在我国南方,夏季高温严重影响了畜牧业生产,由于畜禽遭受热应激侵害机体处于亚健康状态,生产肉蛋奶的数量及品质都在一定程度上有所下降。特别对于现代化、集约化高产动物而言,更容易受到热应激的影响。热应激动物采食量下降,消化能力降低,机体代谢紊乱,导致畜禽患病甚至死亡。在禁抗的大背景下,防治畜禽热应激除了加强通风、减少饲养密度和喷淋等传统物理方式外,也通过营养手段来提高动物机体自身的抗热应激能力。国内外科学研究的关注点放在了开发新型安全有效的饲料添加剂上,研究包括酸化剂、植物提取物[1]、益生菌、益生素、维生素和氨基酸等,或者几种添加剂联合使用[2]。丁酸是一种短链脂肪酸和酸化剂,可通过修复肠黏膜来调节肠道功能,并且通过增强巨噬细胞吞噬能力来提高机体免疫力,主要以丁酸盐和丁酸脂的形式在畜禽生产上使用[3]。以往国内外对丁酸钠[4]和γ-氨基丁酸[5]的研究报道较多,而近年来对三丁酸甘油酯(tributyrin,TB)的研究逐渐增多。理化性质稳定的TB安全无毒副作用,其在肠道被脂肪酶缓慢分解出的丁酸具有为肠道供能、调节肠道菌群平衡、保护肠道屏障等功能[6]。肠道是机体最大的免疫器官,给热应激动物补充丁酸能够改善肠道健康,提高免疫能力,从而起到缓解热应激的效果[7]。有研究已经证明,TB对畜禽热应激有缓解效果,在饲粮中添加TB能通过抑制高产奶牛炎性因子反应缓解热应激引起的氧化应激[7];仔猪饲用微囊化的TB后提高了抗氧化能力,促进了肠道乳酸菌等有益菌的增殖,提高了生长性能[8];添加1%的TB能够调节黄羽肉鸡体内蛋白质代谢并增加肠道绒毛高度,从而增强抗热应激能力[9]。本文主要对热应激影响动物机体代谢和TB调节畜禽健康进行综述,并对TB影响热应激的内在可能机制进行探讨,以期为TB缓解畜禽热应激的理论研究与应用提供参考。
1 热应激对畜禽的危害
1.1 热应激与肠道健康
热应激是指环境温度超过等热区上限后,畜禽受到高温刺激而产生的一系列非特异性反应,体温升高导致生理平衡被打破[10]。首先,热应激动物的消化吸收能力减弱,表现在消化酶与肠道绒毛形态的变化上。许多研究表明,热应激会降低肉鸡十二指肠、空肠、回肠等肠段的各种消化酶活性和含量,包括蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等[11⇓⇓-14]。小肠绒毛具有吸收养分的作用,绒毛高度(villus height,VH)和隐窝深度(crypt depth,CD)可以反映肠道形态和功能[15]。热应激会降低十二指肠、空肠、回肠的VH[11,13],降低VH/CD比值[14]。其次,热应激会破坏肠道屏障,增加肠道通透性,使病原体更易侵入畜禽机体。畜禽肠道完整性是肠道健康的基础,肠道单层柱状上皮细胞通过紧密连接形成屏障,表面由黏蛋白(mucin,MUC)、免疫球蛋白(Ig)和肠道菌群的一些代谢物等组成黏液层,具有抑菌、保护肠道健康的作用。紧密连接是40多种蛋白质组成的复杂屏障[16],包括闭锁蛋白(Occludin)、闭合蛋白家族(Claudins)、闭合小环蛋白-1(zonula occluden-1,ZO-1)和细胞骨架肌动蛋白等[17]。在对猪的研究中发现,热应激会下调肠道ZO-1、Claudin1、Claudin2、Claudin3和Occludin蛋白的表达水平[18-19]。最后,热应激使畜禽肠道菌群失衡进而影响胃肠道功能。肠道菌群本身会参与宿主对食糜的消化,同时也产生一些代谢物质影响宿主的肠道信号传导,进而调节机体代谢。大量研究表明,热应激会影响畜禽肠道微生物多样性和菌群结构。热应激肉鸡盲肠拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度下降会影响胆汁酸修饰[20]。高温湿热环境降低了娟姗牛肠道菌群的物种多样性,对丰富度影响却不大,通过代谢通路富集预测分析得出热应激对参与消化系统相关的菌属相对丰度影响最大[21]。热应激也改变了夏南牛肠道菌群Beta多样性,门水平上的变形菌门(Proteobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)的相对丰度有显著变化,同时对差异代谢物进行富集分析发现,热应激主要影响肠道营养物质的吸收、代谢和炎症[22]。
