Effects of Lonicera flos and Cnicus japonicus Extracts on Intestinal Barrier Function, Antioxidant Capacity and Cecal Microbe of Laying Hens in Late Laying Period

LIU Zhipeng; XU Pengtao; XU Huanhuan; ZHANG Zhengfan; LI Peng; DING Binying; GUO Shuangshuang; LI Lanlan

doi:10.12418/CJAN2023.474

2023 , Vol. 35 >Issue 8: 5117 - 5131

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2023.474

RESEARCH PAPER

Effects of Lonicera flos and Cnicus japonicus Extracts on Intestinal Barrier Function, Antioxidant Capacity and Cecal Microbe of Laying Hens in Late Laying Period

LIU Zhipeng ,
XU Pengtao ,
XU Huanhuan ,
ZHANG Zhengfan ,
LI Peng ,
DING Binying ,
GUO Shuangshuang ^,^* ,
LI Lanlan ^,^*

Expand

Hubei Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science, Engineering Research Center of Feed Protein Resources on Agricultural By-Products, Ministry of Education, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China

*GUO Shuangshuang, associate professor, E-mail: guo1shuangshuang@163.com;

LI Lanlan, lecturer, E-mail: lan_lanli@163.com

Received date: 2023-03-14

Online published: 2023-08-10

Fold

Abstract

This experiment was conducted to investigate the effects of different dietary levels of Lonicera flos and Cnicus japonicus extracts on intestinal barrier function, antioxidant capacity and cecal microbe of laying hens in late laying period. A total of 1 728 healthy 73-week-old Roman pink laying hens with similar body weight and laying rate were randomly divided into 4 groups with 18 replicates per group and 24 hens per replicate. Chickens in the four groups were fed the basal diets supplemented with 0 (control), 300, 500 and 1 000 mg/kg Lonicera flos and Cnicus japonicus extracts, respectively. The pretrial period lasted for 2 weeks and the experimental period lasted for 9 weeks. The results showed that, compared with the control group, dietary 300 mg/kg Lonicera flos and Cnicus japonicus extracts significantly increased the villus height and ratio of villus height to crypt depth (V/C) in ileum of hens at 78 weeks of age and V/C in jejunum at 83 weeks of age (P<0.05); dietary 500 mg/kg Lonicera flos and Cnicus japonicus extracts significantly increased the villus height and V/C in ileum at 83 weeks of age (P<0.05), significantly decreased the serum endotoxin content at 83 weeks of age (P<0.05), significantly increased the mRNA relative expression levels of occludin and mucin 2 (MUC2) in jejunum at 78 weeks of age was (P<0.05), significantly increased the mRNA relative expression levels of interferon-γ (IFN-γ) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) in jejunum at 83 weeks of age was (P<0.05), and significantly increased the Lactobacillus number in cecum at 83 weeks of age (P<0.05); dietary 1 000 mg/kg Lonicera flos and Cnicus japonicus extracts significantly increased the villus height in ileum at 78 weeks of age and the villus height and V/C in ileum at 83 weeks of age (P<0.05), significantly decreased the serum endotoxin content at 83 weeks of age (P<0.05), significantly increased the mRNA relative expression levels of occludin, MUC2 and E-cadherin in jejunum at 78 weeks of age were (P<0.05), and significantly increased the mRNA relative expression levels of IFN-γ and iNOS in jejunum at 83 weeks of age were (P<0.05); dietary 300, 500 and 1 000 mg/kg Lonicera flos and Cnicus japonicus extracts significantly increased the villus height in duodenum and the catalase (CAT) activity in jejunum at 83 weeks of age (P<0.05), and significantly decreased the malondialdehyde (MDA) content in jejunum at 78 and 83 weeks of age and the hydrogen peroxide (H₂O₂) in jejunum at 83 weeks of age were (P<0.05). In conclusion, dietary Lonicera flos and Cnicus japonicus extracts can improve intestinal barrier function by enhancing the immune function and antioxidant capacity in jejunum, and reduce the number of harmful bacteria and increase the number of beneficial bacteria in cecum, so as to improve intestinal health of laying hens. Under the conditions of this experiment, the optimal supplemental level of Lonicera flos and Cnicus japonicus extracts is 500 mg/kg.

Key words： Lonicera flos and Cnicus japonicus extracts; laying hens; intestinal barrier; antioxidant capacity; cecal microbe

Cite this article

LIU Zhipeng , XU Pengtao , XU Huanhuan , ZHANG Zhengfan , LI Peng , DING Binying , GUO Shuangshuang , LI Lanlan . Effects of Lonicera flos and Cnicus japonicus Extracts on Intestinal Barrier Function, Antioxidant Capacity and Cecal Microbe of Laying Hens in Late Laying Period[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2023 , 35(8) : 5117 -5131 . DOI: 10.12418/CJAN2023.474

随着我国畜禽养殖规模化、集约化的不断发展,在畜禽饲粮中添加抗生素可以增强动物自身免疫力,但却导致抗生素残留和细菌耐药性等问题,严重危害畜禽养殖环境和畜产品质量安全^[1]。作为抗生素的替代品,植物提取物因其安全无残留的特点成为科研工作者的研究重点。植物提取物是指根据不同的需求经过一系列生产工艺方法从植物中提取得到的含有一种或多种有效成分物质的总称^[2]。植物提取物种类众多,根据其生物活性成分可分为生物碱类、黄酮类、多糖类、皂苷类、有机酸类和挥发油类^[3]。

