Effects of Different Treatment Time and Supplemental Levels of Cellulase on in Vitro Nutrient Degradation Rates and Rumen Fermentation Characteristics of Wheat Straw

LI Yan; HUO Zihan; SHI Chuanzhen; LI Qiufeng; SHEN Yizhao; CAO Yufeng; WANG Mingya; WU Chunhui

doi:10.12418/CJAN2023.228

2023 , Vol. 35 >Issue 4: 2431 - 2442

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2023.228

RESEARCH PAPER

Effects of Different Treatment Time and Supplemental Levels of Cellulase on in Vitro Nutrient Degradation Rates and Rumen Fermentation Characteristics of Wheat Straw

LI Yan ^,¹ ,
HUO Zihan ¹ ,
SHI Chuanzhen ² ,
LI Qiufeng ^,¹^,^* ,
SHEN Yizhao ^,¹^,^* ,
CAO Yufeng ¹ ,
WANG Mingya ¹ ,
WU Chunhui ¹

Expand

¹ College of Animal Science and Technology, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, China
² Yanjing Institute of Technology, Langfang 065201, China

*LI Qiufeng, professor, E-mail: lqf582@126.com;

SHEN Yizhao, associate professor, E-mail: shenyizhao@163.com

Received date: 2022-07-26

Online published: 2023-04-12

Fold

Abstract

This experiment was conducted to study the effects of different treatment time and supplemental level of cellulase on in vitro nutrient degradation rate and rumen fermentation characteristics of wheat straw. A 4×4 two-factor experimental design was used, including four cellulase treatment time (0, 15, 30 and 720 min) and four cellulase supplemental level (5 000, 10 000, 15 000 and 20 000 U/kg), and the nutrient degradation rate and fermentation parameters were determined at different fermentation time (24 and 48 h). The results showed as follows: 1) with the cellulase treatment time increased, the in vitro fermentation dry matter degradation rate (DMD), neutral detergent fiber degradation rate (NDFD), acid detergent fiber degradation rate (ADFD), acid detergent lignin degradation rate (ADLD), hemicellulose degradation rate (HD) and cellulose degradation rate (CD) at 24 and 48 h were significantly increased (P<0.05) except the HD at 24 h. With the cellulase supplemental level increased, the DMD, NDFD, ADFD, HD and CD at 24 h and HD at 48 h were linearly increased (P<0.05), and the ADLD at 24 h and DMD, NDFD, ADFD, ADLD and CD at 48 h were quadratically increased (P<0.05). There were no significant differences DMD, NDFD, ADFD, ADLD and CD between 10 000 and 20 000 U/kg cellulase supplemental level (P>0.05). 2) With the cellulase treatment time increased, the in vitro fermentation ammoniacal nitrogen (NH₃-N) concentration was significantly increased (P<0.05), but the cellulase supplemental level had no significant effect on in vitro fermentation NH₃-N concentration (P>0.05). With the cellulase treatment time increased, the in vitro fermentation total volatile fatty acid (TVFA) concentration at 48 h was significantly increased (P<0.05). 3) The 48 h gas production of 30 min treatment time was significantly higher than that of other treatment time (P<0.05), and the theoretical maximum gas production and gas production rate of 30 and 720 min were significantly higher than those at 0 min (P<0.05). With the cellulase supplemental level increased, the 48 h gas production, theoretical maximum gas production and gas production rate were quadratically increased (P<0.05). In conclusion, when cellulase supplemental level is 10 000 U/kg and treatment time is 30 min, it can improve the in vitro nutrient degradation rate of wheat straw, increase the NH₃-H and VFA concentrations, improve gas production and gas production parameters, and improve in vitro rumen fermentation.

Key words： goats; in vitro gas production; cellulase; degradation rate; rumen fermentation

Cite this article

LI Yan , HUO Zihan , SHI Chuanzhen , LI Qiufeng , SHEN Yizhao , CAO Yufeng , WANG Mingya , WU Chunhui . Effects of Different Treatment Time and Supplemental Levels of Cellulase on in Vitro Nutrient Degradation Rates and Rumen Fermentation Characteristics of Wheat Straw[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2023 , 35(4) : 2431 -2442 . DOI: 10.12418/CJAN2023.228

随着畜牧业的大力发展,饲料资源短缺问题日趋严重,发展节粮型畜牧业已经迫在眉睫。据报道,我国玉米、小麦、水稻等作物秸秆年产量已超过9亿t,但秸秆饲料化不足20%^[1-2]。尽管反刍动物瘤胃微生物可以将秸秆饲料中部分木质纤维素分解,但粪便中纤维等营养物质的存在表明瘤胃消化效率不高^[3]。人们一直在探索与研究能够提高秸秆饲料资源利用率的办法,而酶制剂因其具有特异性高、效率高、对环境污染小等特点备受关注^[4]。纤维素酶是一种高效的生物催化酶,能够将纤维素降解为还原糖^[5]。大量研究报道,添加纤维素酶可降低木质纤维素的聚合度,增大木质纤维素的孔隙,增加消化酶与底物的接触面积,使反刍动物对粗饲料中营养物质的利用更加充分,从而提高消化率及反刍动物的生产性能^[6⇓-8]。通常对纤维素酶更多关注添加水平,而对添加水平和处理时间2个因素的研究较少。因此,本研究利用体外试验,研究不同纤维素酶添加水平和处理时间对小麦秸秆体外营养物质降解率及瘤胃发酵特性的影响,为纤维素酶在秸秆处理上的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

