
6 h 0.040a 0.015bc 0.022b 0.008c 0.004 0.001 0.003 0.009
12 h 0.072a 0.029b 0.021b 0.032b 0.006 <0.001 0.012 <0.001
18 h 0.253ab 0.175b 0.247ab 0.322a 0.150 0.031 0.368 0.036
24 h 0.312ab 0.221b 0.321ab 0.372a 0.021 0.042 0.140 0.059
乳酸杆菌Lactobacillus/×10-2
6 h 0.369a 0.155b 0.116b 0.358a 0.037 0.001 0.840 <0.001
12 h 0.458a 0.418a 0.261b 0.269b 0.028 0.001 <0.001 0.002
18 h 0.402a 0.325ab 0.217b 0.233b 0.053 0.035 0.021 0.048
24 h 0.326a 0.280ab 0.186b 0.209b 0.021 0.028 0.008 0.019
牛链球菌Streptococcus bovis/×10-4
6 h 3.509a 2.292b 1.684bc 1.313c 0.266 <0.001 <0.001 <0.001
12 h 2.476a 0.970c 0.828c 1.769b 0.259 <0.001 0.500 <0.001
18 h 3.858 2.004 2.175 4.471 0.733 0.097 0.550 0.012
24 h 5.896 4.382 5.811 6.511 0.407 0.318 0.379 0.305
项目
Items		 芦丁添加水平Rutin supplemental levels/% SEM P值P-value
0(对照
Control)		 1.5 3.0 4.5 处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic
反刍兽月形单胞菌Selenomonas ruminantium
6 h 2.084 1.928 2.151 1.280 0.165 0.235 0.146 0.194
12 h 2.010b 2.899b 3.076b 4.649a 0.328 0.007 0.001 0.004
18 h 4.572 3.955 4.277 4.830 0.257 0.086 0.094 0.062
24 h 5.322 4.834 5.213 5.105 0.183 0.168 0.890 0.876
埃氏巨型球菌Megasphaera elsdenii/×10-2
6 h 1.033a 0.451b 0.301b 0.272b 0.096 <0.001 <0.001 <0.001
12 h 0.605c 0.893bc 1.086ab 1.421a 0.105 0.012 <0.001 0.003
18 h 1.976a 1.353b 2.215a 2.599a 0.274 0.037 0.068 0.027
24 h 3.083a 2.237b 3.316a 3.488a 0.171 0.013 0.139 0.095

2.7 高精料底物中添加芦丁对奶牛瘤胃发酵液乳酸代谢产物含量及酶活性的影响

由表9可知,发酵6 h时,1.5%和4.5%芦丁组奶牛瘤胃发酵液LDH、PK和AMS活性均显著低于对照组和3.0%芦丁组(P<0.05);发酵18和24 h时,1.5%芦丁组PK活性高于对照组、3.0%和4.5%芦丁组(P<0.05);同时,4.5%芦丁组发酵18 h时以及3.0%和4.5%芦丁组发酵24 h时的丙酮酸含量显著高于对照组和1.5%芦丁组(P<0.05),且发酵24 h时的丙酮酸含量随芦丁添加水平的升高呈显著的线性和二次曲线变化(P<0.05)。
表9 高精料底物中添加芦丁对奶牛瘤胃发酵液乳酸代谢产物含量及酶活性的影响

Table 9 Effects of rutin supplement in high-concentrate substrate on lactic acid metabolite contents and enzyme activities in rumen fermentation fluid of dairy cows

