细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是由细胞分泌到细胞外的脂质结合囊泡。根据生物发生、释放途径、大小、含量和功能,EVs分为3种亚型,包括微泡、外泌体和凋亡小体,近来还发现了肿瘤细胞所分泌的细胞外囊泡新种类——肿瘤小泡,其拥有最大的直径[1]。其中,外泌体是天然的纳米颗粒,它可以参与细胞间的通讯,从中发挥重要的作用[2]。外泌体与靶细胞的通讯过程有3种方式:1)外泌体膜蛋白可以与靶细胞膜蛋白结合,进而激活靶细胞内的信号通路;2)在细胞外基质中,外泌体膜蛋白可以被蛋白酶剪切,剪切后的碎片可以作为配体与细胞膜上的受体结合,从而激活细胞内的信号通路;3)外泌体膜可以与靶细胞膜直接融合,非选择性的释放其所含的蛋白质、mRNA以及miRNA等,其中第3种方式最为常见,并且也是目前研究外泌体与靶细胞之间作用的重点所在[3]。
外泌体存在于各种体液中,包括羊水、血清、淋巴液、腹水和乳汁等,不同体液中的外泌体即使作用类似,发挥作用的机制也可能存在很大的差别[4],现有的关于畜牧养殖方面的研究主要集中于母乳及乳制品中的外泌体对动物生长发育及免疫调控方面。目前,已成功从牛初乳[5]、猪乳[6]、大鼠乳[7]、山羊乳[8]中分离获得外泌体,乳源外泌体被认为是介导母子之间通信的重要途径。越来越多的证据表明,乳源外泌体可以被哺乳动物肠道和免疫细胞吸收,从而促进幼畜生长发育以及为幼畜提供免疫保护[9]。然而,乳源外泌体也有可能在机体中产生不良反应,或是阻碍相关的生理生化过程,从而引发疾病等[10]。本文根据现有的文献,总结了乳源外泌体在营养调控及免疫方面中的作用,以期为相关研究提供参考。
1 乳源外泌体组成成分及作用
乳汁是由雌性哺乳动物产生的营养丰富的液体,它能够满足幼畜对营养的需求,是幼畜饮食的重要组成部分。母乳不仅能提供营养,还有协助完善幼畜肠道免疫系统等功能。其功能的多样性源自于乳汁中丰富的组成成分,有蛋白质、乳糖、脂肪、维生素、矿物质等多种营养素,此外,乳汁中还含有多种生物活性化合物,如乳脂球、生长因子、细胞因子和抗菌肽等,这些化合物具有预防感染、肥胖、糖尿病和癌症等疾病的作用[11]。乳源外泌体是近年来在乳汁中新发现的活性成分,其具有膜状囊泡结构,能够携带多种营养物质及信息调控分子,从而发挥特定的生物学作用。
乳源外泌体中含有的第1种重要成分是蛋白质,研究发现,乳源外泌体中的蛋白质不仅含量丰富,而且种类繁多,其中乳脂球膜蛋白(嗜丁酸、黄嘌呤氧化酶、嗜脂肪蛋白和乳黏蛋白)是乳源外泌体中发现的含量最丰富的蛋白质[12]。研究者使用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)蛋白质组学方法分析了人和牛初乳与成熟乳样品中的乳源外泌体,共鉴定并定量了920种乳源外泌体蛋白,其中,发现575种差异表达的人和牛初乳与成熟乳的外泌体蛋白;使用多变量分析、基因本体注释和相关通路数据库来分析差异表达的蛋白质,其中涉及的主要生物学过程有:对刺激的反应(22%)、定位(16%)、与细胞组织成分联系(31%)和参与细胞内活动(31%)。这些乳源外泌体蛋白参与了好几种含有核糖体的相关通路、肌动蛋白细胞骨架调控、糖酵解/糖异生、白细胞跨内皮迁移、氨酰基-tRNA生物合成、磷酸戊糖通路、半乳糖代谢和脂肪酸生物合成等[13]。这些结果为深入了解人和牛乳中外泌体提供了重要信息,同时这些外泌体在不同泌乳阶段的蛋白质组学知识也为研究外泌体蛋白的生物学功能提供了靶点。目前最新的试验结果表明,外泌体中的蛋白质在激活免疫功能方面起着不可或缺的作用。研究证实,初乳源外泌体蛋白质组中存在的一系列蛋白质在细胞生长和修复,以及针对病原体感染的先天免疫反应中具有重要作用;富集分析同样也证明来自牛初乳样品的外泌体显著富含与先天免疫反应相关的蛋白质,其中参与最重要的全身综合急性期反应的蛋白质在初乳样品中的含量更是高度上调;此外,初乳中存在的各种蛋白质还能够调节婴儿胃肠道内的细胞增殖反应,以及血细胞发育等,说明乳源外泌体所含有的丰富的蛋白质不仅参与免疫调节,还参与婴儿的生长、发育和修复等[14]。