纤维素酶由里氏木霉深层发酵产生(由深圳某生物技术有限公司提供,型号为NSPase EX,活性5 000 U/mL)。小麦秸秆于2021年3月份采集自河北省保定市农大三分场试验基地,品种为河农128,留茬高度为13 cm。采集的小麦秸秆样品经过65 ℃干燥48 h制成风干样,粉碎过1 mm筛,密封保存备用,经测定,小麦秸秆营养成分见表1。

表1 小麦秸秆营养成分(干物质基础)

Table 1 Nutritional composition of wheat straw (DM basis) %

项目Items	含量Content
有机物Organic matter	89.17
中性洗涤纤维Neutral detergent fiber	67.33
酸性洗涤纤维Acid detergent fiber	46.69
酸性洗涤木质素Acid detergent lignin	11.49
纤维素Cellulose	34.58
半纤维素Hemicellulose	21.52

1.2 试验设计

采用4×4双因素试验设计,包括4个纤维素酶处理时间(0、15、30、720 min)和4个纤维素酶添加水平(5 000、10 000、15 000、20 000 U/kg),共16个处理,每个处理6个重复。将纤维素酶按照比例溶于适量蒸馏水,充分搅拌后倒入装有0.5 g小麦秸秆ANKOM F57纤维袋的烧杯中浸泡,按照不同时间放入、同时取出原则将纤维袋取出,24个纤维袋烘干后将小麦秸秆取出测定营养成分,6个纤维袋迅速放入发酵瓶中进行体外产气试验。试验进行2个批次重复。

1.3 瘤胃体外发酵

1.3.1 供试动物及瘤胃液采集

试验选用4头体况良好、体重[(43±2) kg]相近、安装有永久性瘤胃瘘管的试验羊为瘤胃液供体动物,饲粮配方参照NRC(2001)^[9],其组成及营养水平见表2。每天饲喂2次,自由饮水。于试验当天晨饲前采集瘤胃液,采集的瘤胃液经4层纱布过滤至预热好的保温瓶中,迅速带回实验室,置于39 ℃水浴锅中,并通入CO₂,保证厌氧环境。

表2 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)

Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

项目Items	含量Content
原料Ingredients
全贮玉米青贮Whole corn silage	40.20
羊草Chinese wildrye	20.00
干酒糟及其可溶物DDGS	3.79
玉米Corn	20.73
豆粕Soybean meal	4.35
棉籽粕Cottonseed meal	9.34
食盐NaCl	0.48
石粉Limestone	0.53
预混料Premix¹⁾	0.58
合计Total	100.00
营养水平Nutrient levels
代谢能ME/(MJ/kg)²⁾	11.11
粗蛋白质CP	13.83
中性洗涤纤维NDF	37.77
酸性洗涤纤维ADF	19.03
钙Ca	0.61
磷P	0.37

1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kilogram of the diet:VA 4 210 IU,D-生物素 D-biotin 5 mg,VD₃ 750 IU,VE 35 IU,Fe 25 mg,Zn 46 mg,Mn 40 mg,Cu 10 mg,Co 0.36 mg,Se 0.30 mg。

2)代谢能为计算值,其他均为实测值。ME was a calculated value, while the others were measured values.

1.3.2 体外发酵培养

将经纤维素酶处理好的装有小麦秸秆的ANKOM F57纤维袋放置到100 mL发酵瓶中,在39 ℃恒温气浴摇床中进行预热处理。再将按照Menke等^[10]方法配制的厌氧人工瘤胃缓冲液与采集的瘤胃液以2∶1比例混合制成人工瘤胃发酵液。取60 mL人工瘤胃发酵液倒入提前预热好的发酵瓶中,迅速盖上橡胶塞,并用铝制盖压紧。操作时全程使用CO₂保持厌氧环境,操作完成后放置在39 ℃的恒温气浴摇床中进行发酵,转速为125 r/min。使用HT-935专业压差测量仪测量3、6、9、12、24、36、48 h发酵瓶的压力值,每次测量结束排空发酵瓶中气体。每种处理在培养24和48 h时均随机取出3个发酵瓶进行pH测定,冰水浴终止发酵,每瓶发酵液分别取2个15 mL和2个10 mL,用于测定氨态氮(NH₃-N)和挥发性脂肪酸(VFA)浓度。同时将发酵瓶中纤维袋取出,冲洗至冲洗液无色,于烘箱中65 ℃烘48 h至恒重,测定其中干物质(DM)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、酸性洗涤木质素(ADL)含量,然后计算干物质降解率(DMD)、中性洗涤纤维降解率(NDFD)、酸性洗涤纤维降解率(ADFD)、酸性洗涤木质素降解率(ADLD)、纤维素降解率(CD)和半纤维素降解率(HD)。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 常规营养成分的测定

饲料原料以及发酵残渣中的DM、有机物(OM)含量参照AOAC(2000)^[11]的方法测定。按照Van Soest等^[12]方法使用全自动纤维测定仪(A2000i,美国ANKOM公司)测定NDF、ADF、ADL含量,并通过计算得出半纤维素、纤维素含量,计算公式如下:

半纤维素含量=NDF含量-ADF含量;

纤维素含量=ADF含量-ADL含量-粗灰分含量。

1.4.2 体外降解率指标

营养物质体外降解率计算公式如下:

DMD=[(降解前样品重量×降解前样品DM含量-降解后样品重量×降解后样品DM含量)/(降解前样品重量×降解前样品DM含量)]×100;

某营养物质降解率=[(发酵前该营养物质的含量-发酵后该营养物质的含量)/发酵前该营养物质的含量]×100。

1.4.3 体外产气量及产气参数指标

通过空白瓶对测量好的产气量校正,并通过公式计算48 h累计产气量^[13],计算公式如下:

GP=0.18+3.697Pt+0.0824 4Pt²。

式中:GP为t时间总产气量(mL);Pt为t时间压力值(psi)。

根据不同时间点的产气量,利用体外发酵模型对产气动力学参数进行计算^[14],计算公式如下:

GP=B×[1-e^-^c⁽^t^-^Lag⁾]。

式中:GP是指时间t的产气量(mL);B表示理论最大产气量(mL);c表示产气速率常数(mL/h);Lag表示体外发酵产气延滞时间(h);e表示欧拉常数;t表示产气时间(h)。

1.4.4 体外瘤胃发酵指标

使用UB-7型酸度计测定培养液pH;采用冯宗慈等^[15]比色法,用UV-2102 PCS型紫外光可见分光光度计对分装的15 mL离心管中瘤胃液NH₃-N浓度进行测定;参照王加启^[16]的方法,对10 mL离心管中瘤胃液进行预处理,再用7890A型气相色谱仪测定瘤胃液中VFA浓度。

1.5 数据统计与分析

应用SAS 9.2软件PROC MIXED模型进行统计分析。在LSMEANS语句中包含用Tukey方法调整的PIDFF选项,以说明F检验显著处理时间的多重比较。采用contrast语句对纤维素酶添加水平的线性、二次效应进行分析。试验结果以平均值和均值标准误(SEM)表示,P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 不同纤维素酶处理对小麦秸秆体外营养物质降解率的影响

由表3可知,纤维素酶处理时间和添加水平的交互作用对24 h DMD无显著影响(P<0.05),但对48 h DMD有显著影响(P<0.05)。纤维素酶处理时间对24、48 h DMD有显著影响(P<0.05),且处理时间为30、720 min的24、48 h DMD显著高于0 min(P<0.05)。随着纤维素酶添加水平增加,24 h DMD呈线性增加(P<0.05),48 h DMD呈二次增加(P<0.05)。

表3 不同纤维素酶处理时间和添加水平对小麦秸秆体外DMD的影响

Table 3 Effects of different treatment time and supplemental levels of cellulase on in vitro DMD of wheat straw %

项目 Items	处理时间 Treatment time/min	添加水平Supplemental level/(U/kg)					SEM	P值P-value
项目 Items	处理时间 Treatment time/min	0	5 000	10 000	15 000	20 000	SEM	ST.	L.	Q.	TL.	TQ.	Int.
24 h干物质降解率 24 h DMD	0^C	17.55^ab	17.21^ab	17.79^a	15.21^b	18.80^a	0.91	0.01	0.86	0.17	0.01	0.80	0.06
	15^BC	17.55^b	16.83^b	20.05^ab	17.50^b	20.15^a			0.04	0.77
	30^B	17.55^b	17.51^b	20.82^a	18.40^ab	20.22^a			0.03	0.55
	720^A	17.55^b	21.54^a	21.37^a	22.28^a	23.04^a			0.01	0.11
48 h干物质降解率 48 h DMD	0^C	25.24^abc	22.28^c	27.38^a	24.15^c	26.02^ab	1.10	0.01	0.33	0.75	0.01	0.01	0.01
	15^B	25.24^c	30.28^b	33.97^a	30.61^b	32.24^ab			0.01	0.01
	30^AB	25.24^c	28.72^b	34.92^a	33.46^a	32.48^a			0.01	0.01
	720^A	25.24^b	31.71^a	34.08^a	34.21^a	35.37^a			0.01	0.01

同列数据肩标不同大写字母表示差异显著(P<0.05),同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。ST为处理时间的影响;L.和Q.分别为不同处理时间下添加水平的线性和二次效应;TL.和TQ.分别为添加水平的线性和二次效应;Int.为处理时间与添加水平的交互作用。下表同。

In the same column, values with different capital letter superscripts mean significant difference(P<0.05); in the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05); while with the same letter or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). ST was the effect of treatment time; L. and Q. were the linear and quadratic effect of supplemental level under different treatment time, respectively; TL. and TQ. were the linear and quadradic effect of supplemental level, respectively; Int. was the interaction between treatment time and supplemental level. The same as below.

