肝脏是调节机体糖、脂代谢稳定的重要器官,正常生理条件下,脂肪酸的氧化可为机体提供大量能量,但当机体过于肥胖或出现能量负平衡(negative energy balance,NEB)时,肝脏细胞的脂肪酸从头合成增加,脂质过氧化程度加重,同时,脂肪分解产生的甘油三酯在肝脏过度蓄积,导致肝细胞出现功能性损伤[1],严重时引发机体全身炎症反应[2]。例如肝脏是调控奶牛脂质代谢平衡的枢纽器官,酮病奶牛常出现能量负平衡现象,为弥补能量摄入不足,脂肪大量动员超过肝脏的氧化能力,导致脂代谢紊乱,如脂肪肝、氧化应激等的发生[2]。转录因子EB(transcription factor EB,TFEB)在脂质分解代谢的调节中起到关键作用[3],研究发现,正常情况下,磷酸化的TFEB与酪氨酸/色氨酸(Tyr/Trp)激酶受体紧密结合,保留在细胞质中,当营养缺乏导致NEB时,脂质代谢紊乱,随后TFEB去磷酸化易位进入细胞核,机体脂质分解代谢和自噬溶酶体途径的靶基因被激活,进而调节肝脏脂质代谢维持内环境平衡[4]。因此,研究TFEB调控肝脏脂代谢紊乱的作用机理,对于控制机体脂肪肝、解析肝脏相关疾病的分子机制具有现实意义。本文结合国内外研究进展,就TFEB的核质穿梭机制以及对肝脏脂代谢紊乱的调控作用进行综述。
1 TFEB的结构和功能简述
TFEB属于小眼畸形相关转录因子/转录因子E(microphthalmia-associated transcription factor/transcription factor E,MITF/TFE)的家族成员,其多个肽链相互折叠二聚化形成碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链(alkaline helical-loop-helical leucine zipper, bHLH-Zip),与该家族成员中的小眼畸形转录因子(MITF)、转录因子E3(transcription factor E3,TFE3)和转录因子EC(transcription factor EC,TFEC)结构高度类似[5]。不同的是,TEFB具有476个氨基酸残基,有1个富含脯氨酸(Pro)和谷氨酰胺(Gln)的结构域[6],与DNA结合后识别启动子M-box和E-box进而启动特定基因的转录。研究发现,TFEB主要通过对丝氨酸位点的磷酸化修饰和磷酸化的抑制调控特定基因的表达[7],进而起到修复DNA损伤[8]、影响多个溶酶体的生物生成[9]、调节机体炎症反应和细胞自噬等作用[3],维持细胞内环境稳态和生理功能。机体发生炎症反应时,钙离子信号通路持续激活TFEB,入核后诱导溶酶体发生内吞作用,促进人单核细胞中高糖介导的白细胞介素-1β(IL-1β)分泌[10]。Pastore等[11]研究表明,TFEB缺陷的细胞中,IL-1β、白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-27(IL-27)的分泌受到显著抑制。此外,TFEB还可提高机体中的过氧化物酶体增殖物激活物受体-α(peroxisome proliferator activator receptor-α, PPAR-α)表达量,间接减少活性氧(ROS)的产生,避免氧化应激[12]。有学者研究表明,高脂肪饮食的小鼠肝脏TFEB被敲除时,白色脂肪组织(white adipose tissue,WAT)动员速度减弱,肝脏对游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)吸收作用受到抑制,脂质合成增加,加重了肝脏脂代谢紊乱[13]。相反,肝脏脂肪组织的特异性TFEB过表达时,小鼠肝脏中的WAT脂解能力增强[13]。由此可见,TFEB的转录活性与肝脏脂代谢紊乱作用机理间存在直接关系。
2 TFEB的核质穿梭机制
机体出现脂代谢异常时,TFEB受到哺乳动物雷帕霉素复合物1(mammalian rapamycin complex 1,mTORC1)和细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)2种蛋白激酶的激活后导致其转录活性也随之增强[16]。此外,TFEB还受蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)、细胞外调节蛋白激酶2(extracellular regulatory protein kinase 2,ERK2)和丝裂原活化蛋白激酶4(mitogen-activated protein kinase 4,MAPK4)的磷酸化调节[17]。