1 附生微生物简介
附生微生物是指附着在植物表面的大量微生物,主要为叶面微生物。由于叶片外部表面和内部组织之间通过气孔和水腺等组织相通,叶片的内外无明显界限,而人们对植物地上部分的组织器官的外表面和内部定义为叶际,因此,还称为叶际微生物[5]。叶际受环境因素影响,时刻处于动态变化中,环境变化幅度大、紫外线辐射和长期营养物质匮乏等因素[6⇓-8]对微生物有很大影响。虽然叶面微生物生长环境恶劣,但仍有大量微生物被发现,每平方厘米的叶片,微生物数可达 。同时附生微生物的营养主要来自外渗物质或分泌物,所以叶面具有较高渗透性的部位养分较多,有更密集的细菌群落。而附生微生物的组成并不是简单随机的组成,而是环境选择和协同进化的结果[10-11]。宿主植物和微生物之间关系复杂,但大部分是共生关系[12]。附生微生物种类繁多,但细菌最为丰富[7,13],主要由4个门组成:变形菌门、放线菌门、拟杆菌门和厚壁菌门[14-15],一般情况下,变形菌门的微生物最为丰富[16-17],其中的甲基杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属等几乎在所有叶面上被发现[7,18]。除地理环境[4]等因素会影响附生微生物的组成外,植物基因型[19]、植物物种[3]等因素也会对其有不同程度的影响,不少人认为植物种类是影响附生微生物组成和多样性的主要因素[20⇓-22]。总体而言,影响植物附生微生物的因素有2方面:一方面是植物生长的外部环境因素;另一方面是植物物种的内部因素。
2 外部因素对青绿饲料附生微生物组成的影响
2.1 环境因素
不同生长环境的青绿饲料,其附生微生物的组成和数量具有较大的差异,但总体上,附生微生物区系随某种环境变量在空间上呈规律性分布[23-24]。叶际微生物主要来自空气、土壤、种子及其他植物。1年生植物具有相似的优势菌群,部分原因是部分微生物能通过种子在世代间的传递,如假单胞菌(Pseudomonas)[25],故来自同一地区的植物附生微生物区系往往有相似表现。Rastoqi等[18]研究发现,环境因子和地理位置是影响叶际微生物群落组成的关键因素,同一品种种植于不同地区的植物叶际微生物群落结构差异很大。谷立坤等[26]对饲草叶际附生微生物进行研究,同样发现不同种植地点对甘薯叶际微生物群落结构的影响显著。此外,有研究还发现海拔对微生物群落也有影响,Fierer等[27]发现海拔对微生物的影响与我们已知的动植物群落分布不同,总体上还是随海拔升高,微生物多样性降低。纬度对附生微生物区系也有明显影响,微生物多样性呈随纬度增加不断减少趋势[28-29]。综上所述,青绿饲料生长的地理环境对附生微生物的组成有很大影响,低海拔低纬度地区附生微生物多样性较高。
综上所述,环境对附生微生物区系的影响并不是只由1个因素制约的,纬度、海拔、温度、湿度等环境因素的相互作用,共同制约着微生物多样性[35]。
2.2 青绿饲料收割时间或阶段
由于附生微生物暴露于空气,青绿饲料收割时紫外线强度和湿度等因素均会影响到菌群组成。Dong等[36]对比了上午、中午和下午采集的象草附生微生物,发现新鲜象草的附生微生物主要是厚壁菌门、变形菌门和放线菌门,但不同时期收获的象草,主要的门不同。其中,上午收获的象草厚壁菌门(77.2%)最为丰富,而中午和下午收获的则是变形菌门(48.0%;58.6%)占主导。在属水平上,上午以象草由葡萄球菌(73.4%)和肠杆菌(9.80%)为主,而在中午和下午的象草中,主要是甲基奥鲁姆菌(23.5%;23.2%)、葡萄球菌(14.6%;2.59%)、短杆菌(9.06%;6.08%)和鞘氨醇单胞菌(8.60%;16.6%)。从属水平上可发现,中午和下午收获的象草附生微生物种类和组成更接近,与上午收割的附生微生物有较大区别。