总之,热应激能够降低肠道各种消化酶活性,并影响小肠各肠段绒毛形态,导致机体消化吸收能力下降,畜禽营养物质摄入不足,从而影响代谢功能。热应激对肠道屏障的损害会降低畜禽肠道消化营养物质的能力[23]。热应激能够影响Occludin、Claudins和ZO-1等紧密连接蛋白的表达,进而破坏肠道完整性。热应激会改变畜禽的肠道菌群结构,尤其对参与消化吸收和炎症的菌群影响最大。
1.2 热应激与氧化应激
热应激造成畜禽机体氧化应激,并通过增强热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)的表达来保护机体。氧化应激是指机体内氧化物质与抗氧化物质失去平衡,氧化反应大于还原反应,而动物体内产生的活性氧(ROS)超过了抗氧化系统的清除能力,造成细胞损伤[24]。ROS可作为氧化应激剧烈程度的标志物。HSPs是一类高度保守的抗逆性蛋白家族,可保护细胞免受外界剧烈刺激的影响[25]。热应激会影响畜禽免疫、消化、繁殖、神经系统等各组织器官的HSPs表达,并且导致体内ROS含量上升,造成线粒体损伤而影响蛋白质、核酸等生物大分子物质的结构和功能。丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)是自由基攻击生物膜中多不饱和脂肪酸诱发的脂质过氧化反应主要代谢产物,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等都属于体内的抗氧化酶[26]。热应激会提高肉鸡肝脏中MDA含量、SOD活性并下调核因子E2相关因子2-Kelch样ECH关联蛋白1(Nrf2-Keap1)信号通路诱导肝脏损伤[27],还会降低肉鸡骨骼肌卫星细胞SOD活性、谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC),同时下调SOD、GSH-Px基因mRNA表达[28]。此外,热应激还能促进猪皮下和肌内前体脂肪细胞HSP60、HSP70和HSP90表达[29]以及猪骨骼肌中CAT、SOD表达,但对骨骼肌氧化部位HSP27、HSP70和HSP90表达的影响不大[30]。在对反刍动物的研究中发现,热应激上调荷斯坦牛血液免疫细胞中的HSP70、HSP90表达[31],会造成各阶段奶牛血清中MDA含量和SOD活性上升、T-AOC和GSH-Px活性下降[32]。另外,热应激诱导奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)提高热休克转录因子-1(HSF-1)、HSP70的mRNA表达量,且细胞中SOD和GSH-Px活性均降低,培养液中MDA含量升高[33]。热应激还会上调湖羊背最长肌中HSP60、HSP70、HSP110和血清中HSP70的mRNA表达量[34]。由上述研究得到,热应激降低畜禽的抗氧化能力而造成机体氧化应激,主要影响体内抗氧化酶系统和HSPs家族的表达。
1.3 热应激与免疫反应
热应激损害畜禽的免疫系统,影响机体炎症反应,抗病力下降。免疫细胞会分泌Ig、补体、抗体、细胞因子、黏附分子等具有免疫调节作用的分子[35]。免疫器官的生长发育可以判断畜禽免疫力强弱,胸腺、脾脏、法氏囊等器官的重量越大,细胞免疫和体液免疫的机能越强[36]。研究表明,热应激会降低肉鸡胸腺、脾脏、法氏囊等免疫器官的器官指数,血清中IgA、IgG和IgM的含量下降,白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-8含量升高[13]。促甲状腺激素受体(TSHR)基因G558R突变可能通过上调鸡细胞炎症反应及HSPs相关基因表达来调节热应激反应[37]。此外,热应激会增加奶牛胚胎肾细胞的细胞凋亡和自噬程度,而HSP90AA1基因能够起到抑制作用[38]。热应激可以诱导山羊小肠上皮细胞中IL-1β、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、IL-8和核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)的基因转录,增加IL-1β、IL-2、干扰素(interferon,IFN)-γ和TNF-α分泌[39]。总之,热应激可能会抑制畜禽免疫器官的生长发育,主要通过影响Ig、IL、TNF、IFN等免疫分子的分泌来诱导炎症反应。