研究表明,生理条件下,mTORC1控制合成代谢与分解代谢的平衡,主要通过TFEB的丝氨酸(Ser)残基S144、S122、S211位点进行磷酸化修饰,维持TFEB在细胞质中的磷酸化状态。磷酸化的Ser残基S211位点还受分子伴侣14-3-3(molecular chaperones 14-3-3,MC14-3-3)的作用,进一步加强TFEB在细胞质中的定位[18]。相反,机体受到饥饿刺激时,TFEB的Ser残基S211位点和分子伴侣MC14-3-3解离,同时mTORC1与TFEB的Ser残基S144、S122、S211位点也进行分离,导致TFEB的磷酸化受到抑制,进而加速TFEB的核易位和溶酶体基因的表达[19]。此外,TFEB入核后还会与协调溶酶体表达和调控元件(coordinate lysosomal expression and regulation,CLEAR)结合,增强溶酶体下游靶基因的转录活性[20]。激活单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK),能加速哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路的抑制,从而抑制TFEB的磷酸化作用,促进核易位与入核后的重新定位[21]。另外,外源性氧化剂可导致机体ROS增加,主要通过溶酶体的钙离子通道黏脂蛋白1(calcium ion channel mucin 1,MCOLN1)特异性激活钙调磷酸酶,迫使TFEB的磷酸化受到抑制,使其易位入核[22],可见,当机体能量缺乏时,脂代谢紊乱诱导的氧化应激可能是TFEB入核发生的重要原因。近期研究表明,TFEB的N端含有小段高度进化的保守序列,这一保守序列被命名为核输出信号(nuclear export signals,NES),引导TFEB的入核后重新定位,TFEB的Ser残基S142和S138都在NES附近[23],因此推测这2个丝氨酸位点可能调控着TFEB的入核后重新定位,此外,有研究表明,和TFEB结合的靶基因也能对TFEB的表达进行负反馈调节[24],这可能说明TFEB存在自我调节机制。由上述可知,TFEB的核质穿梭过程受多种蛋白激酶调控,而整个过程主要包括入核后的转录、以及核输出和自我调节。
3 TFEB对肝脏脂代谢紊乱的调控作用
3.1 通过自噬-溶酶体途径对肝脏脂代谢紊乱的调节
大量研究表明,TFEB可调控溶酶体的合成与自噬[24-25],而溶酶体是维持机体脂代谢平衡的重要细胞器,机体脂质形成单层膜包被的脂滴后,和自噬相关蛋白结合形成自噬小体后被转运至溶酶体内降解[26⇓-28]。机体脂代谢紊乱时,TFEB被激活,从细胞质中转移至细胞核,可激发溶酶体蛋白基因的转录,上调溶酶体和自噬相关基因的表达,从而调节溶酶体功能,使细胞内的脂质转运到溶酶体内进行降解。Sha等[26]研究指出,TFEB已被视为自噬-溶酶体途径的主要激活剂,调控机体脂质分解代谢,但TFEB是否调控机体脂代谢特异性基因的表达还不清楚。自噬是真核细胞通过溶酶体降解回收,及时清除受损的细胞器和蛋白质的过程[29],这一现象首次由美国学者Ashford等[29]在1962年通过观察被胰高血糖素灌注的大鼠肝脏变化中发现。目前普遍认为,脂质分解代谢和细胞自噬以及溶酶体间存在着复杂的作用关系,尤其当能量缺乏和肝脏脂代谢紊乱发生时,TFEB通过自噬-溶酶体途径维持着细胞内环境稳态[30]。大量研究发现,TFEB能显著提高人和大鼠的肝细胞自噬水平,进而改善肝细胞的损伤和脂质代谢能力[31⇓-33]。通常认为,细胞自噬过程中,首先形成自噬起始复合物、随后双层膜构成的自噬体形成,最终与溶酶体融合,从而调节脂肪肝代谢[33]。已有研究表明,自噬小体标记物LC3在自噬体的形成中起到至关作用,与泛素偶联底物作用后,可使脂肪细胞在溶酶体中发生降解[7]。基于此,可见肝脏中TFEB与脂质自噬以及溶酶体三者进行互作能够调控肝脏脂代谢。
3.2 TFEB对胰岛素敏感性的改善作用
当胰岛素作用的靶组织对生理浓度的胰岛素敏感性降低时,会引起糖、脂代谢紊乱,这一现象称为胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)。大量研究表明,IR与脂代谢紊乱、线粒体功能损伤和细胞自噬有密不可分的联系[33]。而TEFB通过对IR进行调节,可进一步改善胰岛素的敏感性。