不同成熟度的青绿饲料,附生微生物也不同。Zhao等[37]对比了成熟早期收获和成熟晚期收获象草的附生微生物,同样发现变形菌门、放线菌门和厚壁菌门是新鲜象草中最丰富的门,但随着象草成熟度的提高,放线菌门丰度增加,变形菌门和厚壁菌门丰度下降。而在属水平上,成熟晚期收获的象草微生物组成更复杂。
综上所述,不同时间或不同阶段收割青绿饲料,附生微生物组成均有差异,其中,中午和下午收获较为相似,而成熟度提高,附生微生物组成会更复杂。
3 不同种类青绿饲料原料对其附生微生物组成及对青贮品质的影响
3.1 禾本科植物
3.1.1 附生微生物的组成
禾本科植物大多受牲畜喜爱,具有较大饲用意义,是重要的能量饲料。我国常用于饲喂反刍动物的青绿饲料主要有玉米、高粱、象草、苏丹草、黑麦草等,我国南方地区,甘蔗尾叶也是常见的饲喂饲料。
玉米是常见的禾本科植物,由于其良好的环境适应性和较高的营养价值,是世界重要的粮食作物,所以玉米附生微生物区系有大量研究。Drouin等[38]发现,玉米附生微生物以变形菌门为主,其中又以假单胞菌目、黄单胞菌目和肠杆菌目最丰富。Guan等[32]对比了我国西南地区5个地点的玉米,发现优势菌属均为魏斯氏菌属、假单胞菌属、乳杆菌属和明串珠菌属。Guan等[39]发现,新鲜玉米中以明串珠菌、克雷伯氏菌和乳球菌为主。Wu等[40]通过对比衡水和邢台地区玉米附生微生物的DNA序列,发现玉米以变形菌门为主,肠杆菌科占优势,微生物群落的多样性由物种决定,不受环境影响。在Ali等[41]的试验中分离了生长阶段后期的新鲜玉米的附生菌群的DNA,通过测序检测到玉米附生微生物菌群以变形菌门(86.1%)、拟杆菌门(8.22%)、厚壁菌门(3.25%)和放线菌门(2.41%)为主,且在属水平上主要由肠杆菌属、鞘氨醇杆菌属和假单胞菌属组成,乳酸菌属较少。在Nazar等[42]通过16S rRNA测序发现全株玉米的附生微生物主要由变形菌门(89.9%)、厚壁菌门(8.35%)和拟杆菌门(1.31%)组成。Nazar等[43]的试验中检测到全株玉米的优势菌属为肠杆菌(32.8%),并发现附生微生物中乳杆菌目主要为乳球菌(4.42%)、威氏菌(1.73%)、明串珠菌(1.29%)和乳杆菌(0.02%)。Wang等[44]的试验中检测了新鲜玉米附生菌群的DNA,发现优势菌门是变形菌门(86.34%),且肠杆菌(>14%)是优势菌属。许冬梅[30]通过16S rRNA测序发现,不同气候区的全株玉米附生微生物有较大差异。由上述结果可知,玉米的附生微生物在门水平上以变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门为主,其中变形菌门在数量上占绝对优势,在目水平上以肠杆菌目和乳杆菌目为主,在属水平上差异较大,这种差异可能由于气候引起,其中北方气候较为稳定,附生微生物组成上差异不大,但南方气候环境复杂,附生微生物组成有明显差异。
对于高粱附生微生物组成,我国南京农业大学邵涛老师团队有较多研究。其中,在Ali等[41]的试验中检测到新鲜高粱的附属菌群以变形菌门(96.5%)、厚壁菌门(2.43%)和放线菌门(0.70%)为主,在属水平上,主要由肠杆菌属、罗森伯格氏菌属和欧式杆菌属组成,但在新鲜植物上乳酸菌属丰度较少。Nazar等[42]的试验中,通过16S rRNA测序发现,高粱的附生菌群中变形菌门(96.5%)和厚壁菌门(2.44%)占主导地位,优势菌属为肠杆菌属(35.9%)和罗森伯格氏菌(25%)。其中乳杆菌目主要由乳球菌(1.10%)、魏斯氏菌属(0.52%)、乳杆菌(0.43%)组成。Wang等[44]试验中检测发现,新鲜高粱中的优势菌门是变形菌门(96.46%),大量肠杆菌(>14%)在新鲜高粱中被发现,还有大量的罗森伯格氏菌,该菌属于革兰氏阴性菌,并兼性厌氧,属于肠杆菌科,对青贮品质有不利影响。新鲜高粱的附生微生物中,变形菌门占绝大多数,乳酸菌属较少而肠杆菌属较多。
以上列举了几种常用于青贮的禾本科牧草的附生微生物,由上述结果可知,虽同为禾本科青绿饲料,但其附生微生物特点均不同,且有较大差异。在门水平上均以变形菌门为主,在科水平上含有大量的肠杆菌科微生物,在属水平上均发现有大量肠杆菌属。