1.4 热应激对畜产品品质的影响
热应激导致动物健康状况不佳,降低生产性能[40]。高温降低畜禽肉品质主要表现在肌内脂肪含量减少和肌纤维类型改变上。热应激改变了猪肉的脂肪含量和风味,通过影响腺苷酸活化蛋白激酶-沉默信息调节因子2相关酶1-过氧化物酶体增殖受体γ辅激活因子-1α(AMPK-SIRT1-PGC-1α)信号通路调控脂肪合成基因过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白α(CEBPα)、脂肪酸结合蛋白2(AP2)、脂肪酸合成酶(FAS)及脂肪分解基因脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)、脂蛋白脂肪酶(LPL),促进猪皮下脂肪沉积而抑制肌内脂肪生成,并加快这2种前体脂肪细胞凋亡[29]。除脂肪外,肌纤维类型也会因热应激而改变。肌纤维类型决定嫩度、肉色等特性,目前主要根据骨骼肌肌球蛋白重链的差异将其分为Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱx型和Ⅱb型肌纤维[41]。Ⅰ型肌纤维所占比例高时肉质更好,嫩度更高且肉色鲜亮,而在对猪、鸡上的研究均表明高温应激会抑制Ⅰ型肌纤维表达[42-43]。另外,热应激会损伤奶牛的乳腺健康,使产奶量和乳品质下降,对乳品质的影响主要表现在降低乳蛋白、乳脂和乳糖含量,甚至诱发乳房炎引起乳腺退化[44]。此外,热应激可造成畜禽繁殖能力严重下降,阻碍猪卵母细胞的成熟和发育[45]。总之,在养殖过程中热应激会影响畜禽生长发育、繁殖和肉蛋奶品质等诸多方面。
2 TB的性质与作用及其在畜禽生产中的应用
2.1 TB的性质与作用
TB是一种丁酸衍生物,由丁酸和甘油按3∶1的比例构成,分子式C15H26O6,相对分子质量302.36。在常温下理化性质相对稳定,呈白色油状,无特殊气味,难溶于水,易溶于乙醇等有机溶剂。TB已被应用于饲料、食品和医药等领域,具有促进畜禽肠道健康、抑制癌细胞生长和预防肝脏损伤等多种功能[46]。在饲料添加剂领域,将甘油与过量丁酸加热酯化合成TB,采用热喷制粒对其微囊化能够使颗粒大小均匀[47]。在对小鼠的研究中发现,TB不被胃液分解,在小肠中胰脂肪酶作用下缓慢分解释放出丁酸,为肠道提供能量[48]。此外,它还能抑制肠道有害菌增殖,TB分解过程中产生的丁酸甘油酯在畜禽后肠、盲肠中因其脂溶性可以穿透有害病原菌的细胞膜达到杀死它们的效果;丁酸释放的氢离子降低了肠道pH,创造出的酸性环境不利于大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌生存,而利于乳酸菌等有益菌增殖,这改善了肠道菌群组成结构[6]。
2.2 TB在畜禽生产中的应用
饲粮中添加TB对畜禽产生的影响颇多,主要集中在促生长、抗应激、改善肠道和提高免疫等功能上。朱荣生等[49]在仔猪饲粮中添加3种不同水平的TB,发现添加2 000~2 500 mg/kg TB可提高仔猪养分消化率、生长性能和免疫力,通过提高空肠和回肠的VH/CD比值改善肠道功能。有一些研究得出,TB并没有影响仔猪的生长性能[50],这可能由于品种或者试验条件不一致。另外,有研究表明,补充1 500 g/t TB能够通过改变断奶仔猪的生长性能、肠道形态、微生物群落和代谢产物来缓解断奶应激[51]。在家禽方面,饲粮添加250 mg/kg TB可以通过调节肉鸡的血液生化指标和盲肠菌群组成来改善肉鸡生长性能[52]。雷湘兰等[53]的研究也发现,散养文昌鸡饲粮中添加500 mg/kg TB能够提高平均日增重。在提高畜禽生长性能的同时,TB也能够对繁殖能力产生一定影响。产蛋率低的种鸡卵巢功能退化,表现为抗氧化能力下降和细胞凋亡率升高,而在饲粮中添加1 000 mg/kg TB可提高蛋品质,降低卵巢促凋亡相关基因Caspase 9表达,改善种鸡繁殖性能[54]。在反刍动物方面,绵羊体外瘤胃液发酵试验中发现,发酵底物额外添加0.15% TB可以促进瘤胃发酵功能[55],每头奶牛饲喂37.5 g/d TB能够缓解高产奶牛热应激,从而改善泌乳性能[7]。综上所述,动物饲粮中添加TB可以在一定程度改善畜禽生长发育、繁殖、免疫和肠道健康,并且在抗应激方面具有良好效果。