由表4可知,纤维素酶处理时间和添加水平的交互作用对24 h NDFD无显著影响(P>0.05),但对48 h NDFD有显著影响(P<0.05)。纤维素酶处理时间对24、48 h NDFD有显著影响(P<0.05),且处理时间为15、30和720 min的24、48 h NDFD显著高于0 min(P<0.05)。随着纤维素酶添加水平增加,24 h NDFD呈线性增加(P<0.05),48 h NDFD呈二次增加(P<0.05)。

表4 不同纤维素酶处理时间和添加水平对小麦秸秆体外NDFD的影响

Table 4 Effects of different treatment time and supplemental levels of cellulase on in vitro NDFD of wheat straw %

项目 Items	处理时间 Treatment time/min	添加水平Supplemental level/(U/kg)					SEM	P值P-value
项目 Items	处理时间 Treatment time/min	0	5 000	10 000	15 000	20 000	SEM	ST.	L.	Q.	TL.	TQ.	Int.
24 h中性洗涤纤维降解率 24 h NDFD	0^B	14.11	15.42	15.07	15.55	15.82	0.99	0.01	0.26	0.73	0.01	0.15	0.45
	15^A	14.11^c	15.20^b	17.35^ab	17.08^ab	19.60^a			0.01	0.91
	30^A	14.11^b	15.07^b	18.35^a	18.32^a	18.25^a			0.01	0.15
	720^A	14.11^b	17.80^a	17.68^a	18.83^a	19.61^a			0.01	0.22
48 h中性洗涤纤维降解率 48 h NDFD	0^C	23.65^C	24.06^b	25.12^abc	27.29^ab	28.30^a	1.32	0.01	0.01	0.59	0.01	0.01	0.02
	15^B	23.65^c	26.64^b	29.55^b	29.65^b	33.06^a			0.01	0.65
	30^B	23.65^c	27.59^b	33.31^a	30.90^a	33.58^a			0.01	0.02
	720^A	23.65^b	31.98^a	33.79^a	34.51^a	33.34^a			0.01	0.01

由表5可知,纤维素酶处理时间和添加水平的交互作用对体外发酵24 h ADFD有显著影响(P<0.05),但对体外发酵48 h ADFD无显著影响(P>0.05)。纤维素酶处理时间对24、48 h ADFD有显著影响(P<0.05),且处理时间为30和720 min的24、48 h ADFD显著高于0 min(P<0.05)。随着纤维素酶添加水平增加,24 h ADFD呈线性增加(P<0.05),48 h ADFD呈二次增加(P<0.05)。

表5 不同纤维素酶处理时间和添加水平对小麦秸秆体外ADFD的影响

Table 5 Effects of different treatment time and supplemental levels of cellulase on in vitro ADFD of wheat straw %

项目 Items	处理时间 Treatment time/min	添加水平Supplemental level/(U/kg)					SEM	P值P-value
项目 Items	处理时间 Treatment time/min	0	5 000	10 000	15 000	20 000	SEM	ST.	L.	Q.	TL.	TQ.	Int.
24 h酸性洗涤纤维降解率 24 h ADFD	0^B	15.58	15.61	15.28	15.56	16.85	1.16	0.01	0.50	0.48	0.01	0.13	0.01
	15^A	15.58^c	17.93^bc	19.80^b	15.54^c	21.43^a			0.02	0.83
	30^A	15.58^bc	15.44^c	20.71^a	18.87^b	17.79^c			0.04	0.04
	720^A	15.58^b	20.77^a	17.57^ab	18.71^ab	17.44^b			0.65	0.05
48 h酸性洗涤纤维降解率 48 h ADFD	0^C	24.30^b	24.21^b	27.51^a	28.96^a	30.38^a	1.27	0.01	0.01	0.78	0.01	0.01	0.07
	15^B	24.30^c	28.76^b	31.03^ab	31.21^ab	33.23^a			0.01	0.10
	30^AB	24.30^c	28.80^b	34.24^a	32.05^a	35.05^a			0.01	0.02
	720^A	24.30^c	32.82^ab	31.80^b	33.44^ab	35.08^a			0.01	0.01

由表6可知,纤维素酶处理时间和添加水平的交互作用对24、48 h ADLD均有显著影响(P<0.05)。纤维素酶处理时间对24、48 h ADLD有显著影响(P<0.05),且处理时间为30和720 min的24、48 h ADLD显著高于0 min(P<0.05)。随着纤维素酶添加水平增加,24、48 h ADLD呈二次增加(P<0.05)。

表6 不同纤维素酶处理时间和添加水平对小麦秸秆体外ADLD的影响

Table 6 Effects of different treatment time and supplemental levels of cellulase on in vitro ADLD of wheat straw %

项目 Items	处理时间 Treatment time/min	添加水平Supplemental level/(U/kg)					SEM	P值P-value
项目 Items	处理时间 Treatment time/min	0	5 000	10 000	15 000	20 000	SEM	ST.	L.	Q.	TL.	TQ.	Int.
24 h酸性洗涤木质素降解率 24 h ADLD	0^C	8.49^b	8.61^b	16.43^a	8.25^b	9.11^b	1.43	0.04	0.85	0.01	0.04	0.01	0.01
	15^BC	8.49	11.18	12.27	8.88	10.71			0.64	0.25
	30^A	8.49^b	11.73^b	14.37^a	10.94^b	14.50^a			0.15	0.38
	720^AB	8.49^b	12.23^ab	12.56^ab	14.09^a	12.17^ab			0.05	0.07
48 h酸性洗涤木质素降解率 48 h ADLD	0^C	16.23^b	18.21^b	22.93^a	16.96^b	16.05^b	1.34	0.01	0.70	0.01	0.01	0.01	0.01
	15^C	16.23^b	19.10^ab	19.00^ab	19.21^ab	20.18^a			0.07	0.49
	30^B	16.23^b	17.94^b	23.91^a	24.25^a	24.92^a			0.01	0.13
	720^A	16.23^b	26.16^a	23.59^a	25.10^a	26.75^a			0.01	0.02

