溶菌酶(lysozyme),又称N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrase),是一种天然抗菌酶。Nicolle于1907年在对枯草芽孢杆菌中的溶解因子研究中首次发现溶菌酶的存在。1922年,Fleming[1]首次在人眼泪和唾液中发现了一种能够溶解细菌细胞壁杀死细菌的酶,称之为“溶菌酶”。1965年,Blake等[2]揭示了溶菌酶的三维立体结构,为溶菌酶的发展和应用奠定了基础。近年来,随着人们对溶菌酶分子结构、理化特性、作用机制等研究的进一步深入,其应用范围不断拓展,在畜牧、食品和医疗及相关行业中引起了人们广泛重视。
溶菌酶的生物活性作用主要是通过特异性水解细菌内肽聚糖的N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙酰葡萄糖胺(NAG)之间的β-1,4糖苷键直接发挥抗菌活性,或者通过间接刺激巨噬细胞来杀灭细菌[3-4]。溶菌酶在抗菌、消炎、抗病毒和免疫等方面表现出多重生物学功能,通过化学、物理、生物改性等方法对其进行分子修饰,其生物学功能进一步加强。欧盟食品添加剂标准(E1105)已将其视作具有抑菌、溶菌和杀菌活性的功能因子,且美国药物管理局将其列为常规安全组分,我国已允许将溶菌酶用作婴儿奶粉的添加剂,以提高婴儿肠道抗感染能力[5]。在畜牧养殖中,溶菌酶也已成为“减抗替抗”背景下重要的绿色饲用添加剂,在畜禽健康尤其是胃肠道健康以及畜产品安全方面发挥了重要作用。本文就溶菌酶的理化性质、生物学功能和作用机制及其在畜禽绿色生产中的应用研究进行综述,旨在为推动溶菌酶的开发和利用提供理论依据和参考。
1 溶菌酶的结构和理化性质
1.1 溶菌酶的基本结构和分类
1.2 溶菌酶的理化性质
溶菌酶是一种无毒、无副作用的高盐基蛋白,其纯品呈白色或微黄色的粉末状,易溶于水,不溶于有机溶剂,等电点高达10.7~11.0,可作为一种碱性酶水解细菌中的黏多糖成分。在酸性条件下,溶菌酶化学性质非常稳定,当pH在4~7变化时,其结构几乎不变。且酸性环境中溶菌酶对热的稳定性很强,并可长期保存,因此可在饲料中添加适量溶菌酶去防止霉变,延长贮存时间[8]。但当外界条件变化过于剧烈时,溶菌酶会发生氧化、水解等变化。
2 溶菌酶的生物学功能及其作用机制
2.1 抗菌作用
溶菌酶的抗菌作用可以分为催化和非催化2种模式[9]。催化模式中溶菌酶通过攻击、水解和破坏细菌细胞壁中肽聚糖(PG)的黏液多糖部分来发挥作用。PG单体是由双糖NAM和NAG以及4个氨基酸残基聚合而成的多层网状大分子结构。PG聚合物是由单个单体的NAM与NAG通过β-1,4糖苷键相连,并且相邻PG聚合物之间存在交联现象以增加细胞壁的抗拉强度。溶菌酶主要通过水解聚合物之间的β-1,4糖苷键以及部分肽键和酰胺键,使细胞骨架崩塌、细胞壁溶解,最终细菌细胞形成易受渗透胁迫作用影响的原生质体结构[10]。但不同细菌由于PG结构的差异,溶菌酶对它们的水解程度会有所不同,余海芬[11]发现革兰氏阴性菌(G-)相较于革兰氏阳性菌(G+),只有细胞壁内壁层为肽聚糖成分,且多被脂多糖包被,因此溶菌酶对G+细胞壁的水解能力强于G-。这种抗菌谱窄的现象,使得溶菌酶在动物生产的应用中存在局限性,因此常通过PG修饰和改性处理等方式来改变溶菌酶的分子结构,以扩大其适用范围。在非催化模式中,溶菌酶主要通过其阳离子性质发挥抗菌作用,这种阳离子特性使其能够与带负电荷的表面结合,从而扩大其活性,并且这种非酶的杀菌活性相较于水解活性对微生物的杀伤作用更大。Derde等[12]的研究表明,热变性使溶菌酶活性降低甚至失去酶活性,但却更具阳离子特性和疏水性二聚体形式,增强了其对G-的杀菌活性。