3.1.2 附生微生物组成对青贮品质的影响
禾本科牧草通常被认为适合青贮,其附生微生物组成对青贮品质可能会有优化。
青贮玉米营养丰富,且品质较高,是反刍动物常用的粗饲料,玉米青贮较高的品质与玉米附生微生物有关。Ali等[41]收集玉米的附生微生物,接种于灭菌的红三叶草,进行青贮,结果表明,红三叶在青贮初期发酵缓慢,但最终其青贮品质得到了改善,体现在发酵初期红三叶pH下降缓慢且乳酸含量较低,但在发酵末期加快了红三叶草发酵速度,发酵降低了青贮体系的pH,提高了乳酸含量。其机制在于玉米附生菌种中存在较多耐酸的乳酸菌,且多为同型发酵乳酸菌,能产生大量乳酸以快速降低红三叶草这类高缓冲能力豆科青绿饲料的酸度。同时,Wang等[44]将玉米的附生微生物接种于灭菌的燕麦也得到了相似的结果,其在青贮前期发酵缓慢而在后期迅速增长。具体表现在前期乳酸增长缓慢,青贮结束后,乳酸大量积累,且乙酸、丁酸含量较低,主要为球形乳酸菌主导的同型发酵。
Nazar等[42]将玉米附生微生物接种于灭菌玉米上进行青贮,其pH下降迅速,且一直保持较低水平,乳酸含量较高,且一直保持较高水平,虽然在青贮中后期有所下降,但总体具有较高青贮品质。Nazar等[48]将全株玉米的附生微生物接种于灭菌的象草进行青贮,研究表明,全株玉米附生微生物可以改善象草的青贮品质。具体表现在其加快了青贮初期的发酵速度,乳酸含量显著提高,pH下降速度加快,青贮结束后有更低的pH和较高的氨态氮、乙酸含量,其机制在于青贮后期醋酸杆菌的活动。此外,Nazar等[43]将全株玉米的附生菌群接种于灭菌苏丹草也有类似结果。但Wang等[46]将玉米附生微生物接种于意大利黑麦草,发现对其青贮品质没有改善效果。
对比玉米附生微生物几次重构青贮试验,发现其主导的为同型发酵,青贮结束后乳酸含量较高,同时pH较低,青贮品质较好,说明玉米附生微生物对青贮品质可能有正向作用。但重构青贮时,附生微生物在青贮前期可能有一段适应时间表现为前期发酵速度不一。
高粱因其产量高、栽培广,也是常见的青贮原料。Nazar等[48]将高粱的附生微生物接种于灭菌的象草进行青贮,60 d后具有更高的青贮品质。其拥有更高的乳酸含量和更低的pH,且接种高粱附生微生物组青贮后水溶性碳水化合物(WSC)含量更高,能量浪费更少。此外Nazar等[43]还将高粱的附生菌群接种于灭菌的苏丹草进行青贮,发现其前期发酵缓慢,但青贮结束后该组青贮具有更高的品质。而Wang等[44]将高粱的附生微生物接种于灭菌的燕麦结果不同。其发现青贮结束后乙酸、丁酸和乙醇含量较高,乳酸含量较低,这与高粱附生微生物中存在大量肠杆菌有关。此外,Ali等[41]将高粱的附生微生物接种于灭菌的红三叶草,但所得青贮品质不佳,可能与肠杆菌活动有关。Wang等[46]将高粱附生微生物接种于意大利黑麦草进行青贮,未能改善青贮品质。综上所述,高粱的附生微生物所主导的发酵主要为乙酸型发酵,与肠杆菌和异型发酵乳酸菌有关。但高粱附生微生物对不同青绿饲料影响不同,对青贮品质改良能力差。
我国象草主要在南方种植,是南方常见的青贮原料,由于种植的地域局限性,研究较少。Yuan等[45]将象草的附生微生物分别接种于灭菌和未灭菌的紫花苜蓿进行青贮,结果表明,灭菌后接种的苜蓿青贮品质更佳,体现在其发酵前期加速了发酵,拥有更高的乳酸含量,更快的WSC下降速度和更低的pH。青贮结束后,灭菌组有更高的乙酸含量和更低的pH,其机制在于象草附生菌中产乙酸菌或异型发酵菌较多,会产生大量乙酸降低青绿饲料的pH。未灭菌接种组同样有较高的乙酸含量及较低的pH,但不及灭菌组,可能由于青贮过程外源菌与附生菌群的竞争,会影响青贮接种剂的有效性。但Nazar等[48]将象草的附生微生物接种于灭菌象草进行青贮时,发现青贮过程中该组pH下降缓慢,青贮结束时pH较高,且青贮过程中乳酸含量不高,但有较高的乙酸、丁酸和氨态氮含量,青贮品质不高,这与象草附生微生物中较高的魏斯氏菌属丰度有关。象草青贮品质不高,但其附生微生物可能可以加快其他植物的青贮发酵,但其发酵结束后乙酸含量较高,对青贮品质的提高有一定帮助。