肝脏脂代谢紊乱可引起肝细胞氧化应激,产生大量ROS或能量缺乏诱使细胞损伤、破裂,从而被自噬泡包裹成自噬体,与溶酶体结合后发生降解反应,这一过程又受到TFEB调控[28]。Lim等[27]通过高通量测序筛选出了35种可以增强自噬活性的化学物质,构建细胞模型发现MSL[4-(4 fluorophenyl)sulfonyl-5-methylthio-2-phenyloxazole]可在溶酶体途径中增强细胞自噬,显著诱导TFEB的核易位,加速脂质分解代谢。MSL处理含有棕榈酸(PA)和油酸(OA)组合的细胞时,观察发现细胞脂滴的清除过程加速[34]。有研究还发现,给糖尿病小鼠注射具有自噬增强作用的小分子MSL时,可使其肝细胞TEFB的磷酸化受到抑制,自噬相关基因(ATG)mRNA表达量上调,胰岛素敏感性增强,IR得到改善[27]。这与Qian等[34]的研究结果一致。ATG缺乏的小鼠,会导致胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrates-1,IRS-1)的Tyr磷酸化水平降低[34]。但也有研究表明,高糖高脂饮食的小鼠,发生IR的同时TEFB转录活性降低,肝细胞自噬明显受到抑制[35]。这说明脂代谢紊乱时,IR受TFEB调控的细胞自噬影响。此外,IR还与线粒体的功能密切相关,研究表明,TEFB的去磷酸化水平可增加肝细胞中线粒体的体积和数量[36],改善胰岛素的敏感性。部分线粒体相关基因,如环氧合酶4(cyclooxygenase 4,COX4)、胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)是TEFB的下游靶基因,通过TEFB的过表达,促进了小鼠线粒体的合成[37]。但TEFB如何调控机体肝脏脂代谢紊乱中的胰岛素敏感性,以及TEFB如何改善胰岛素敏感性的作用机制目前并不明确。
4 TFEB对酮病奶牛的肝脏脂代谢可能的调控作用
酮病是高产奶牛的一种高发性营养代谢病,根据有无临床症状分为亚临床酮病(SCK)和临床型酮病(CK)。全球奶牛在2021年时的SCK患病率高达22.7%[38],不仅显著影响奶牛的生产性能,还诱发多种并发症,如乳腺炎、子宫炎、真胃移位和肝脏脂代谢紊乱等[39],每年给中国奶牛场造成的经济损失高达11亿元[40]。肝脏对维持机体脂质代谢起着关键作用,例如酮病奶牛的NEB常伴随着脂肪肝的发生,而脂肪肝通常表现为脂质代谢紊乱、肝损伤、炎症和氧化应激等[40]。大量研究表明,酮病奶牛的脂代谢异常产生过量的非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acid,NEFA)和β-羟丁酸(β-hydroxybutyric aci,BHBA)引起脂毒性,进一步加重机体肝脏损伤和脂肪变性[1]。在非反刍动物中,TFEB主要通过自噬-溶酶体途径调节机体肝脏脂代谢紊乱,且TFEB已被确定为溶酶体功能的主调控因子[13]。最新研究发现,酮病奶牛的肝细胞中溶酶体含量明显降低,且肝脏中TFEB和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator 1α, PPARγC1α)的核丰度、总蛋白和mRNA丰度降低,磷酸化的TFEB含量升高[41],表明肝脏TFEB作用受损。Shen等[42]研究报道,酮病奶牛肝细胞中微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein-1 light chain 3,MAP1LC3)、自噬相关基因5(ATG5)和自噬相关基因7(ATG7)的mRNA表达量较健康奶牛明显降低,而酮病奶牛WAT中ATG5、ATG7和MAP1LC3是自噬小体形成的关键[43];Shen等[42]在试验中发现,CK奶牛和SCK奶牛的肝脏自噬体活性存在差异,这与Du等[44-45]的研究结果相似。CK奶牛患严重脂肪肝时,肝脏自噬活性受损[45],而这种自噬活性的抑制可能会加重肝脏中脂肪的累积。相反,SCK奶牛中脂肪肝代谢紊乱明显轻于CK奶牛,且自噬体活性增强时,可抑制脂肪肝代谢紊乱的发生。陈猛[46]最新研究发现,NEB引起奶牛轻度脂肪肝时,TEFB去磷酸化,入核后转录活性增强,刺激肝脏细胞发生脂质自噬。由此猜测,转录因子EB对酮病奶牛肝脏脂代谢可能存在着调控作用
5 小结
TFEB在肝细胞中的细胞质中与受体结合,处于磷酸化状态,当受到外界刺激,如能量缺乏引起机体NEB以及氧化应激时,磷酸化受到抑制,TFEB入核调节机体肝脏的脂代谢水平。目前对TFEB的研究主要集中在非反刍动物的肝脏相关疾病上,而对奶牛酮病引起的脂肪肝代谢紊乱方面研究还较少。因此,深入探讨TFEB的核质穿梭机制以及改善机体肝脏脂代谢的分子机理对家畜肝脏疾病(如酮病奶牛脂肪肝)的防治提供了新的研究思路。