Chinese Journal of Animal Nutrition >

2023 , Vol. 35 >Issue 5: 3290 - 3302

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2023.305

RESEARCH PAPER

Effects of Subacute Ruminal Acidosis on Expression of Volatile Fatty Acid Absorption and Metabolism Related Genes in Ruminal Epithelium of Dairy Goats

  • LI Lanzhu , 1 ,
  • LI Yang 2 ,
  • WANG Mengya 2 ,
  • GAO Min 3 ,
  • SONG Liwen 3 ,
  • ZHAO Meng 3 ,
  • JIANG Ruike 1 ,
  • HU Honglian , 3, ** ,
  • SUN Manji , 1, **
Expand
  • 1 College of Animal Science and Technology, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
  • 2 College of Animal Sciences, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
  • 3 Institute of Animal Nutrition and Feed, Inner Mongolia Academy of Agricultural & Animal Husbandry Sciences, Hohhot 010031, China
**HU Honglian, professor, E-mail: ;
SUN Manji, professor, E-mail:

*Contributed equally

Received date: 2022-11-16

  Online published: 2023-05-11

Fold

Abstract

The aim of this experiment was to investigate the effects of subacute rumen acidosis (SARA) on the mRNA relative expression levels and protein relative expression levels of volatile fatty acid (VFA) absorption and metabolism related genes in ruminal epithelium of dairy goats. Twelve lactating Saanen dairy goats with similar body weight [(62.13±4.76) kg] were installed permanent rumen fistulas and randomly divided into two groups with 6 goats per group. Goats in the control group were fed a basal diet, and dietary non-fibrous carbohydrate/neutral detergent fiber (NFC/NDF) was 1.15; the others in SARA group was fed experimental diets to establish SARA model, and dietary NFC/NDF were 1.15, 1.49, 2.12 and 2.66, respectively. The trial period was 60 days. At the end of the experiment, dairy goats were slaughtered and collected the rumen epithelial tissues from ventral sac. The mRNA relative expression levels and protein relative expression levels of VFA absorption and metabolism related genes in ruminal epithelium were detected by real-time PCR (RT-PCR) and Western blotting methods. The correlation between rumen fermentation parameters, VFA absorption rate of ruminal epithelium and mRNA relative expression levels of VFA absorption and metabolism related genes was analyzed. The results showed as follows: 1) compared with the control group, the mRNA relative expression levels of Na+/H+ exchanger 1 (NHE1), acyl-CoA short chain synthetase 2 (ACSS2), 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthetase 1 (HMGCS1), 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthetase 2 (HMGCS2) and 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGCR) in ruminal epithelium of SARA group were significantly up-regulated (P<0.01), and the mRNA relative expression levels of Na+/H+ exchanger 3 (NHE3), monocarboxylate transporter 1 (MCT1) and down-regulated adenoma carrier (DRA) were significantly up-regulated (P<0.05). 2) Compared with the control group, the relative protein expression levels of NHE1, NHE3, Na+/H+ exchanger 4 (NHE4), monocarboxylate transporter 2 (MCT2), anion exchanger 2 (AE2), Na+/K+-ATPase, ACSS2, acyl-CoA short-chain synthase 3 (ACSS3), 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase (HMGCL) and acetyl-CoA acetyltransferase 1 (ACAT1) in ruminal epithelium of SARA group were significantly up-regulated (P<0.05). In conclusion, SARA can increase the mRNA relative expression levels of NHE1, NHE3, MCT1, DRA, ACSS2, HMGCS1, HMGCS2 and HMGCR in ruminal epithelium and the protein relative expression levels of NHE1, NHE3, NHE4, MCT2, AE2, Na+/K+-ATPase, ACSS2, ACSS3, HMGCL and ACAT1, there by accelerate the absorption and metabolism of VFA in ruminal epithelium and relieve the damage to the body of SARA.

Key words： dairy goats; subacute rumen acidosis; volatile fatty acids; absorption and metabolism genes

Cite this article

LI Lanzhu , LI Yang , WANG Mengya , GAO Min , SONG Liwen , ZHAO Meng , JIANG Ruike , HU Honglian , SUN Manji . Effects of Subacute Ruminal Acidosis on Expression of Volatile Fatty Acid Absorption and Metabolism Related Genes in Ruminal Epithelium of Dairy Goats[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2023 , 35(5) : 3290 -3302 . DOI: 10.12418/CJAN2023.305