2.2 抗炎作用
溶菌酶的胞壁酰胺酶活性可以消化细菌PG以减少全身性过敏毒素的产生,从而限制病原体诱导的炎症反应[13-14]。研究显示,深海热液喷口虾的重组g型溶菌酶结合脂多糖(LPS)可降低LPS刺激的巨噬细胞中炎症基因的表达,还能够结合脂质A减少内毒素的释放[15]。此外,溶菌酶作为抗菌增效剂,在与一些抗生素等药物联合使用时,可增强这些抗生素的疗效,减少细菌溶解引起的内毒素释放,加速炎症酸性物质的失活和组织修复,从而表现出良好的消炎作用。梁爱华等[16]发现,溶菌酶和内酰胺类抗生素联合应用时,可调节肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的合成,刺激人淋巴细胞产生Ⅰ型干扰素[α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素(IFN-γ)]、白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-6(IL-6),内毒素血症得到极大缓解。此外,溶菌酶具有改善肠道炎症的功能。在右旋糖酐硫酸钠诱导的结肠炎猪模型中添加鸡蛋清溶菌酶,能够防止结肠隐窝变形和肌肉壁增厚,显著降低促炎因子IL-6、IFN-γ和TNF-α的含量以及白细胞介素-8(IL-8)的局部基因表达水平,溶菌酶通过直接调节参与炎症过程的基因在结肠的表达来发挥其抗炎作用,从而改善肠道组织学和通透性以缓解炎症反应[17]。目前关于溶菌酶改善肠道炎症的作用机制还不明确,有猜测认为溶菌酶通过协助肠道上皮屏障的保护,释放激活保护性肠道免疫反应的PG片段,以限制微生物群的入侵[18];同时,溶菌酶能以剂量依赖性方式抑制血清补体的溶血活性,这反映了溶菌酶相对于血清补体的新抗炎作用[19],但具体的作用机制还需要进一步研究。
2.3 免疫调节作用
溶菌酶作为先天性免疫系统中的重要防御物质,在特异性免疫和非特异性免疫中都可发挥重要作用。Murakami等[20]在无血清培养基中加入380 μg/mL的溶菌酶,杂交瘤HB4C5细胞的免疫球蛋白M(IgM)产量提高了13倍,人外周血淋巴细胞的IgM和免疫球蛋白G(IgG)产量分别提高了5.3和2.3倍,表明溶菌酶不仅刺激特异性杂交瘤系的免疫球蛋白产生,还刺激非特异性免疫球蛋白的产生。溶菌酶主要通过裂解细菌细胞壁,刺激多种免疫因子的合成和分泌,激发巨噬细胞的吞噬和消化能力,加速病原菌的清除来发挥免疫作用。当机体发生感染时,白细胞被激活导致其数量发生变化,从而影响溶菌酶的浓度,因此可通过检测溶菌酶浓度来判断动物患病情况[21]。若畜禽长时间受到病原菌的威胁,机体自身会产生相应的免疫应答反应,溶菌酶则可通过消除病原菌的方式抑制免疫应答反应[17]。此外,溶菌酶还能够促进T淋巴细胞等免疫细胞和免疫器官的发育,从而增强机体的特异性免疫能力,与非特异性免疫系统共同抵抗外源病原菌的入侵[22]。
2.4 抗病毒作用