由表7可知,纤维素酶处理时间和添加水平的交互作用对24、48 h HD均无显著影响(P>0.05)。纤维素酶处理时间对24 h HD无显著影响(P>0.05),对48 h HD有显著影响(P<0.05),且处理时间为30和720 min的48 h HD显著高于0 min(P<0.05)。随着纤维素酶添加水平增加,24、48 h HD呈线性增加(P<0.05)。

表7 不同纤维素酶处理时间和添加水平对小麦秸秆体外HD的影响

Table 7 Effects of different treatment time and supplemental levels of cellulase on in vitro HD of wheat straw %

项目 Items	处理时间 Treatment time/min	添加水平Supplemental level/(U/kg)					SEM	P值P-value
项目 Items	处理时间 Treatment time/min	0	5 000	10 000	15 000	20 000	SEM	ST.	L.	Q.	TL.	TQ.	Int.
24 h半纤维素降解率 24 h HD	0	8.92	10.86	12.80	13.08	11.14	1.65	0.62	0.20	0.13	0.01	0.60	0.34
	15	8.92^c	8.23^c	11.03^bc	17.24^a	14.08^ab			0.01	0.80
	30	8.92^c	11.34^bc	11.71^bc	15.01^ab	16.40^a			0.01	0.89
	720	8.92^b	9.66^b	12.20^ab	11.74^ab	15.84^a			0.01	0.54
48 h半纤维素降解率 48 h HD	0^B	20.20	21.50	18.29	22.15	22.14	3.11	0.02	0.64	0.70	0.01	0.16	0.38
	15^AB	20.20^b	20.35^b	24.74^ab	24.94^ab	30.75^a			0.01	0.54
	30^A	20.20^b	22.84^ab	29.65^a	26.99^ab	28.92^ab			0.03	0.35
	720^A	20.20^b	26.48^ab	32.75^a	30.48^a	24.20^ab			0.22	0.01

由表8可知,纤维素酶处理时间和添加水平的交互作用对24、48 h CD均无显著影响(P>0.05)。纤维素酶处理时间对24、48 h CD有显著影响(P<0.05),且处理时间为30和720 min的24、48 h CD显著高于0 min(P<0.05)。随着纤维素酶添加水平增加,24、48 h CD呈线性增加(P<0.05)。

表8 不同纤维素酶处理时间和添加水平对小麦秸秆体外CD的影响

Table 8 Effects of different treatment time and supplemental levels of cellulase on in vitro CD of wheat straw %

项目 Items	处理时间 Treatment time/min	添加水平Supplemental level/(U/kg)					SEM	P值P-value
项目 Items	处理时间 Treatment time/min	0	50	100	150	200	SEM	ST.	L.	Q.	TL.	TQ.	Int.
24 h纤维素降解率 24 h CD	0^C	20.26	18.83	19.74	20.01	21.65	1.60	0.01	0.44	0.36	0.01	0.38	0.07
	15^BC	20.26^b	19.13^b	25.56^a	23.43^ab	21.11^ab			0.24	0.08
	30^AB	20.26^bc	21.89^abc	24.31^b	19.60^c	26.44^a			0.05	0.59
	720^A	20.26^b	26.08^a	23.45^ab	25.98^a	24.94^a			0.08	0.16
48 h纤维素降解率 48 h CD	0^C	29.15^bc	28.30^c	33.36^ab	34.82^a	37.21^a	1.81	0.01	0.01	0.64	0.01	0.05	0.36
	15^B	29.15^b	33.24^ab	36.47^a	36.63^a	39.69^a			0.01	0.40
	30^AB	29.15^c	34.23^b	39.24^a	36.26^ab	39.77^a			0.01	0.08
	720^A	29.15^b	38.35^a	38.07^a	41.08^a	42.40^a			0.01	0.05

2.2 不同纤维素酶处理对体外发酵指标的影响

由表9可知,纤维素酶处理时间和添加水平的交互作用对24 h pH有显著影响(P<0.05),但对48 h pH无显著影响(P>0.05)。纤维素酶处理时间对24、48 h pH有显著影响(P<0.05),且处理时间为30 min的24、48 h pH显著低于0、15 min(P<0.05)。随着纤维素酶添加水平增加,24 h pH呈线性降低(P<0.05)。

表9 不同纤维素酶处理时间和添加水平对小麦秸秆体外pH的影响

Table 9 Effects of different treatment time and supplemental levels of cellulase on in vitro pH of wheat straw