提高饲粮中的精料比例以满足动物高生产性能的需求是反刍动物生产中的常用手段,然而,精料比例过高会导致瘤胃微生物发酵速度加快,挥发性脂肪酸(volatile fatty acid,VFA)在瘤胃内蓄积,pH降低,诱发亚急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis,SARA)。SARA可引起瘤胃菌群紊乱,导致革兰氏阴性菌死亡裂解释放内毒素,破坏瘤胃上皮细胞结构和功能的完整性,影响营养物质、发酵产物的吸收和代谢效率[1]。当瘤胃受到高精料比例刺激后,瘤胃上皮细胞会适应性地调节VFA的吸收和代谢,以维持瘤胃内环境的稳态。Dieho等[2]研究发现,在奶牛干奶期补饲精料可以提高其瘤胃上皮细胞单羧酸转运蛋白4(MCT4)、下调式腺瘤载体(DRA)、Na+/H+交换蛋白3(NHE3)的mRNA相对表达量,表明补饲精料时瘤胃上皮细胞会积极调节VFA吸收能力。同样,Yan等[3]也研究发现,提高饲粮中精料比例会显著提高山羊瘤胃上皮细胞DRA、阴离子交换蛋白2(AE2)、假定阴离子转运蛋白1(PAT1)的mRNA相对表达量,避免高精料饲粮引起瘤胃VFA的蓄积。此外,最近的一项研究显示,奶牛在采食后的2~5 h VFA吸收相关蛋白AE2、单羧酸转运蛋白1(MCT1)、PAT1、NHE3、MCT4、Na+/H+交换蛋白1(NHE1)的mRNA相对表达量会显著提高,这与奶牛采食后短时间内瘤胃VFA产生增加有关[4]。Gao等[5]研究发现,SARA风险较低的奶牛瘤胃上皮细胞VFA代谢基因三羟基三甲基辅酶A合成酶1(HMGCS1)的mRNA相对表达量高于SARA风险较高的奶牛。同时,SARA易感度不同也会影响奶牛瘤胃上皮细胞VFA吸收代谢相关基因的mRNA相对表达量,与SARA耐受牛相比,SARA易感牛瘤胃上皮细胞Na+/H+交换蛋白(NHE)的mRNA相对表达量显著提高[6]。
众所周知,SARA的典型特征是瘤胃pH长期处于较低状态,而瘤胃VFA吸收代谢速率则是影响瘤胃pH的关键因素之一[5]。反刍动物瘤胃VFA的清除主要是依赖瘤胃上皮细胞对VFA的吸收代谢实现的,而瘤胃上皮细胞对其吸收代谢主要与上皮结构和功能的完整性息息相关。SARA会引起瘤胃上皮细胞功能损伤已是不争的事实,显然SARA会影响瘤胃上皮细胞VFA吸收代谢。然而,关于SARA对瘤胃上皮细胞VFA吸收代谢相关基因表达的影响及其具体分子机制还尚不明确。因此,本研究以奶山羊为动物模型,通过逐步递增饲粮非纤维性碳水化合物/中性洗涤纤维(NFC/NDF)比例诱导建立SARA模型,研究SARA对奶山羊瘤胃上皮细胞VFA吸收代谢相关基因表达的影响,并探究瘤胃发酵参数、瘤胃上皮细胞VFA吸收率与VFA吸收代谢相关基因之间的潜在关系,以期为SARA对瘤胃VFA吸收代谢功能影响的深入研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验设计

选取健康、体况良好的经产泌乳期萨能奶山羊12只,装有永久性瘤胃瘘管,单笼饲养。根据体重[(62.13±4.76) kg]、产奶量[(1.68±0.15) kg/d]以及泌乳日龄[(136±2)日龄]相近原则,随机分为2组,每组6只羊。对照组饲喂基础饲粮(NFC/NDF为1.15),SARA组通过饲喂NFC/NDF分别为1.15、1.49、2.12、2.66的试验饲粮诱导建立SARA模型。每种饲粮饲喂15 d,前12 d为适应期,后3 d为采样期。以瘤胃pH作为判断SARA模型是否诱导成功的参数,采样期内每间隔15 min采集瘤胃液并检测其pH,当瘤胃pH≤5.5每日持续3 h以上即判定奶山羊SARA模型诱导成功。

1.2 试验饲粮与饲养管理

试验期为60 d,试验动物单笼饲养,每天06:00和18:00各饲喂1次,饲喂方式为先精后粗,有利于建立SARA模型,整个试验期自由饮水。试验饲粮参照NRC(1981)奶山羊的营养需要配制,其组成及营养水平见表1。
表1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) %

项目
Items		 非纤维性碳水化合物/中性洗涤纤维NFC/NDF
1.15 1.49 2.12 2.66
原料Ingredients
苜蓿干草Alfalfa hay 17.98 9.88 4.22 1.61
羊草Chinese leymus 34.59 32.99 27.37 21.72
玉米Corn 27.71 37.86 52.12 59.95
麸皮Wheat bran 13.68 8.75 3.94 3.01
豆粕Soybean meal 3.57 7.52 8.80 9.73
石粉Limestone 0.90 1.14 1.35 1.53
食盐NaCl 0.15 0.15 0.15 0.15
预混料Premix1) 1.42 1.71 2.05 2.30
合计Total 100.00 100.00 100.00 100.00
营养水平Nutrient levels2)
泌乳净能NEL/(MJ/kg) 11.95 12.49 13.11 13.32
粗蛋白质CP 12.10 12.48 12.20 12.44
非纤维性碳水化合物NFC3) 41.51 46.19 52.60 55.94
中性洗涤纤维NDF 36.03 30.96 24.82 20.99
酸性洗涤纤维ADF 22.25 18.27 13.87 11.06
钙Ca 0.69 0.69 0.68 0.71
磷P 0.35 0.35 0.34 0.36
钙/磷Ca/P 1.97 1.97 2.00 1.97
精粗比Concentrate-to-forage ratio 47∶53 57∶43 68∶32 77∶23

1)每千克预混料含有 One kilogram of premix contained the following:VA 500 000 IU,VD3 100 000 IU,VE 3 500 mg,Fe 10 670 mg,Cu 1 700 mg,Zn 9 900 mg,Mn 5 000 mg,I 150 mg,Se 60 mg,Co 80 mg。

2)粗蛋白质、中性洗涤纤维、钙和磷均为实测值,其他为计算值。CP, NDF, Ca and P were measured values, while the others were calculated values.