除单独添加TB外,与其他添加剂联合使用可能会产生更好的效果,近年来,国内外对联合使用TB的研究较多。在对肉仔鸡的研究中发现,饲粮添加1 000 mg/kg TB和1 000 mg/kg氧化苦参碱复合物能够提高生长性能、机体抗氧化能力,改善肠道结构[56]。黄羽肉鸡饲粮中添加400 g/t博落回和1 000 g/t TB能够替代40 g/t亚甲基水杨酸杆菌肽(BMD),提高生长和免疫性能,改善空肠健康,且联合使用比单独饲喂效果更好[9]。郝小倩[57]对白羽肉鸡的研究发现,添加氨基酸螯合微量元素和TB复方纳米乳在改善生长性能、养分表观消化率、抗氧化和盲肠微生物菌群的效果比单独使用20 mg/kg TB或氨基酸螯合微量元素更好。断奶仔猪饲粮中添加1 400 mg/kg TB配伍精油(600 mg/kg牛至油或水杨酸甲酯)在一定程度上改善肠道形态结构,调节肠道菌群和差异代谢产物,促进仔猪健康[58]。犊牛哺乳期添加0.15% TB、0.015%精油的混合物显著提高生长性能,改善断奶应激引起的腹泻,而生长期间添加的影响不大[59]。而在绵羊饲粮中单独添加0.15% TB、0.03%抗菌肽,能促进瘤胃液体外发酵功能,同时添加却不利于瘤胃液体外发酵[55]。由上述研究得到,在畜禽饲粮中添加TB时联合其他添加剂可能比单独添加的效果更好[60],但是也有部分研究表明,几种添加剂之间相互影响导致同时添加的效果更差[55],在联合使用TB时要慎重考虑它们之间的配伍禁忌和配比关系。
3 TB调控畜禽热应激的可能机制
3.1 促进肠道健康
畜禽补充TB可以改善肠道屏障和胃肠道微生物区系组成,从而促进肠道健康来调控热应激。首先,饲粮中添加TB能够改善畜禽肠道上皮结构完整性。研究表明,在断奶仔猪饲粮中添加TB能够提高回肠VH/CD比值和Occludin蛋白的表达水平,说明TB具有改善肠道绒毛形态和紧密连接结构的功能[51]。此外,有研究表示,添加TB会降低猪空肠中Claudin1、回肠Occludin和结肠紧密连接蛋白的mRNA表达水平,这表明TB可以影响肠道的紧密连接相关基因的表达[50]。Wang等[61]的研究也表示,添加TB可以改善断奶仔猪肠道形态,通过增加跨上皮电阻(transepithelial electrical resistance,TER)和减少葡聚糖的细胞旁通量4(paracellular flux of dextran 4,FD4)调节肠道屏障,并增加了空肠和结肠中乳酸杆菌、大肠杆菌的比例。在断奶仔猪饲粮中添加0.2% TB能够显著影响肠道微生物区系结构,增加了颤螺菌属(Oscillospira)、颤杆菌属(Oscillibacter)、Mucispirillum和丁酸弧菌属(Butyrivibrio)等菌属的相对丰度,这些菌属与动物平均日增重(average daily gain,ADG)和体重呈正相关[62]。肠道菌群能够影响肠道功能,所以当肠道优势菌群改变,机体的肠道功能也发生了变化。以上研究均证明了TB能够提高猪肠道有益菌属的比例。另外,在对家禽的研究中发现,添加TB显著提高22~42日龄肉鸡十二指肠VH和回肠绒毛宽度[63]。Hu等[64]的研究也得到类似结果,添加TB提高了爱拔益加(AA)肉鸡的ADG,肠道VH和VH/CD比例提高,也增加了回肠乳杆菌属(Lactobacillus)、盲肠芽孢杆菌属(Bacillus)比例,这说明TB显著改善肉鸡的肠道形态和有益菌比例。此外,添加TB能够改善黄羽肉鸡盲肠菌群组成,提高拟杆菌门并降低厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度[52]。综上所述,畜禽饲粮中添加TB能够改善肠道上皮结构和增加肠道中有益菌的比例,可能通过改善热应激动物的肠道健康来调控机体的正常代谢。