项目 Items	处理时间 Treatment time/min	添加水平Supplemental level/(U/kg)					SEM	P值P-value
项目 Items	处理时间 Treatment time/min	0	5 000	10 000	15 000	20 000	SEM	ST.	L.	Q.	TL.	TQ.	Int.
24 h pH	0^A	6.72	6.72	6.72	6.70	6.72	0.01	0.01	0.50	0.85	0.01	0.18	0.03
	15^B	6.72^a	6.72^a	6.69^b	6.70^ab	6.69^b			0.01	0.63
	30^C	6.72^a	6.67^bc	6.67^bc	6.68^b	6.65^c			0.01	0.13
	720^AB	6.72^a	6.72^a	6.71^ab	6.68^b	6.71^ab			0.06	0.39
48 h pH	0^A	6.70^ab	6.72^a	6.69^ab	6.68^b	6.70^ab	0.01	0.03	0.39	0.69	0.07	0.24	0.14
	15^A	6.70	6.70	6.72	6.70	6.70			0.70	0.33
	30^B	6.70^ab	6.68^abc	6.65^c	6.68^b	6.71^a			0.77	0.01
	720^AB	6.70	6.71	6.69	6.68	6.68			0.03	0.69

由表10可知,纤维素酶处理时间和添加水平的交互作用对24、48 h NH₃-N浓度无显著影响(P>0.05)。纤维素酶处理时间对24、48 h NH₃-N浓度有显著影响(P<0.05),处理时间为30和720 min的24 h NH₃-N浓度显著高于0和15 min(P>0.05),处理时间为720 min的48 h NH₃-N浓度显著高于0、15和30 min(P>0.05)。随着纤维素酶添加水平增加,纤维素酶处理时间为30 min时,体外发酵24 h NH₃-N浓度呈二次增加(P<0.05)。

表10 不同纤维素酶处理时间和添加水平对小麦秸秆体外NH₃-N浓度的影响

Table 10 Effects of different treatment time and supplemental levels of cellulase on in vitro NH₃-N concentration of wheat straw mg/dL

项目 Items	处理时间 Treatment time/min	添加水平Supplemental level/(U/kg)					SEM	P值P-value
项目 Items	处理时间 Treatment time/min	0	5 000	10 000	15 000	20 000	SEM	ST.	L.	Q.	TL.	TQ.	Int.
24 h氨态氮 24 h NH₃-N	0^BC	18.34	18.72	17.20	17.32	18.40	1.07	0.02	0.71	0.45	0.99	0.51	0.21
	15^C	18.34	16.50	18.15	17.45	18.72			0.61	0.34
	30^A	18.34^b	20.61^ab	22.07^a	17.83^b	17.83^b			0.26	0.01
	720^A	18.34	20.30	19.41	19.86	20.17			0.34	0.62
48 h氨态氮 48 h NH₃-N	0^B	24.28	21.19	22.64	23.02	23.97	1.31	0.01	0.77	0.15	0.28	0.09	0.08
	15^B	24.28	23.97	23.72	24.35	21.69			0.25	0.43
	30^B	24.28	19.86	22.77	24.92	22.64			0.66	0.47
	720^A	24.28	25.23	22.77	26.06	29.22			0.01	0.04

由表11可知,纤维素酶处理时间和添加水平的交互作用对体外发酵24、48 h TVFA均无显著影响(P>0.05)。纤维素酶处理时间对48 h TVFA浓度有显著影响(P<0.05),处理时间为30和720 min的48 h TVFA浓度显著高于0 min(P>0.05)。随着纤维素酶添加水平增加,24、48 h TVFA呈二次增加(P<0.05)。纤维素酶处理时间和添加水平对24、48 h乙酸/丙酸无显著影响(P>0.05)。

表11 不同纤维素酶处理时间和添加水平对小麦秸秆体外TVFA浓度及乙酸/丙酸的影响

Table 11 Effects of different treatment time and supplemental levels of cellulase on in vitro TVFA concentration and A/P of wheat straw

项目 Items	处理时间 Treatment time/min	添加水平Supplemental level/(U/kg)					SEM	P值P-value
项目 Items	处理时间 Treatment time/min	0	5 000	10 000	15 000	20 000	SEM	ST.	L.	Q.	TL.	TQ.	Int.
24 h总挥发性脂肪酸 24 h TVFA/ (mmoL/L)	0	40.95	42.94	43.29	43.49	43.79	2.12	0.25	0.36	0.66	0.01	0.03	1.00
	15	40.95	44.87	45.77	45.63	44.67			0.23	0.18
	30	40.95^b	45.08^ab	47.34^a	47.16^a	47.13^a			0.04	0.18
	720	40.95^b	43.73^ab	47.07^a	46.94^ab	45.80^ab			0.06	0.16
48 h总挥发性脂肪酸 48 h TVFA/ (mmoL/L)	0^B	52.45	53.04	53.44	54.09	53.81	1.85	0.04	0.47	0.81	0.01	0.03	0.99
	15^AB	52.45	55.00	55.84	55.46	54.28			0.43	0.17
	30^A	52.45^b	55.50^ab	57.49^a	57.61^a	57.16^a			0.03	0.16
	720^A	52.45	56.35	57.04	56.89	56.74			0.09	0.15
24 h乙酸/丙酸 24 h A/P	0	2.76	2.73	2.50	2.59	2.59	0.15	0.61	0.32	0.50	0.53	0.22	1.00
	15	2.76	2.77	2.60	2.61	2.81			0.90	0.33
	30	2.76	2.73	2.75	2.71	2.86			0.69	0.58
	720	2.76	2.71	2.64	2.68	2.65			0.60	0.79
48 h乙酸/丙酸 48 h A/P	0	3.16	2.93	2.79	2.97	2.88	0.26	0.78	0.53	0.55	0.40	0.49	1.00
	15	3.16	3.04	2.89	3.02	3.02			0.73	0.59
	30	3.16	3.18	3.06	3.05	3.08			0.73	0.90
	720	3.16	3.10	3.07	3.04	3.03			0.70	0.92