3)非纤维性碳水化合物(%)=100-中性洗涤纤维-粗蛋白质-粗脂肪-粗灰分。NFC(%)=100-NDF-CP-EE-Ash.

1.3 样品采集

在采样期内,每间隔2 h采集1次瘤胃液,经过4层纱布过滤后立即测定其pH,随后静置30 min,3 000×g离心15 min,取4 mL上清液与1 mL的25%偏磷酸充分混合后置于-20 ℃冰箱保存,用于后续测定。试验期结束后进行屠宰,在屠宰前,试验动物需禁食禁水12 h,屠宰后迅速切取腹侧盲囊瘤胃组织(2 cm×2 cm),去除附着在瘤胃乳头表面的饲料颗粒,置于4 ℃预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH=7.4)中,反复冲洗直至PBS保持清澈为止。用吸水纸将瘤胃组织表面的水分吸干,随后钝性剥离剔除肌肉组织,迅速将上皮组织放入2 mL冻存管内,液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存,用于后续测定。

1.4 指标测定

1.4.1 瘤胃pH测定

用pH计直接测定。

1.4.2 瘤胃VFA浓度及瘤胃上皮细胞VFA吸收率测定

瘤胃VFA浓度及瘤胃上皮细胞VFA吸收率参照杜瑞平[7]的方法进行测定。

1.4.3 实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测VFA吸收代谢相关基因mRNA相对表达量

剪取黄豆粒大小的瘤胃上皮细胞组织,采用Trizol Reagent试剂盒(美国Invitrogen公司)提取瘤胃上皮细胞组织样本的总RNA。根据PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)试剂盒说明书合成cDNA。按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa)试剂盒说明书进行RT-PCR扩增,扩增条件为:95 ℃预变性30 s,95 ℃变性10 s,60 ℃退火 30 s,72 ℃ 延伸30 s,40次循环。RT-PCR反应体系为25 μL,2×TB Green Premix Ex Taq(Tli RNase H Plus)(TaKaRa)12.5 μL,上游引物0.5 μL,下游引物0.5 μL,cDNA模板2.0 μL,ddH2O 9.5 μL。选择甘油三磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参基因,并采用2-△△Ct法对每个基因的mRNA相对表达量进行计算。本试验所需引物由大连宝生物股份有限公司设计并合成,RT-PCR引物序列见表2。
表2 RT-PCR引物序列

Table 2 Primer sequences for RT-PCR

基因
Genes		 引物序列
Primer sequence
(5’—3’)		 登录号
Accession
number		 产物长度
Product
length/bp
Na+/H+交换蛋白1
NHE1		 F:CCATTCCTTCGCTGAACACA
R:CAGCAACCCCACCACAATC		 XM_018056627.1 199
Na+/H+交换蛋白3
NHE3		 F:AGAAGGTCAGCTCAGAAGTCTCG
R:GCTGGGAGAACGGATGAAAG		 XM_018065649.1 129
Na+/H+交换蛋白4
NHE4		 F:GGACATTTTGGCTGGATGTG
R:CTGGGTGAAACGGGTGATAAA		 XM_617121.5 106
单羧酸转运蛋白1
MCT1		 F:CATACCAGGGGTTTATTGATGGA
R:GTAACGGAACACTGAAAATGGATG		 XM_018045927.1 257
单羧酸转运蛋白2
MCT2		 F:TGTTATGCTGTTTGGGTATGGTCT
R:TGTTAAGGCAGGTTGCAGGTT		 XM_005680254.3 119
单羧酸转运蛋白4
MCT4		 F:ATTATCTCTGGATGGGTTGCTGA
R:GGAAATGTGGTGGCTAAAGGAG		 XM_013962550.2 116
下调式腺瘤载体
DRA		 F:TGATGAAGAGCTGGACAATGATAAG
R:GGCTGTGGAGGTTGATTTTAGG		 XM_018047224.1 134
假定阴离子转运蛋白1
PAT1		 F:CTGGTGAAGCTCCTGAATGAAA
R:CACGATGTCCACCCCAAA		 XM_018038273.1 135
阴离子交换蛋白2
AE2		 F:TCAACGCCTTCCTGGACTG
R:CCTGCTCCTCCCCTCTTTCT		 XM_018047468.1 120
钠/钾ATP酶
Na+/K+-ATPase		 F:ATCACGGGTGTGGCTGTGT
R:TGATGCCGATGAGGAAGATG		 XM_018045956.1 100
酰基辅酶A短链合成酶1
ACSS1		 F: GCCATCTACATGCCTGTCTCC
R:CCAAGGACCCCACACTGAA		 XM_018057282.1 109
酰基辅酶A短链合成酶2
ACSS2		 F:TTGAATGGATGAAAGGAGCAAC
R:GCTGAACCGACACACTTGGA		 XM_018057751.1 170
酰基辅酶A短链合成酶3
ACSS3		 F:GACTTAGGCTGGGTTGTTGGA
R:GCGAGCACACGGAAATAGG		 XM_013963698.2 128
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶1
HMGCS1		 F:TATGGCTCCCTGGCTTCTGT
R:CCCTGGTGTGGCATCTTGT		 XM_005694739.3 138
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶2
HMGCS2		 F:TCCACGTACAACGGGAACA
R:CCAAACCAGAGCCATAAGAGAAG		 NM_001285740.1 127
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶
HMGCL		 F:TCCCTCCCTGACCTGAGTATG
R:CACCCAGAATGAGACTTGAGGA		 XM_005676858.2 148
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶
HMGCR		 F:TTGCCCGAGTCTTAGAAGAAGAAG
R:TCTGCTGTGCTGTTTTGAGGA		 XM_018053703.1 142
乙酰辅酶A乙酰转移酶1
ACAT1		 F:TGGGCAACTGTGCTGAAAATAC
R:ATCTCCAAATCTTCCGCCTTC		 XM_018059840.1 122
甘油三磷酸脱氢酶
GAPDH		 F:CCAGAACATCACCCTGCTTC
R:GGTCAGATCCACAACGGACA		 XM_005680968.3 117