综上所述,禾本科牧草附生微生物大多对青贮品质的提高有帮助,其中玉米附生微生物的帮助最明显。禾本科牧草附生微生物用于青贮,大多可加快青贮发酵,且青贮结束后pH更低。
3.2 豆科植物
3.2.1 附生微生物组成特点
豆科青绿饲料因蛋白质含量高,适口性好,动物喜食。豆科青绿饲料与根瘤菌共生,能将空气中的氮固定,用以增加自身蛋白质含量和土壤氮含量。由于土壤施肥水平会影响植物附生微生物,有研究发现,植物附生乳杆菌数量随施氮水平的提高,会有先上升后下降的变化[49],所以豆科青绿饲料的附生微生物有不同特点。
苜蓿是多年生豆科青绿饲料,其耐旱、产量高、质量优及富含粗蛋白质、碳水化合物、矿物质和维生素,有“青绿饲料之王”之称,受到畜禽的喜爱,是公认的优质纤维饲料。Yuan等[45]发现,新鲜苜蓿中优势菌门是厚壁菌门(62.99%)、变形菌门(26.52%)和蓝藻门(10.34%),在属水平上以肠球菌属(42.97%)为主,其次为泛菌属(21.13%),梭状芽孢杆菌属占5.39%。Wu等[40]通过测序对比衡水和邢台地区的苜蓿草表面附生细菌群落的DNA,紫花苜蓿以厚壁菌门为主,肠杆菌科微生物在苜蓿表面占主导,而且群落多样性组成主要受植物种类影响,不受区域的影响。Mcgarvey等[50]发现,苜蓿中优势菌门首先是变形菌门(89.6%),其次是厚壁菌门、放线菌门和肠杆菌门。
红三叶在我国淮河以南有栽培,Ali等[41]发现,新鲜红三叶附生微生物群主要为变形菌门(90.3%),其次为拟杆菌门(5.37%)、放线菌门(2.81%)和厚壁菌门(0.83%)。在属水平上,主要由甲基杆菌属、鞘氨醇单胞菌属和新鞘氨醇菌属组成。
豆科植物附生微生物区系的研究较少,综上发现,豆科植物主要以厚壁菌门和变形菌门为主,乳酸菌属发现较少,有大量肠球菌属被发现。
3.2.2 附生微生物对青贮品质的影响
豆科牧草因其缓冲能力强等特点,难以青贮,所以目前对豆科植物的附生微生物应用于青贮的研究较少。Dong等[51]将苜蓿的附生微生物接种于灭菌和未灭菌的象草,发现接种苜蓿附生微生物会增加青贮氨态氮含量,同时也会加速发酵,但只能略微提高青贮品质。具体表现在不论是灭菌还是未灭菌组,在发酵前期pH速度下降较快,乳酸含量较高。青贮结束后,灭菌组乙酸含量较低,氨态氮含量较高,对其他发酵指标影响不大。Ali等[52]将红三叶附生微生物接种于灭菌象草进行青贮,发现红三叶的附生微生物可加快青贮发酵,且能提高青贮品质。具体表现在发酵前期pH下降迅速,乳酸含量较高,且青贮结束后该组有更低的pH和更高的乳酸含量。Ali等[41]将红三叶的附生微生物接种于灭菌的红三叶进行青贮,发现在青贮早期pH下降迅速,乳酸含量快速增加,但在中、后期pH不再下降,乳酸含量上升缓慢,到青贮末期有所下降,青贮品质总体不高。其机制在于附生乳酸菌对于宿主适应性更佳[53]。虽然豆科牧草不适合青贮,但豆科牧草附生微生物对青贮品质的提高是有帮助的,特别是加快了前期的发酵速度。
4 小结
青绿饲料附生微生物组成同时受到内部和外部因素的影响,内部和外部因素共同制约着附生微生物的多样性。处于低海拔、低纬度、低温、高湿地区的青绿饲料,其附生微生物组成多样性更高。禾本科植物以变形菌门为主,肠杆菌科微生物被大量发现,豆科植物变形菌门和厚壁菌门最为丰富,肠球菌科被大量发现。玉米附生微生物对青贮品质的提高有很大帮助,其他青绿饲料附生微生物研究较少。附生微生物区系的研究对提高青贮品质具有重大意义,随着对微生物研究手段的日渐成熟,微生物对青贮品质的影响得到进一步揭示,通过研究青绿饲料附生微生物,可以阐明附生微生物在发酵过程中对青贮品质的作用,为合理利用附生微生物、提高青贮发酵品质提供理论依据。