乳源外泌体中的另一个主要内容物——核酸,包括DNA、miRNA、mRNA、lncRNA等,是目前外泌体研究领域的一大热点。Chen等[19]通过RNA测序分析,鉴定出猪乳源外泌体中16 304个mRNA,分析结果显示,外泌体中大部分mRNA参与了免疫、增殖和细胞信号传导等生理过程,与仔猪生长发育和健康密切相关,所以外泌体内包含的核酸在调节生理代谢过程中发挥的作用引起了广泛的关注。近年来大量的研究证据表明,miRNA是外泌体最主要的效应核酸之一,其含量占乳源外泌体中的各种RNA的80%左右[20]。miRNA是保守的、非编码的单链RNA分子,其由20个核苷酸形成[21]。成熟miRNA的产生是一个复杂的过程,涉及到各类的蛋白质催化剂等。首先要在核内生成较长的初级转录本,随后在核内Drosha酶的作用下形成发夹状结构的RNA,即前体miRNA,前体miRNA通过核输出蛋白5转运到细胞质中,由Dicer(RNase Ⅲ型内切酶)剪切成为成熟的miRNA[22];然后被细胞以外泌体形式分泌,在递送到靶细胞后,miRNA可以通过调节靶基因的翻译来实现对靶细胞功能的调控[23]。多个研究均证实了牛乳源性的外泌体是运输功能性miRNA的理想载体[24-25]。运输到靶细胞中的miRNA能够参与包括炎症反应在内的多种生理过程的调控。研究证实,通过蛋白酶增强相应miRNA的转录,上调其在单核细胞中的表达,对于单核细胞的活化和炎症介质的表达产生了显著的抑制作用,并且这种抑制作用能够被miRNA抑制剂逆转[26]。这些乳源外泌体中含量丰富的miRNA对于细胞的增殖以及蛋白质的表达也同样具有重要的调节作用[27]。这些重要的生物学效应,使得乳源外泌体中的miRNA成为近年来研究中的重点。
2 乳源外泌体在营养调控和免疫功能调节方面的作用
目前,外泌体在各种疾病(如急性肺损伤、肿瘤疾病、癌症等)方面的研究已经非常广泛,但其在动物生长发育调控方面的作用研究较少,现有研究主要集中于母乳及乳制品中的外泌体对动物生长及免疫系统发育的调控方面。2007年,Admyre等[28]在人类母乳中发现了外泌体。从那时起,对乳源外泌体及其所包含的miRNA的研究引起了一些学者的关注。因为外泌体主要是通过所携带的活性物质在机体内发挥作用,而其中的miRNA与机体代谢和免疫联系最为紧密,所以,对于外泌体在营养和免疫调控方面作用的研究,一定程度上都围绕着它所含有的miRNA展开。事实上,哺乳动物乳汁中的外泌体,包括人类、牛、猪、绵羊和大鼠等,都含有丰富的miRNA[29]。研究证实,不同物种的乳源外泌体,其所含有的miRNA在进入各种动物体内后,分布广泛,包括肠道、大脑、脾脏等组织器官。商业奶制品在被消费者食用后,其所含有的外泌体能够通过肠道上皮细胞和血管内皮细胞被机体吸收,从而进入循环系统,分散到多个组织细胞当中,这是由于外泌体特殊的膜结构,能够保护外泌体内所含有的如miRNA等物质不受各类消化酶和酸性环境的降解,从而增加其生物稳定性,使其完整抵达相应的靶细胞,发挥其信号分子的作用,调节受体细胞的生理活动[30-31]。
2.1 乳源外泌体在营养调控方面的作用
母乳是幼畜营养的最主要来源,其中除了大量的营养成分以外,还包含了外泌体在内的多种生物活性成分。Xie等[32]研究发现,猪乳源外泌体能够保护肠道免受玉米、大麦等谷物饲料中含有的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)的影响,这些外泌体不仅能够逆转DON对细胞增殖的抑制作用,还能够减弱DON诱导的细胞凋亡,从而减弱DON对肠上皮细胞的损害以及对体重的影响。Wu等[33]的研究结果表明,通过乳源外泌体装载胰岛素进行口服,具有比其他给药方式更加优秀和持久的治疗效果,药物稳定性良好,说明了乳源外泌体能够提高肠道内的药品的生物利用率,从而参与血糖等营养组分的调控。Maghraby等[34]的研究发现,在持续低蛋白质饮食喂养的情况下,使用乳源外泌体治疗的小鼠与对照组小鼠相比,肠道通透性、肠道结构和细胞增殖都得到了显著改善,提示乳源外泌体对于由于营养不良而引起的病症的治疗具有一定的功效。乳源外泌体可以通过定向作用于肠道内相关的蛋白激酶与核苷酸转移酶,从而增强幼畜的消化道屏障的功能,减轻炎症及溃疡等的产生,发挥对溃疡性结肠炎等疾病的治疗作用和抗炎作用[35-36]。除了炎症调节作用以外,乳源外泌体还能够作用于应激引起的肠道内损伤。