1.4.4 Western blot法检测VFA吸收代谢相关基因蛋白相对表达量

称取0.1 g的瘤胃上皮细胞组织,加入2 mL含有1%蛋白酶抑制剂的T-PERTM组织蛋白裂解液(美国Thermo Scientific公司),4 ℃破碎匀浆。随后将匀浆液10 000×g,4 ℃离心5 min,吸取上清液用BCA定量试剂盒(碧云天生物技术有限公司)测定蛋白浓度,将每组的蛋白用PBS稀释,确保每组蛋白浓度保持在同一水平上。将蛋白进行煮沸变性,在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳每个泳道中加入60 μg总蛋白,上样完成后60 V(20 min),80 V(60 min)进行蛋白分离,电泳结束后将蛋白印迹采用恒压全湿转膜法转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上。在室温下加入T-TBS缓冲液(5%脱脂奶粉)封闭缓冲液封闭1 h,T-TBS缓冲液漂洗5次(5 min/次)后,与特异性一抗[NHE4、ACSS1、HMGCS2、HMGCL、HMGCR(稀释度1:500);NHE3、MCT4(稀释度1∶800);NHE1、MCT1、MCT2、DRA、PAT1、ACSS2、HMGCS1、ACAT1(稀释度1∶1 000);AE2(稀释度1∶5 000);钠/钾ATP酶(Na+/K+-ATPase)(稀释度1∶10 000)]孵育,4 ℃冰箱过夜。过夜后,T-TBS缓冲液漂洗5次(5 min/次),加入二抗[羊抗鼠免疫球蛋白(Ig)(H+L)二级抗体(稀释度1:5 000)、羊抗兔IgG(H+L)二级抗体(稀释度1∶5 000)]室温条件下孵育1 h,孵育完成后再次用T-TBS缓冲液漂洗5次(5 min/次),在室温下与电化学发光(ECL)工作溶液孵育1 min,去除多余的ECL工作溶液,用保鲜膜密封,放入X射线胶片在暗盒中曝光5~10 min,然后进行显影和定影。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参,采用BandScan 5.0软件分析条带的光密度值,计算目的蛋白相对表达量。

1.5 数据统计与分析

采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANONA),Duncan氏法进行多重比较;用ggcorplot程序绘制瘤胃发酵参数、瘤胃上皮细胞VFA吸收率与其吸收代谢相关基因之间相关性热图。结果以平均值±标准误(mean±SE)的形式表示,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 SARA对奶山羊瘤胃pH、VFA浓度及瘤胃上皮细胞VFA吸收率的影响

由表3可知,与对照组相比,SARA组瘤胃pH显著降低(P<0.05),瘤胃乙酸浓度极显著降低(P<0.01),瘤胃丙酸、丁酸浓度极显著升高(P<0.01),瘤胃上皮细胞丁酸吸收率显著升高(P<0.05),瘤胃上皮细胞乙酸、丙酸吸收率没有显著差异(P>0.05)。
表3 SARA对奶山羊瘤胃pH、VFA浓度及瘤胃上皮细胞VFA吸收率的影响

Table 3 Effects of SARA on rumen pH, VFA concentration and ruminal epithelium VFA absorption rate of dairy goats