项目
Items		 芦丁添加水平Rutin supplemental levels/% SEM P值P-value
0(对照
Control)		 1.5 3.0 4.5 处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic
丙酮酸Pyruvate/(μmol/mL)
6 h 0.26 0.21 0.26 0.26 0.01 0.525 0.535 0.589
12 h 0.19a 0.12b 0.22a 0.20a 0.01 0.004 0.295 0.302
18 h 0.15b 0.14b 0.17ab 0.18a 0.02 0.039 0.065 0.103
24 h 0.13b 0.11b 0.16a 0.18a 0.01 0.008 0.004 0.011
乳酸脱氢酶LDH/(U/L)
6 h 28.95a 18.42b 26.32a 17.98b 1.70 0.012 0.102 0.267
12 h 31.02 21.76 25.93 26.16 1.69 0.314 0.517 0.322
18 h 27.35 18.87 20.99 25.74 1.33 0.370 0.649 0.477
24 h 22.69 16.67 20.37 25.46 1.57 0.252 0.417 0.143
丙酮酸激酶PK/(U/L)
6 h 9.61a 5.98b 10.03a 5.76b 0.68 0.006 0.235 0.500
12 h 7.90 9.18 5.98 8.11 0.57 0.273 0.517 0.678
18 h 6.34b 8.79a 5.03b 6.25b 0.72 0.043 0.216 0.374
24 h 4.96b 8.69a 4.62b 4.57b 0.54 <0.001 0.303 0.115
淀粉酶AMS/(U/dL)
6 h 21.35a 16.77b 20.34a 7.61c 1.64 <0.001 0.005 0.004
12 h 26.87 20.97 23.77 29.06 1.36 0.153 0.466 0.074
18 h 35.59 30.47 32.71 36.06 2.58 0.362 0.400 0.221
24 h 47.49 40.92 41.13 41.44 1.87 0.605 0.305 0.406

2.8 高精料底物中添加芦丁对奶牛瘤胃发酵液异常代谢物质含量的影响

由表10可知,随着发酵时间的延长,各组奶牛瘤胃组发酵液LPS和HIS含量均逐渐升高。发酵6和12 h时,各芦丁添加组LPS含量均显著低于对照组(P<0.05),且随芦丁添加水平的升高呈显著的线性和二次曲线变化(P<0.05);而在18和24 h时,各组间LPS含量则无显著差异(P>0.05)。各组各发酵时间点间HIS含量均无显著差异(P>0.05)。
表10 高精料底物中添加芦丁对奶牛瘤胃发酵液LPS和HIS含量的影响

Table 10 Effects of rutin supplement in high-concentrate substrate on contents of LPS and HIS in rumen fermentation fluid of dairy cows

项目
Items		 芦丁添加水平Rutin supplemental levels/% SEM P值P-value
0(对照
Control)		 1.5 3.0 4.5 处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic
脂多糖LPS/(EU/L)
6 h 129.16a 117.09b 112.94b 115.69b 2.22 0.015 0.016 0.004
12 h 135.47a 124.06b 117.34b 122.42b 2.39 0.018 0.023 0.005
18 h 136.58 125.35 121.39 126.21 2.43 0.105 0.138 0.110
24 h 137.86 123.82 123.43 128.27 2.95 0.298 0.290 0.150
组胺HIS/(ng/mL)
6 h 0.65 0.67 0.61 0.68 0.027 0.127 0.493 0.171
12 h 0.88 0.86 0.83 0.87 0.029 0.315 0.182 0.152
18 h 1.13 1.17 1.15 1.15 0.036 0.277 0.651 0.583
24 h 1.25 1.28 1.24 1.21 0.018 0.576 0.315 0.420