溶菌酶在动物机体内具有中和病毒的作用。溶菌酶在pH接近中性的体液中水解带正电荷,与水解带负电荷的病毒外层的蛋白质在静电作用下相互吸引中和,使得病毒外层蛋白质结构发生变化,无法与宿主细胞膜结合,最后溶菌酶与病毒遗传物质发生化学反应,使病毒彻底失活。热变性处理后的溶菌酶,原蛋白质构象发生改变,但其表面正电荷增加,疏水性增强,抗病毒效果也显著增强[23]。经处理后的溶菌酶在乙醇中具有更加持久的活性,并且与一定浓度的乙醇可协同发挥抗菌抗病毒作用。清酒(酒精浓度15%~17%)中会产生一种叫做火落菌的乳酸菌,并能产生乳酸和令人不愉快的味道,在日本食品工业中常添加15 mg/kg的鸡蛋清溶菌酶于清酒中,从而与乙醇协同发挥防腐作用[24-25]。此外,溶菌酶还能与核糖核酸、脱氧核糖核酸和脱辅基蛋白等形成复盐,中和病毒并使其失活。重组人溶菌酶对新冠病毒有较高的抑制率,但关于溶菌酶是如何与新冠病毒的S蛋白结合,使其无法与人体细胞表面的血管紧张素转换酶2受体结合,以及如何与新冠病毒的遗传物质发生化学反应形成复盐,抑制冠状病毒的转录和翻译过程等问题[26],目前还没有相关报道。
3 溶菌酶在畜禽绿色生产中的应用研究
3.1 在家禽生产中的应用
饲粮中添加溶菌酶能够提高家禽的生长性能,降低肠道炎症的发病率,提高营养物质的吸收效率并改善肠道形态。Abdel-Latif等[27]的研究表明,在基础饲粮中添加90 g/t的外源溶菌酶时,可促进肉鸡的生长发育,改善肠道形态,提升非特异性免疫能力。Khalil等[28]通过在罗曼肉鸡日常饮用水中添加溶菌酶(4 L饮用水中加1 g溶菌酶)发现,其能够显著增加饲料系数,提高活体体重,增加血液中血红蛋白含量。Fan等[29]通过在生长中的黄羽雏鸡饲粮中添加500 mg/kg溶菌酶来与抗生素金霉素进行对比,结果发现溶菌酶对空肠屏障和4~24日龄黄羽雏鸡免疫力的影响与抗生素相当;并且,溶菌酶组血浆、空肠黏膜、脾脏和胸腺中二胺氧化酶的活性和炎症介质的含量降低,血浆和空肠黏膜中免疫球蛋白的含量增加,空肠黏膜中诱导性一氧化氮合酶和环加氧酶2的基因表达降低。
3.2 在猪生产中的应用
饲粮中添加溶菌酶能够缓解仔猪因断奶引起的消化性腹泻。仔猪腹泻主要是由于断奶后对饲粮不耐受,消化、免疫系统出现短暂功能障碍所引起。熊华武[30]在仔猪饲粮中分别添加50~400 mg/kg的溶菌酶,经研究发现,添加量为200、400 mg/kg的试验组相较于对照组,腹泻率分别降低13.3%和15%,日增重分别提高18.33%和23.3%。Huang等[31]饲喂仔猪含人重组溶菌酶的牛奶,结果发现仔猪肠道内共生细菌富集,黏膜免疫球蛋白A反应增加,这种强的黏液屏障作用可以防止产肠毒素大肠杆菌(ETEC)渗透到上皮细胞表面,从而降低仔猪对ETEC的感染,减少腹泻的方生。饲粮中添加溶菌酶还能够改善妊娠和泌乳母猪的健康状况,提高乳汁质量,改善缺乳问题。Xu等[32]在基础饲粮中分别添加150和300 g/t溶菌酶,母猪泌乳期的平均日采食量均增加,断奶至发情间隔缩短,母猪及其后代的健康水平显著提高。溶菌酶还能够显著改变母猪肠道微生物群的多样性和组成,提高代谢功能,增强免疫水平。Zhou等[33]通过研究发现,相较于对照组,1.0 kg/t的溶菌酶重建了不同属间相互作用,形成的肠道微生物群具有较少的交联,更多的正相关,更短的相互作用,并且嘧啶代谢、嘌呤代谢和氨基酸相关酶的表达显著上调。
3.3 在反刍动物生产中的应用