项目
Items		 对照组
Control group		 SARA组
SARA group		 P值
P-value
pH 6.14±0.45a 5.37±0.31b 0.012
乙酸浓度Acetic acid concentration/(mmol/L) 40.87±2.56A 36.23±2.64B <0.001
丙酸浓度Propionic acid concentration/(mmol/L) 20.49±2.16B 24.27±1.98A <0.001
丁酸浓度Butyric acid concentration/(mmol/L) 14.41±2.98B 19.80±2.45A <0.001
乙酸吸收率Acetic acid absorption rate/% 14.19±1.95 16.01±1.87 0.302
丙酸吸收率Propionic acid absorption rate/% 57.86±2.56 60.91±2.37 0.160
丁酸吸收率Butyric acid absorption rate/% 45.45±1.47b 47.67±1.39a 0.041

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01),无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01), while with no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 SARA对奶山羊瘤胃上皮细胞VFA吸收相关基因mRNA相对表达量的影响

由表4可知,与对照组相比,SARA组瘤胃上皮细胞NHE1的mRNA相对表达量极显著上调(P<0.01),瘤胃上皮细胞NHE3、MCT1、DRA的mRNA相对表达量显著上调(P<0.05),NHE4、Na+/K+-ATPase、MCT4和PAT1的mRNA相对表达量没有显著差异(P>0.05)。
表4 SARA对奶山羊瘤胃上皮细胞VFA吸收相关基因mRNA相对表达量的影响

Table 4 Effects of SARA on mRNA relative expression levels of VFA absorption related genes in ruminal epithelium of dairy goats

项目Items 对照组Control group SARA组SARA group P值P-value
Na+/H+交换蛋白1 NHE1 1.23±0.07B 2.55±0.13A <0.001
Na+/H+交换蛋白3 NHE3 1.38±0.24b 2.18±0.14a 0.014
Na+/H+交换蛋白4 NHE4 1.21±0.18 1.49±0.12 0.131
钠/钾ATP酶泵Na+/K+-ATPase 1.24±0.11 1.46±0.04 0.063
单羧酸转运蛋白1 MCT1 1.18±0.09b 1.53±0.07a 0.013
单羧酸转运蛋白4 MCT4 1.08±0.03 1.27±0.14 0.124
下调式腺瘤载体DRA 1.44±0.15b 2.38±0.26a 0.011
假定阴离子转运蛋白1 PAT1 1.20±0.18 1.33±0.13 0.436

2.3 SARA对奶山羊瘤胃上皮细胞VFA代谢相关基因mRNA相对表达量的影响

由表5可知,与对照组相比,SARA组瘤胃上皮细胞ACSS2、HMGCS1、HMGCS2、HMGCR的mRNA相对表达量极显著上调(P<0.01),ACSS1的mRNA相对表达量极显著下调(P<0.01),ACSS3的mRNA相对表达量显著下调(P<0.05),HMGCL、ACAT1的mRNA相对表达量没有显著差异(P>0.05)。
表5 SARA对奶山羊瘤胃上皮细胞VFA代谢相关基因mRNA相对表达量的影响

Table 5 Effects of SARA on mRNA relative expression levels of VFA metabolism related genes in ruminal epithelium of dairy goats

项目
Items		 对照组
Control group		 SARA组
SARA group		 P值
P-value
酰基辅酶A短链合成酶2 ACSS2 0.57±0.14B 2.57±0.19A <0.001
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶1 HMGCS1 0.78±0.11B 1.78±0.12A 0.001
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶2 HMGCS2 0.73±0.08B 2.64±0.21A <0.001
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGCR 1.02±0.17B 2.60±0.17A 0.001
酰基辅酶A短链合成酶1 ACSS1 1.67±0.11A 0.35±0.08B <0.001
酰基辅酶A短链合成酶3 ACSS3 2.13±0.08a 1.73±0.15b 0.030
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶HMGCL 2.22±0.19 2.33±0.04 0.452
乙酰辅酶A乙酰转移酶1 ACAT1 1.41±0.23 1.30±0.13 0.568

2.4 SARA对奶山羊瘤胃上皮细胞VFA吸收代谢相关基因蛋白相对表达量的影响

由图1可知,对于瘤胃上皮细胞VFA吸收相关基因,SARA组瘤胃上皮细胞NHE1、NHE3、NHE4、MCT2、AE2和Na+/K+-ATPase的蛋白相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。对于瘤胃上皮细胞VFA代谢相关基因,SARA组瘤胃上皮细胞ACSS2、ACSS3、HMGCL和ACAT1的蛋白相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。
图1 SARA对奶山羊瘤胃上皮细胞VFA吸收代谢相关基因蛋白相对表达量的影响

数据柱标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Fig.1 Effects of SARA on protein relative expression levels of VFA absorption and metabolism related genes in ruminal epithelium of dairy goats

Data columns with different small letters mean significant difference(P<0.05), and with different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01).