3 讨论

3.1 芦丁对奶牛瘤胃体外发酵参数的影响

瘤胃pH是反映瘤胃发酵稳定性的一个特征性指标,也是反映SARA的直接指标,微生物发挥作用的适宜pH为6.2~6.8[22]。当瘤胃持续处于低pH状态下,则预示着反刍动物发生瘤胃酸中毒的风险较高。有研究认为,瘤胃pH低于5.80可作为SARA的诊断依据[23]。在本试验中,发酵18~24 h时,对照组瘤胃发酵液pH低于5.80长达6 h,表明成功建立了体外SARA模型。而添加芦丁不同程度地减缓了pH下降,1.5%和3.0%芦丁组能够显著提高18~24 h瘤胃发酵液pH,使其pH维持在5.8以上,这与郭长征[24]在高精料饲粮中添加槲皮素,以及王梦竹等[25]在饲粮中添加0.2%苜蓿黄酮的研究结果相似,这是由于芦丁降低了发酵液中微生物代谢产生VFA及乳酸的速率,从而减缓了pH的下降幅度,表明芦丁有调节瘤胃pH的潜能。
VFA(尤其乙酸、丙酸和丁酸)是瘤胃微生物厌氧发酵过程中产生的主要代谢产物,反刍动物进行生命活动所需70%~80%的能量由VFA提供[26],其含量不仅反映着瘤胃发酵功能的强弱,也是瘤胃pH发生波动的主要因素之一。王梦竹等[25]研究发现,随着苜蓿黄酮添加水平的升高,瘤胃TVFA及其各组分的含量逐渐降低。而占今舜等[10]研究发现,芦丁的添加水平会影响湖羊瘤胃TVFA含量,低剂量芦丁能提高瘤胃TVFA含量,而高剂量芦丁则会降低部分VFA含量,表明瘤胃VFA含量受芦丁添加水平的影响。与以上结果相似,本试验中,添加芦丁有降低奶牛瘤胃液TVFA及各组分含量的趋势,其中1.5%和3.0%芦丁能显著降低瘤胃发酵液18和24 h的丙酸、异丁酸和戊酸含量,而4.5%芦丁则无显著差异,这说明添加芦丁对发酵产酸具有一定的抑制作用,且与剂量密切相关,究其原因,可能是芦丁调节了瘤胃微生物区系,降低了纤维素、淀粉降解菌及相关酶类的数量,抑制了产酸过程,但本试验并未测定纤维降解菌等的数量,需要进行进一步试验验证。此外,随着芦丁添加水平的升高,TVFA含量呈上升趋势,但始终低于对照组,提示可能对瘤胃发酵产生影响,但结合MFAEI结果来看,4.5%芦丁能够产生正向组合效应,因此,由于体外与体内试验的环境差异,需要进一步开展体内试验,以本试验结果为参考,有针对性地筛选添加水平,以验证芦丁对反刍动物瘤胃发酵的影响。乳酸也是反刍动物瘤胃发酵过程中的重要产物,其含量相对于VFA来说较少,但其酸度是VFA的10倍,乳酸在瘤胃内发生蓄积也是造成瘤胃酸中毒的主要原因[27]。在本试验中,乳酸含量随发酵时间的延长而增加,添加1.5%和3.0%的芦丁能显著降低发酵24 h时乳酸含量,这与本研究中乳酸产生菌的变化趋势相符,这可能是由于芦丁通过抑制乳酸产生菌的生长,减缓了乳酸的产生速率,乳酸利用菌可利用的原料减少,进而导致其转化的丙酸含量随之降低。
NH3-N和BCP含量密切相关,前者反映着瘤胃微生物对底物中蛋白质的分解能力及吸收速率,也是后者合成的前体物质。以往研究表明,大多数黄酮类化合物对NH3-N含量有降低趋势[10,28],而对BCP含量则有提高作用[29-30]。本试验中,添加芦丁对瘤胃发酵液NH3-N含量没有影响,且均在正常范围(6.58~36.7 mg/dL)[31]之内,这可能是由于黄酮类型的不同,对蛋白质分解菌及蛋白酶活性的调控作用不尽相同。芦丁对BCP含量的影响并不一致,4.5%和3.0%芦丁组分别在发酵6和12 h时提高了发酵液BCP含量,其余时间点各组均无显著差异。在瘤胃BCP合成过程中,主要受碳源VFA的量、氮源NH3-N的量以及二者平衡程度的影响,本试验BCP含量变化与NH3-N含量变化规律基本相符,但与VFA含量变化规律不符,这可能是由于芦丁提高了瘤胃微生物的作用力,增强了其摄取NH3-N转化为BCP的速率,且与其添加水平有很大关联,具体原因还有待于进一步试验研究。
产气量常被用于估测瘤胃细菌、真菌和原虫的活力,评价瘤胃发酵效果。甲烷作为一种温室气体,凭借其相当于二氧化碳28倍的温室效应潜力,已对全球大气环境产生严重威胁[32]。大量研究表明,黄酮类化合物可以调控瘤胃发酵,降低甲烷排放量。如白齐昌[29]研究表明,沙棘黄酮可以显著提高产气量,并极显著降低甲烷产量。同样,Oskoueian等[33]通过体外试验发现,添加4.5%的芦丁可以提高产气量,并显著降低甲烷产量。魏欢等[28]也研究发现,添加不同水平芦丁可显著提高24 h体外产气量。与以上试验结果相似,本试验中,发酵24 h时1.5%芦丁组产气量显著提高,4.5%芦丁组产气量则始终显著提高;1.5%和3.0%芦丁组24 h甲烷产量显著降低,这与产甲烷菌数量变化趋势基本相符。由此可见,芦丁能够可以通过增强瘤胃微生物的活力,提高产气量,并在一定程度上减少奶牛瘤胃甲烷排放,有作为反刍动物有效的甲烷抑制剂的潜力。
综上所述,芦丁能通过降低发酵液VFA及乳酸含量,减缓pH下降,具有缓解SARA的潜力,且对瘤胃微生物BCP的合成以及产气量具有一定促进作用,并能降低甲烷产量。MFAEI结果表明,芦丁添加水平为4.5%时,对瘤胃液体外发酵参数产生了正组合效应,具有较好的体外发酵效果。