Gao等[37]研究发现,在缺氧条件下,含有相应功能的miRNA的乳源外泌体可以显著降低缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)及其下游的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在肠上皮细胞-6(intestinal epithelial cells-6,IEC-6)中的表达,进而减轻缺氧对肠道的损伤,从而发挥对肠道消化、吸收功能的促进作用。这提示我们,摄入乳源外泌体可以通过保护肠道细胞、提高肠道细胞活力,从而间接发挥营养调控作用。但乳源外泌体中的某些成分在营养调控方面表现出一定的消极作用。研究表明,乳源外泌体会增加胎儿巨大儿的发病几率,这是因为外泌体中含有的miRNA-21可以激发雷帕霉素靶蛋白复合物1(mechanistic target of rapamycin complex 1,mTORC1)信号通路,不仅可以增快胎盘向胎儿的营养物质传递,并且还能促进滋养层中葡萄糖及支链氨基酸等的合成,从而引起胎儿的过度营养合成和快速生长。而且,miRNA-21与miRNA-143呈现此消彼长的关系,从而促进巨大儿的发生。研究发现,相比于对照胎盘,在巨大儿胎盘中,miRNA-21的表达水平升高,而miRNA-143的表达水平显著降低,生物信息学的分析表明,它们可能在丝裂原活化的蛋白激酶通路中发挥作用,从而影响巨大儿的发生[38-39]。另外,乳源外泌体还可以促进脂肪细胞的增殖、分化,引起脂肪的堆积。外泌体中的miRNA-148a可抑制Wnt基因家族因子Wntl和Wnt10b的表达,从而促进脂肪细胞的形成,诱发肥胖;miRNA-148a还能够与胆囊收缩素-2受体(CCK-2R)结合,阻断该受体介导的与饱腹感相关的信号通路传导,在大脑里维持一种饥饿感,增加食物的摄入,引发食欲过剩,这种摄食过多的情况也会进一步促进机体更加肥胖[40-41]。
2.2 乳源外泌体在免疫功能调节方面的作用
2.2.1 乳源外泌体在免疫系统发育方面的作用
乳源外泌体所介导的生理功能,除了发挥营养调控作用外,还能够参与免疫功能的调节。而且饲粮中的成分还可通过影响乳源外泌体来调控母畜和哺乳仔畜免疫系统发育及功能。Sun等[42]研究发现,在饲粮中加入人参多糖补充剂后,母猪乳源外泌体中鉴定出了200多种表达出现上调和下调的miRNA,对这些不同表达的miRNA进一步综合分析发现,这些miRNA之间存在着与免疫调节功能相关的相互作用,对于促进母猪免疫反应和仔猪免疫健康具有重要意义。乳源外泌体还可以直接调节免疫系统的发育,Miura等[43]研究发现,母猪初乳中的外泌体可以通过内吞作用刺激外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PMBC)中的白细胞介素-2的产生,从而参与哺乳仔猪免疫系统的发育。
2.2.2 乳源外泌体在免疫细胞方面的作用
2.2.3 乳源外泌体在免疫疾病方面的作用
在发挥积极的免疫调节作用的同时,乳源外泌体同样也对免疫调节具有一定的消极作用,表现在其与免疫相关的疾病上。例如,乳源外泌体与各类过敏性疾病的发生密切相关。研究表明,新生儿过敏原耐受性的产生以及体内过敏的终止都与人叉头蛋白P3(Forkhead box P3,FOXP3)的去甲基化密切相关,DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)和DNA甲基转移酶3B(DNA methyltransferase 3B,DNMT3B)都是调控该过程的主要蛋白质,miRNA-21通过作用于其靶蛋白Ras特异性鸟嘌呤释放蛋白1(Ras guanyl releasing protein 1,RasGRP1),间接地降低DNMT1的表达量;而miRNA-148a的靶蛋白是DNMT1,随着miRNA-148a含量的升高,DNMT1的含量与其呈现负相关的降低,从而提高过敏性疾病如过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性皮炎等疾病的发生几率[45]。miR-29b也同样具有下调DNMT1表达的功能,而它与miRNA-21和miRNA-148a等miRNA都是母乳与其他人工发酵乳相比含量具有显著差异的标志miRNA[46]。
3 小结
综上所述,乳源性外泌体存在于乳汁中,随着哺乳行为将携带的核酸等物质大量转运进幼畜的体内,从而充分发挥营养调控与免疫调节作用。因此,今后因深入挖掘乳源外泌体的功能,使其更好地服务于畜牧养殖业和兽医行业。