2.5 瘤胃发酵参数、瘤胃上皮细胞VFA吸收率与VFA吸收代谢相关基因mRNA相对表达量之间的相关性分析

本试验参考Spearman方法探究胃发酵参数、瘤胃上皮细胞VFA吸收率与其吸收代谢相关基因mRNA相对表达量之间的相关性,根据阈值|r|>0.995,P<0.05为筛选标准。由图2可知,在对照组中,瘤胃上皮细胞NHE3的mRNA相对表达量与瘤胃pH呈显著正相关(r=0.999,P=0.032),与瘤胃丙酸浓度呈显著负相关(r=-0.998,P=0.037);MCT1的相对表达量与瘤胃上皮细胞乙酸吸收率呈显著负相关(r=-0.997,P=0.049);ACSS1的mRNA相对表达量与瘤胃上皮细胞乙酸吸收率呈显著正相关(r=0.999,P=0.031),与瘤胃丙酸浓度呈显著负相关(r=-0.996,P=0.037);HMGCR的mRNA相对表达量与瘤胃乙酸浓度呈显著正相关(r=0.998,P=0.037)。其他VFA吸收代谢相关基因mRNA相对表达量与瘤胃pH、VFA浓度、瘤胃上皮细胞VFA吸收率无显著相关性(P>0.05)。
图2 对照组瘤胃pH、VFA浓度和瘤胃上皮细胞VFA吸收率与VFA吸收代谢基因mRNA相对表达量的相关性分析

红色代表正相关,蓝色代表负相关。*代表|r|>0.995,P<0.05。下图同。

Fig.2 Correlation analysis among rumen pH, VFA concentration and rumen epithelial VFA absorption rate and mRNA relative expression levels of VFA absorption and metabolism related genes in control group

Red represented positive correlation, and blue represented negative correlation. * represented |r|>0.995, P<0.05. The same as below.

由图3可知,在SARA组中,瘤胃上皮细胞NHE1的mRNA相对表达量与瘤胃pH呈显著负相关(r=0.997,P=0.047),MCT1的mRNA相对表达量与瘤胃丙酸浓度呈显著正相关(r=0.999,P=0.026);ACAT1的mRNA相对表达量与瘤胃丁酸浓度呈显著正相关(r=1.000,P=0.012);HMGCR的mRNA相对表达量与瘤胃上皮细胞丙酸吸收率呈显著正相关(r=0.999,P=0.027)。其他VFA吸收代谢相关基因mRNA相对表达量与瘤胃pH、VFA浓度、瘤胃上皮细胞VFA吸收率无显著相关性(P>0.05)。
图3 SARA组瘤胃pH、VFA浓度和瘤胃上皮细胞VFA吸收率与VFA吸收代谢基因mRNA相对表达量的相关性分析

Fig.3 Correlation analysis among rumen pH, VFA concentration and rumen epithelial VFA absorption rate and mRNA relative expression levels of VFA absorption and metabolism related genes in SARA group

3 讨论

3.1 SARA对瘤胃上皮细胞VFA吸收相关基因mRNA相对表达量的影响

瘤胃是反刍动物特有的器官,具有营养物质吸收、运输、代谢和保护宿主等多种功能,其中包含VFA的高效吸收和代谢、维持瘤胃内环境稳态、为宿主提供能量。VFA在瘤胃内主要以2种形式存在,即离子和非离子形式,非离子形式的VFA可以通过脂溶性扩散被瘤胃上皮细胞吸收,而离子形式的VFA吸收主要通过被动扩散和载体介导的转运机制,载体介导的机制主要包括依赖于碳酸氢盐和不依赖于碳酸氢盐机制、单羧酸盐转运体和阴离子通道等[8]。VFA作为一种弱酸性物质,其解离常数(pKa)大约为4.8。在本试验条件下,VFA大部分以离子形态存在,需要载体转运进入瘤胃上皮细胞进而被吸收代谢。PAT1和DRA可以将瘤胃腔内的VFA离子与上皮细胞内的氯离子(Cl-)或碳酸氢根离子(HC O 3 -)进行交换,进入上皮细胞内的VFA离子一部分代谢生成乳酸、酮体等,被MCT1转运进入血液后在组织中储存或者进一步代谢为机体提供能量,另一部分VFA离子则被位于瘤胃上皮细胞基底部的AE2转运到血液中,同时又将血液中的HC O 3 -运送进入上皮细胞内中和氢离子(H+)维持瘤胃上皮细胞内的酸碱平衡[9]。Ahmad等[10]研究发现,随着饲粮能量水平的升高,牦牛瘤胃上皮细胞VFA吸收转运基因MCT1、DRA、PAT1和AE2的mRNA相对表达量随之升高。同样,杨超[11]也发现提高饲粮能量水平,牦牛瘤胃上皮细胞VFA吸收转运基因MCT1、AE2、DRA和PAT1的mRNA以及蛋白相对表达量均显著上调。本研究结果显示,与对照组相比,SARA组瘤胃上皮细胞MCT1、DRA的mRNA相对表达量和MCT2、AE2的mRNA和蛋白相对表达量显著上调。这可能是因为奶山羊发生SARA时伴随着瘤胃VFA浓度升高,促进了瘤胃上皮细胞VFA转运蛋白的mRNA表达,加快VFA转运排出。
此外,AE2可以将胞外的HC O 3 -和VFA离子进行交换,中和瘤胃上皮细胞内过多的H+,维持瘤胃上皮细胞内pH稳态。但也有一些研究报道,当奶牛发生SARA时可能会抑制瘤胃上皮细胞MCT1的蛋白表达,不能及时转运瘤胃内多余的VFA,导致瘤胃pH进一步下降,进而加重SARA的严重程度[12-13]。这与本试验的研究结果不一致,究其原因可能与MCT1在奶牛和奶山羊瘤胃上皮细胞中表达存在差异以及不同动物SARA耐受性不同等因素有关。瘤胃上皮细胞NHE蛋白催化胞外钠离子(Na+)和胞内H+的交换,对维持瘤胃上皮细胞内Na+和pH的稳态具有重要意义。耿雅丽等[14]研究发现,长期或短期饲喂高精料饲粮可显著上调奶山羊瘤胃上皮细胞NHE2、NHE3的mRNA相对表达量,但对NHE2的蛋白相对表达量无显著影响。侯红雁等[15]在体外研究中发现,肉牛瘤胃上皮细胞培养基中添加13.2 mol/L的VFA可以显著上调NHE1的mRNA相对表达量,加快了瘤胃上皮细胞VFA的转运,避免VFA过度累积降低瘤胃pH,有利于维持上皮细胞内稳态。此外,有研究表明,瘤胃上皮细胞NHE1的高表达与饲喂高精料呈高度相关,高浓度的VFA和酸性pH可以激活瘤胃上皮细胞NHE1基因的表达,有利于瘤胃上皮细胞内pH平衡[16]。本试验结果表明,SARA组瘤胃上皮细胞NHE1、NHE3、NHE4的蛋白相对表达量均显著高于对照组,其中NHE1、NHE3的mRNA相对表达量显著高于对照组。这可能是由于SARA组瘤胃内H+浓度较高促进了瘤胃上皮细胞NHE1、NHE3的转录与翻译过程。这与Schweigel等[17]和Etschmann等[18]的研究结果相一致,再次印证了瘤胃上皮细胞中pH的调节是由NHE1和NHE3介导。刘军花等[19]研究发现,山羊长期采食高精料饲粮会损伤瘤胃上皮细胞线粒体结构,引起能量供应不足,从而导致Na+/K+-ATPase的mRNA相对表达量升高。本研究结果与前人研究结果一致,SARA显著上调了瘤胃上皮细胞Na+/K+-ATPase的蛋白相对表达量。