3.2 芦丁对奶牛瘤胃体外发酵微生物区系的影响

大量研究结果表明,黄酮类化合物能够通过改变瘤胃细菌的菌群结构和组成,调控反刍动物对饲粮中营养物质的利用程度,但因黄酮类化合物的种类不同,其产生的效果也不尽相同[34⇓-36]。产甲烷菌是瘤胃产生甲烷的主要途径,其与甲烷的产量息息相关,瘤胃中甲烷的产生大部分是产甲烷菌的直接作用结果[37]。本试验发现,芦丁能够降低瘤胃发酵液产甲烷菌数量,进而降低甲烷产量。此外,Oskoueian等[33]研究表明,槲皮素能通过降低发酵液的总原虫数,进而使与原虫有着共生关系的产甲烷菌随之降低,导致甲烷产量降低。乳酸杆菌和牛链球菌是瘤胃中主要的乳酸产生菌,反刍兽月形单胞菌和埃氏巨型球菌是主要的乳酸利用菌,乳酸产生菌与乳酸利用菌之间的动态平衡维系着反刍动物瘤胃内乳酸含量的稳定,但当动物长期采食高精料饲粮时,被淀粉分解菌分解,产生大量VFA,pH降低,致使耐酸的乳酸产生菌成为优势菌群,发酵产生大量乳酸,导致乳酸蓄积,进一步降低瘤胃pH,破坏瘤胃内环境稳态,造成损伤[38]。本试验中,添加芦丁有降低乳酸杆菌和牛链球菌数量的作用,且当添加水平为1.5%和3.0%时尤为显著,而对埃氏巨型球菌和反刍兽月形单胞菌数量的影响结果不完全一致,具体原因有待深入研究。

3.3 芦丁对奶牛瘤胃体外发酵乳酸代谢产物含量及酶活性的影响

在机体代谢产生乳酸的过程中,首先由AMS将淀粉分解为小分子糖类,再经由糖酵解途径,在PK等的作用下生成丙酮酸,进而在LDH的催化下生成乳酸。因此,丙酮酸含量以及AMS、PK、LDH活性等可以在一定程度上影响乳酸的产生。陈威等[39]研究发现,富含黄酮类化合物的核桃青皮提取物可以显著降低瘤胃液乳酸含量以及PK、LDH等的活性。与以上研究结果相似,本试验中,添加芦丁有降低瘤胃发酵液丙酮酸含量和LDH、PK、AMS活性的趋势,在添加水平为1.5%时差异显著,表明芦丁具有减缓高淀粉饲粮在瘤胃中代谢转化为乳酸的潜能,且与添加水平有关。

3.4 芦丁对奶牛瘤胃体外发酵异常代谢物质含量的影响

随着高精料饲粮的持续供应,瘤胃VFA、乳酸含量不断蓄积,导致pH持续下降,瘤胃内环境呈酸性环境稳态失衡,不耐酸的革兰氏阴性菌裂解,释放出LPS,而耐酸的HIS产生菌则促使大量组氨酸脱羧形成HIS,从而对瘤胃产生进一步危害。已有研究表明,当SARA发生时,LPS含量会出现显著升高现象[40]。本试验中,芦丁能够显著降低6和12 h时瘤胃发酵液中的LPS含量,对HIS含量则无显著影响,这可能是由于芦丁能够减缓pH下降,从而减少了部分不耐酸的革兰氏阴性菌的死亡,导致释放出的LPS含量减少,而对于耐酸的HIS产生菌并未产生相同作用。

4 结论

① 高精料底物条件下,添加芦丁能够提高奶牛瘤胃体外发酵液产气量和pH,降低乳酸、VFA和LPS含量,降低甲烷产量以及产甲烷菌和乳酸产生菌数量,其中以添加4.5%芦丁时体外发酵效果较好。
② 高精料底物条件下,添加适宜水平的芦丁能通过抑制乳酸杆菌和牛链球菌这2种乳酸产生菌和LDH、PK这2种乳酸生成关键酶活性,降低乳酸生成,并降低VFA和LPS含量,具有缓解SARA的潜力。

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