2.3 不同纤维素酶处理时间和添加水平对小麦秸秆体产气参数的影响

由表12可知,纤维素酶处理时间和添加水平的交互作用对48 h产气量有显著影响(P<0.05),对理论最大产气量、产气速率无显著影响(P>0.05)。纤维素酶处理时间对48 h产气量、理论最大产气量、产气速率有显著影响(P<0.05),处理时间为30 min的48 h产气量显著高于其他处理时间(P<0.05),处理时间为15、30和720 min的理论最大产气量显著高于0 min(P<0.05),处理时间为30和720 min的产气速率显著高于0 min(P<0.05)。随着纤维素酶添加水平的增加,48 h产气量、理论最大产气量、产气速率呈二次增加(P<0.05)。

表12 不同纤维素酶处理时间和添加水平对小麦秸秆体外产气参数的影响

Table 12 Effects of different treatment time and supplemental levels of cellulase on in vitro gas production parameters of wheat straw

项目 Items	处理时间 Treatment time/min	添加水平Supplemental level/(U/kg)					SEM	P值P-value
项目 Items	处理时间 Treatment time/min	0	5 000	10 000	15 000	20 000	SEM	ST.	L.	Q.	TL.	TQ.	Int.
48 h产气量 48 h gas production/mL	0^B	40.53^d	44.70^d	58.77^c	72.58^b	81.17^a	1.93	0.01	0.01	0.15	0.01	0.01	0.01
	15^D	40.53^c	38.33^c	45.45^b	48.61^ab	51.96^a			0.01	0.23
	30^A	40.53^d	59.51^c	87.83^a	78.10^b	42.63^d			0.01	0.01
	720^C	40.53^d	46.33^c	54.24^b	56.11^b	71.25^a			0.01	0.05
B/mL	0^B	50.56^b	52.06^ab	54.93^ab	61.54^a	60.94^a	2.85	0.01	0.01	0.96	0.01	0.01	0.12
	15^A	50.56^b	63.85^a	65.01^a	68.39^a	65.90^a			0.01	0.01
	30^A	50.56^b	56.49^b	70.55^a	67.05^a	65.79^a			0.01	0.01
	720^A	50.56^b	64.78^a	71.18^a	68.18^a	71.59^a			0.01	0.01
c/(mL/h)	0^C	0.92	0.94	1.03	0.97	1.02	0.05	0.01	0.14	0.59	0.01	0.01	0.11
	15^B	0.92^c	1.04^b	1.16^ab	1.13^ab	1.22^a			0.01	0.24
	30^AB	0.92^c	1.04^c	1.33^a	1.17^bc	1.25^ab			0.01	0.01
	720^A	0.92^c	1.10^b	1.33^a	1.23^ab	1.27^a			0.01	0.01

	B为理论产气量,c为产气速率。
	B was the theoretical gas production, and c was the gas production rate.

3 讨论

3.1 不同纤维素酶处理时间和添加水平对小麦秸秆体外营养物质降解率的影响

体外DMD代表饲料被动物消化利用的难易程度,与纤维含量及木质化程度密切相关^[17]。本试验中,随纤维素酶处理时间增加,体外发酵24和48 h DMD增加,但处理时间30 和720 min之间体外发酵48 h DMD差异不显著。体外发酵前使用纤维素酶处理小麦秸秆,纤维素酶吸附到木质纤维素底物上,破坏了植物细胞壁,增大了小麦秸秆的比表面积^[18],降低了瘤胃内蛋白酶对纤维素酶的降解效率^[19],提高了纤维素酶对饲粮中纤维素的降解效率,增加了瘤胃内其他酶对饲料的可及性,从而促进了体外DMD^[6]。Arif等^[20]饲喂前使用纤维素酶处理燕麦青贮发现,处理时间足够长,可以显著提高泌乳牛DMD,与本试验研究结果基本一致。赵丽媛等^[21]研究发现,不同酶处理时间对玉米秸秆的作用效果不同,处理时间达到24 h时可明显改变玉米秸秆的理化特性,促进其在动物体内降解利用,与本试验结果不一致,可能是由于纤维素酶在不同底物中反应不同^[22],小麦秸秆为底物时处理时间达到30 min便可使纤维素酶作用效果达到最佳。本试验中,随着纤维素酶添加水平的增加,体外发酵DMD显著增加,且体外发酵24 h DMD呈线性增加,体外发酵48 h DMD呈二次增加,添加水平为10 000 U/kg时效果最佳。Yang等^[23]研究外源纤维素酶处理蚕豆青贮对瘤胃发酵影响,发现添加纤维素酶可显著提高体外DMD,但中等添加水平纤维素酶时体外DMD最高,再增加纤维素酶添加水平时体外DMD反而有所下降,与本研究结果一致。本试验发现,使用纤维素酶处理小麦秸秆时间为30 min,添加水平为10 000 U/kg时体外DMD最好,再增加或减小纤维素酶处理时间以及添加水平对体外DMD无显著影响。