3.2 SARA对瘤胃上皮细胞VFA代谢相关基因mRNA相对表达量的影响

瘤胃发酵产生的总挥发性脂肪酸约95%是乙酸、丙酸和丁酸。反刍动物瘤胃上皮细胞内代谢活动非常活跃,研究发现,瘤胃上皮细胞可以代谢掉约75%的丙酸和95%的丁酸[20]。VFA在上皮细胞内的代谢主要是由一系列短链酰基辅酶A合成酶调控转化为乙酰辅酶A,乙酰辅酶A乙酰转移酶(ACAT)和HMGCS将乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA),HMG-CoA是瘤胃上皮细胞的中心代谢物[21]。瘤胃上皮细胞代谢主要表现为生酮效应,将VFA转化为酮体,为机体提供能量[22]。ACAT1以长链脂肪酸和游离胆固醇为底物催化胆固醇酯的形成,参与维持动物机体内胆固醇平衡[23]。在本研究结果中,SARA能显著提高瘤胃上皮细胞ACAT1的蛋白相对表达量。这与耿雅丽[14]研究结果一致。
HMGCS2是酮体合成的关键酶,在瘤胃上皮细胞VFA的代谢中都起着重要作用。Ma等[24]研究发现,提高奶牛饲粮中性洗涤纤维/淀粉比能显著下调瘤胃上皮细胞VFA代谢基因HMGCS2的mRNA相对表达量,而ACSS1、ACSS2、ACSS3和HMGCL的mRNA相对表达量不受饲粮组成的影响。庄一民[25]通过给羔羊补饲颗粒料发现,从28日龄开始瘤胃上皮细胞HMGCS2、HMGCL的mRNA相对表达量显著上调,于56日龄达到峰值。Kato等[26]也报道,与断奶前犊牛相比,在犊牛断奶后补饲精料可以显著提高瘤胃上皮细胞HMGCS2基因的相对表达量。本研究结果与上述研究结果基本一致,在本研究中,SARA能显著上调瘤胃上皮细胞HMGCS2的mRNA相对表达量,说明随着饲粮中非纤维性碳水化合物比例增加,可以提高瘤胃上皮细胞对VFA的代谢能力,促进酮体产生,进而排出瘤胃内蓄积的VFA。除了生酮作用外,胆固醇合成也是瘤胃上皮细胞代谢VFA的重要途径之一[27],HMGCR、HMGCS1可以催化瘤胃上皮细胞合成胆固醇,本试验结果显示,SARA组瘤胃上皮细胞HMGCR、HMGCS1的mRNA相对表达量均极显著高于对照组。以上结果说明,SARA可以通过促进瘤胃上皮细胞酮体以及胆固醇合成途径提高VFA的代谢能力,从而调控酮体和胆固醇代谢,为机体提供重要的能量来源。酰基辅酶A短链合成酶(ACSS)家族主要催化瘤胃上皮细胞对乙酸和丙酸的代谢,ACSS1、ACSS2、ACSS3是ACSS的3个亚型[28]。翁秀秀[29]研究表明,高精料饲粮能显著下调瘤胃上皮细胞ACSS1的mRNA相对表达量,这与本研究结果基本一致。本研究结果表明,SARA能显著下调瘤胃上皮细胞ACSS1和ACSS3的mRNA相对表达量,显著上调瘤胃上皮细胞ACSS2的mRNA相对表达量,并显著上调ACSS2、ACSS3、HMGCL的蛋白相对表达量。这说明SARA可以通过调节瘤胃上皮细胞的VFA相关代谢基因的表达维持瘤胃内环境稳恒。