3.2 减少氧化应激
畜禽补充TB能够提高畜禽抗氧化能力,减轻氧化应激水平。Wang等[65]在TB应对敌草畏攻毒猪的研究中发现,饲粮添加750 mg/kg TB显著提高了攻毒猪血清中的T-AOC和SOD活性,降低血清中的MDA含量,在一定程度说明TB能够提高猪的抗氧化能力。断奶仔猪饲粮添加TB降低了空肠MDA和过氧化氢含量,通过降低ROS含量和提高线粒体DNA含量、膜电位来增强线粒体功能[66],这说明TB能够减轻断奶仔猪的氧化应激水平。结合珠蛋白(haptoglobin,Hp)具有调控机体免疫性能的作用[67]。内皮素(endothelin,ET)能促进氧化自由基[68]。Liu等[69]使用添加TB的巴氏杀菌牛乳饲喂犊牛发现其对缓解犊牛的氧化应激和炎症状态具有积极影响,添加TB后犊牛血液中的Hp、ET和IL-1β含量均降低,但对IL-6、TNF-α含量的影响不大。综上所述,添加TB能够缓解畜禽氧化应激,机体各器官和血液中的氧化物质减少,抗氧化酶的活性增强,TB可能通过提高机体抗氧化能力来减轻热应激造成的氧化应激损伤。
3.3 影响炎症反应
饲粮中添加TB可能通过下调炎症因子、免疫蛋白的表达来缓解热应激造成的严重炎症反应。高产奶牛极易受热应激影响,而在奶牛饲粮中添加过瘤胃TB的研究表明,其能降低TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA相对表达量以及血液中天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性及总胆红素(TBIL)、肌酐(CRE)、白蛋白(ALB)和球蛋白(GLO)的含量,并且可通过抑制丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)、核因子-κB(NF-кB)信号通路减轻淋巴细胞炎症反应,这表明TB可以通过减轻淋巴细胞的炎症反应来缓解热应激[70]。崔君[7]的研究中发现,TB能够缓解奶牛热应激造成的肝肾损伤和外周免疫细胞炎症反应,TB能在一定程度上降低热应激奶牛血液中白细胞总数、淋巴细胞数、中间细胞数和粒细胞数,且血液中的ALB、GLO、TBIL、CRE、尿素氮(UN)含量及AST活性均降低。在猪方面的研究表明,基础饲粮中添加1 750 mg/kg TB能提高猪十二指肠TNF-α和空肠IFN-γ基因的表达而下调结肠IFN-γ基因的表达,这说明TB可调节猪肠道炎症因子的基因表达[50]。Wang等[65]的研究也表示,TB可以减轻断奶仔猪肠道炎症,降低肠道TNF-α、IFN-γ和IL-6 mRNA表达量。TB还能提高肉鸡的免疫器官指数,影响血浆生化指标,升高血浆白蛋白/球蛋白(A/G)比值而降低尿酸含量及肌酸激酶(CK)活性[64]。综上所述,TB能够减轻严重炎症反应并改善机体抗炎状态,可能通过下调炎症因子和免疫细胞数目来减弱热应激诱发的过度炎症反应,从而减轻热应激对机体造成的损害。
4 小结与展望
热应激对畜禽的危害主要表现在影响动物采食及消化吸收、肠道菌群结构、氧化应激损伤和免疫炎症反应等方面,而TB作为一种短链脂肪酸酯具有抗氧化、促进肠道健康等作用。国内外已有许多研究表明,TB能够在一定程度上缓解畜禽热应激。TB可能通过影响肠绒毛、紧密连接等肠道屏障相关结构以及肠道菌群结构来改善肠道健康;TB能提高畜禽抗氧化能力,抵御热应激引起的氧化应激反应;TB也可能通过影响畜禽炎症反应相关因子和免疫蛋白来缓解热应激引起的炎症。总之,TB在缓解畜禽热应激问题上能起到一定作用,但具体机制并不明确。另外,不同制备方式得到的TB在机体消化分解的详细过程并不清楚,不同产品效果不一致。品种或生理阶段差异使最适宜添加剂量不能一概而论,在TB与其他添加剂联合使用时效果可能更佳,但需要考虑配伍比例及禁忌。未来在这些方面还需要进一步探索研究,为畜牧生产过程中使用TB提供更详细的理论指导。