体外NDFD、ADFD、ADLD、CD、HD是评价饲料消化率的重要指标,主要与纤维素、半纤维素、ADL的可消化程度有关^[24]。NDF与ADF组成不同,NDF是由纤维素和ADL组成,ADF是由纤维素、半纤维素和ADL组成,因此当纤维素、半纤维素和ADL发生改变时,NDF与ADF含量也将发生变化。本研究中CD、HD、ADLD、NDFD、ADFD与DMD趋势基本相同,均随着纤维素酶处理时间的增长体外发酵24和48 h的CD、HD、ADLD、NDFD、ADFD增加,但处理时间30和720 min之间体外发酵48 h CD、HD、ADFD均不显著。纤维素酶发生最佳作用效果需要足够的时间,通过酶与底物一段时间的反应,小麦秸秆木质纤维素结构松散,增加了瘤胃内消化酶对小麦秸秆的消化效率^[8],促进体外发酵CD、HD、ADLD,从而提高了NDFD、ADFD,与Kong等^[25]研究结果一致。本研究中,随着纤维素酶添加水平的增加,体外发酵24和48 h的CD、HD、ADLD、NDFD、ADFD呈线性或二次增加,这与DMD趋势基本相同。Phakachoed等^[26]在玉米青贮中加入不同添加水平纤维素酶,通过增加体外CD、HD、ADLD来增加体外NDFD、ADFD,且NDFD、ADFD通常是线性或二次增加,与本研究结果一致。通过体外发酵试验得出,使用纤维素酶处理小麦秸秆时间为30 min,添加水平为10 000 U/kg时,体外发酵CD、HD、ADLD、NDFD、ADFD最好,再增加或降低纤维素酶处理时间以及添加水平对降解率无显著影响。

3.2 不同纤维素酶处理时间和添加水平对小麦秸秆体外发酵指标的影响

瘤胃液pH是反映瘤胃发酵状况的重要指标,受饲料类型、微生物区系和瘤胃有机酸代谢影响,其中影响体外培养pH的主要因素是VFA和

N H 3 - N [27]

。正常瘤胃发酵状态下,反刍动物的瘤胃液pH为6.0~7.0^[28]。本试验pH为6.65~6.72,这与Depeters等^[29]研究结果基本一致,且各组间pH变化不大,可能是在进行体外发酵时缓冲溶液的缓冲作用维持了发酵液的pH^[30]。NH₃-N是微生物合成菌体蛋白的主要原料,NH₃-N浓度反映了饲料在发酵过程中含氮物质的分解与利用的动态平衡情况^[31]。适宜纤维素酶添加水平和处理时间显著提高了小麦秸秆的降解速率,增加了发酵底物,促进瘤胃微生物的增殖,使NH₃-N生成速率加快,进而使NH₃-N浓度升高^[23]。本试验中,当使用纤维素酶处理小麦秸秆时间为30 min,添加水平10 000 U/kg时,体外发酵24 h的NH₃-N浓度最高,为22.07 mg/dL;处理时间为720 min的体外发酵48 h的NH₃-N浓度显著高于30 min,可能是在此条件下,微生物数量和活性最高,促使菌体蛋白合成速度加快,导致处理时间为30 min的NH₃-N浓度低于720 min^[32]。瘤胃VFA主要受饲粮组分影响,同时也是评价瘤胃发酵能力和方式的重要指标。本试验中,添加纤维素酶可以提高TVFA浓度,在使用纤维素酶处理小麦秸秆时间为30 min,添加水平10 000 U/kg时,体外发酵TVFA浓度最高。体外发酵24和48 h各组间乙酸/丙酸均无显著差异。Lamid等^[33]在使用不同水平纤维素酶处理稻草,纤维可降解比例增大,从而提高了泌乳牛瘤胃内TVFA浓度,这与本试验结果相同。

3.3 不同纤维素酶处理时间和添加水平对小麦秸秆体外产气参数的影响

产气量是衡量厌氧微生物利用底物中营养成分的发酵动态,可以通过产气量的变化来估测底物的消化水平和速率^[34]。本试验结果表明,48 h产气量、理论最大产气量、产气速率与DMD、NDFD、ADFD趋势基本相同,添加纤维素酶可以提高48 h产气量、理论最大产气量、产气速率,且当使用纤维素酶处理小麦秸秆时间为30 min,添加水平10 000 U/kg时,体外发酵48 h产气量、理论最大产气量、产气速率最高,再增加处理时间和添加水平对其影响不大。马君军^[35]利用体外产气法研究肉牛4种饲料的发酵特性和产气特性得出,体外产气量与DMD呈显著正相关,与本试验结相符。崔占鸿等^[36]通过使用不同牧草的组合进行体外发酵试验,发现48 h产气量、理论最大产气量、产气速率与NDF、ADF呈显著负相关关系,纤维素酶适宜添加水平和适宜处理时间可以降低NDF、ADF含量,提高NDFD、ADFD,提高48 h产气量、理论最大产气量、产气速率,与本研究结果一致。

4 结论

① 添加纤维素酶可以提高小麦秸秆的体外营养物质降解率,提高NH₃-H和TVFA浓度,同时提高产气量以及产气参数,改善体外瘤胃发酵。

② 在本试验条件下,在使用纤维素酶处理小麦秸秆时,推荐处理时间为30 min,添加水平为10 000 U/kg。

References

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