3.3 瘤胃上皮细胞VFA吸收代谢相关基因mRNA相对表达量与瘤胃发酵参数、瘤胃上皮细胞VFA吸收率的相关性分析

VFA的吸收代谢是反刍动物获取能量的一种关键形式,为反刍动物提供了大约70%的代谢能,用于生长和产奶等生产需要[30]。影响瘤胃上皮细胞VFA吸收代谢相关基因表达的因素有很多,例如饲粮组成、瘤胃上皮细胞形态、瘤胃pH、VFA浓度以及瘤胃上皮细胞VFA吸收率等。本研究结果表明,对照组中瘤胃上皮细胞MCT1的mRNA相对表达量与瘤胃pH呈显著负相关,而SARA组中瘤胃上皮细胞NHE1的mRNA相对表达量与瘤胃pH呈显著负相关。这说明SARA会改变调节瘤胃上皮细胞内pH的关键基因,NHE1主要在瘤胃pH下降时发挥作用,将多余的H+转运出上皮细胞以维持上皮细胞内环境稳态,而正常生理条件下则是MCT1参与维持pH稳态。SARA发生时瘤胃内有大量VFA蓄积,因此,瘤胃上皮细胞相关转运基因会加快对其吸收转运。
本研究结果显示,对照组中MCT4的mRNA相对表达量与瘤胃丁酸浓度呈显著正相关;而SARA组中DRA的mRNA相对表达量与瘤胃丁酸浓度呈显著正相关。这说明正常状态下丁酸的吸收主要依赖MCT4,而SARA状态下则是DRA负责转运瘤胃内的丁酸,这可能与SARA促进DRA在转录水平的表达有关。SARA组中MCT1的mRNA相对表达量与瘤胃丙酸浓度呈显著正相关,与瘤胃上皮细胞乙酸吸收率相关性不大,而对照组中MCT1的mRNA相对表达量与瘤胃上皮细胞乙酸吸收率呈显著负相关,与瘤胃丙酸浓度不具有显著相关性。这表明在正常生理状态和SARA状态下,MCT1基因负责转运不同的VFA,展现出不同的亲和性。VFA被转运进入瘤胃上皮细胞后主要参与瘤胃上皮细胞内代谢反应。在本试验中,SARA组中瘤胃上皮细胞HMGCR的mRNA相对表达量与瘤胃上皮细胞丙酸吸收率呈显著正相关,而对照组中与瘤胃乙酸浓度呈显著正相关。这表明当奶山羊处于SARA状态时,瘤胃上皮细胞HMGCR优先对丙酸进行代谢,而在正常生理状态下,HMGCR主要负责乙酸代谢。在本试验中,SARA组和对照组中瘤胃上皮细胞ACAT1的mRNA相对表达量与瘤胃丁酸浓度呈显著正相关,说明不论正常状态还是SARA状态下ACAT1都参与丁酸在瘤胃上皮细胞内的代谢反应。基于以上研究结果说明,瘤胃发酵参数以及瘤胃上皮细胞VFA吸收率与瘤胃上皮细胞VFA吸收代谢相关基因表达具有相互调节作用,且正常生理状态和SARA状态下瘤胃上皮细胞VFA吸收代谢相关基因表达具有一定的差异性,产生该差异的具体作用机制尚不明确,还需更深一步的研究。

4 结论

① SARA可以显著提高瘤胃上皮细胞VFA吸收代谢相关基因NHE1、NHE3、MCT1、DRA、ACSS2、HMGCS1、HMGCS2、HMGCR的mRNA相对表达量以及NHE1、NHE3、NHE4、MCT2、AE2、Na+/K+-ATPase、ACSS2、ACSS3、HMGCL、ACAT1的蛋白相对表达量,加快瘤胃上皮细胞对VFA的吸收代谢,缓解SARA对机体的损伤,这可能是机体发生疾病时的一种自我保护、自我修复机制。
② 瘤胃上皮细胞VFA吸收相关基因主要与瘤胃pH、丙酸浓度及瘤胃上皮细胞乙酸吸收率具有相关性;VFA代谢相关基因主要与瘤胃乙酸、丙酸、丁酸浓度及瘤胃上皮细胞丙酸、丁酸吸收率具有相关性,瘤胃发酵参数、瘤胃上皮细胞VFA吸收率与瘤胃上皮细胞VFA吸收代谢基因相互调节维持瘤胃内环境动态稳衡,有助于动物机体自我调节维持健康。

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