饲粮中添加溶菌酶对治疗奶牛子宫内膜炎和乳腺炎等产后疾病具有重要作用。奶牛子宫内膜炎主要是分娩后或流产后造成的损伤,使大肠杆菌、化脓性链球菌等细菌滋生,致使子宫内膜出现大量化脓性黏液的炎症反应。姚巍等[36]将复合溶菌酶制剂和抗生素治疗奶牛子宫内膜炎的效果进行了对比研究,发现复合溶菌酶制剂组奶牛子宫内膜炎治愈率以及治愈后第1情期受胎率均明显高于抗生素组;同时,复合溶菌酶制剂以其高针对性、强疗效、无残留的特点,缓解了其他药物引起的妊娠间隔延长、发情迟缓等问题,大大减少了经济损失。奶牛乳腺炎是一种常见的由金黄色葡萄球菌引发的病原性感染病,其能降低奶牛的生产性能和健康水平,同时也给产奶业带来巨大经济损失。Adduci等[37]用含有15%炼乳驴奶(溶菌酶含量825 mg/L)的试验配方奶粉在挤奶前清洗奶牛乳房,与2种抗生素氨苄西林(100 mg/mL)和卡那霉素(50 mg/mL)以及商业预浸渍配方的效果进行比较,发现驴奶溶菌酶对能够引起乳腺炎的微生物的抑制活性高于商业预浸渍配方,与2种抗生素相似。尹召华等[38]通过比较单独和联合注射重组人溶菌酶质粒与牛IFN-γ表达质粒对奶牛乳房炎的治疗效果发现,联合注射重组人溶菌酶和牛IFN-γ表达质粒对奶牛乳房炎具有更好的治疗效果。
3.4 在水产养殖中的应用
在鱼类等水产动物中可提取到部分种类的溶菌酶,其在先天免疫、抗菌等方面发挥着积极作用。从金鱼中克隆了2种c型溶菌酶(gfLyz-C1和gfLyz-C2),两者的重组蛋白表现出广谱抗菌特性,对标准种溶血分枝杆菌和大肠杆菌以及致病种副溶血性弧菌和迟发杆菌的溶菌和杀菌活性相当。在金鱼原代躯干肾细胞中,gfLyz-C1和gfLyz-C2转录本的表达被热灭活的大肠杆菌、副溶血性弧菌和迟发埃希达杆菌以及LPS上调,并通过地塞米松和瘦素治疗下调[39]。同时,饲料中添加溶菌酶对水产动物的生长性能和抗菌抗感染能力有显著影响。邢思华等[40]在基础饲料中分别添加0、100、200、300、400和500 mg/kg的溶菌酶饲喂草鱼,经对比研究发现,溶菌酶添加量为200~300 mg/kg时,草鱼的生长性能和抗感染能力达到最佳水平。此外,溶菌酶被开发为具有抗菌特性的可食用食品包装薄膜,这些可食用薄膜与其他生物分子(如海藻酸盐、壳聚糖、乳清蛋白和明胶)相结合,可改善食品包装,延长海鲜产品的储存时间[41]。
4 小结与展望
溶菌酶能够与细胞壁中的LPS相互作用,使细胞结构坍塌,同时还能消化细菌的PG,以限制炎症因子的产生,进而通过发挥特异性免疫和非特异性免疫来达到抗菌、消炎、抗病毒和免疫调节的作用。近年来,随着研究的深入,酶制剂添加剂的应用领域不断扩宽,溶菌酶等酶制剂在抗生素替代方面有了新的突破。作为一种新型绿色酶制剂,将其应用于畜牧生产,对畜禽的生产性能、繁殖性能、饲料报酬、免疫水平等指标均有明显改善作用,且不良反应小、使用方便,应用潜力巨大。
目前,我国溶菌酶的应用与研究仍处于起步阶段,溶菌酶对动物机体健康的影响以及在不同动物养殖中应用的作用效果和有效剂量仍需进一步研究。由于溶菌酶经高温、冷冻、干燥以及有机溶剂等处理后仍具酶活性,并且生产成本低,因此其相比于其他抗菌物质来说更具应用优势。但是溶菌酶的推广仍然存在提取工艺复杂、生产规模较小、抗菌图谱相对较窄、药理用途受到限制等问题,因此未来可以利用基因工程技术开发新的溶菌酶以降低成本、扩大生产规模,还可以在溶菌酶的提取方法以及改性处理上进一步深入研究,以打破溶菌酶的各方局限性,扩大其使用范围,使其能够在畜牧、食品和医药等领域中广泛使用。