山银花和大蓟提取物的主要活性物质为绿原酸和黄酮,它们具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等作用^[4-5]。研究表明,绿原酸能够提高肉鸡肠道的抗氧化性能,并通过增加肠道有益菌的丰度和减少有害菌的丰度来调节肠道菌群^[6]。王亚文等^[7]研究表明,黄酮能刺激肠道黏膜增强机械和免疫屏障功能,维护肠道菌群稳态,抑制大肠杆菌活性,从而减少其对肠道黏膜的损伤。Fraschini等^[8]研究发现,黄酮可以通过提高细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性来减少活性氧含量,调节膜通透性,从而避免有害物质进入细胞。基于此,本试验通过在饲粮中添加山银花和大蓟提取物,探究其对产蛋后期蛋鸡肠道屏障功能、抗氧化能力和盲肠微生物的影响,从而为山银花和大蓟提取物在生产实际中作为饲料添加剂应用提供理论参考和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用山银花和大蓟提取物主要成分为绿原酸(≥100 mg/kg)和黄酮(>0.8%),由北京某科技股份有限公司提供。提取物由山银花和大蓟分别经过醇提和水提后,再经浓缩、脱色、柱层析、萃取和结晶等工艺制得,然后以1∶2的比例混合。

1.2 试验设计和饲养管理

试验选取1 728羽健康状况良好、体重及产蛋率相近的73周龄罗曼粉蛋鸡,随机分成4个组,每组18个重复,每个重复24只鸡。4组试验鸡分别饲喂在基础饲粮中添加0(对照)、300、500和1 000 mg/kg山银花和大蓟提取物的饲粮。蛋鸡基础饲粮按《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)配制,其组成及营养水平见表1。试验期共11周,其中预试期2周,正试期9周。蛋鸡采用全封闭式的4层阶梯式笼养(57 cm×57 cm×47 cm),每笼4羽,室内温度为(22±2) ℃,相对湿度为60%~70%,光照时间为16 h/d。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

原料Ingredients	含量Content	营养水平Nutrient levels²⁾	含量Content
玉米Corn	66.21	代谢能ME/(MJ/kg)	11.31
豆粕Soybean meal	21.00	干物质DM	88.69
大豆油Soybean oil	2.00	粗蛋白质CP	14.90
磷酸氢钙CaHPO₄	2.00	钙Ca	3.46
石粉Limestone	8.00	有效磷AP	0.44
氯化钠NaCl	0.30	赖氨酸Lys	0.80
DL-蛋氨酸DL-Met	0.10	蛋氨酸+半胱氨酸Met+Cys	0.62
L-赖氨酸L-Lys	0.10	蛋氨酸Met	0.35
氯化胆碱Choline chloride	0.10
预混料Permix¹⁾	0.19
合计Total	100.00

1)预混料为每千克基础饲粮提供 The premix provided the following per kg of the basal diet:VA 9 000 IU,VD₃ 3 500 IU,VE 20 IU,VK₃ 2 mg,VB₁ 5 mg,VB₂ 7 mg,VB₁₂ 0.02 mg,生物素 biotin 0.2 mg,叶酸 folic acid 1 mg,烟酸 niacin 45 mg,Mn 100 mg,Zn 75 mg,Fe 80 mg,Cu 8 mg,I 0.35 mg,Se 0.30 mg.

2)营养水平为计算值。Nutrient levels were calculated values.

1.3 样品采集

于78和83周龄末,分别随机从每组选取10只鸡进行翅静脉采血,静置在4 ℃下以3 000 r/min离心10 min分离血清,-20 ℃保存。试验鸡采血后屠宰,取十二指肠、空肠和回肠肠段中部约1 cm,置于预冷的4%多聚甲醛中固定;另取约10 cm空肠中段和盲肠食糜,置于液氮速冻,转移至-80 ℃冰箱保存待测。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 肠道形态

肠道固定样品送往武汉博士德生物工程有限公司进行石蜡包埋和切片处理,并进行苏木精-伊红(HE)染色。采用OLYMPSBX-41TF型光学显微镜观察肠道形态,每张切片选择8个走向平直且完整的绒毛,绒毛高度取绒毛顶端到隐窝开口距离,隐窝深度取隐窝开口到基底部距离,取平均值作为最终测定值,并计算绒毛高度/隐窝深度(V/C)值。

1.4.2 血清内毒素含量

通过检测血清内毒素含量来间接反映肠道屏障完整性,评价肠道功能。按照试剂盒说明书,利用鲎试剂盒(厦门鲎试剂实验厂有限公司)来检测血清内毒素含量。

1.4.3 空肠屏障和免疫相关基因表达

将空肠黏膜样品于液氮中研磨,采用TRIzol试剂(TaKaRa,大连)提取总RNA,并用NanoDrop微量分光光度计(ThermoFisher Scientific,美国)测定提取RNA的纯度和浓度。采用PrimeScript^® RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa, 大连)进行反转录,合成cDNA。采用SYBR^® Premix Ex Taq^TM试剂盒(TaKaRa,大连)在实时荧光定量PCR仪(ABI 7500,ThermoFisher Scientific,美国)上进行荧光定量PCR的测定,操作步骤参照说明书进行。检测的空肠屏障相关基因包括闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、闭合蛋白(occludin)、封闭蛋白-1(claudin-1)、封闭蛋白-2(claudin-2)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、黏蛋白2(MUC2)、黏蛋白5ac(MUC5ac)和绒毛蛋白(villin),检测的空肠免疫相关基因包括白细胞介素-1β(IL-1β)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS),以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因,目的基因的mRNA相对表达量采用2^-ΔΔCt法计算。基因引物序列见表2。

表2 引物序列

Table 2 Primer sequences

基因Genes	引物序列Primer sequences (5'—3')	登录号Accession No.
β-肌动蛋白β-actin	F:GAGAAATTGTGCGTGACATCA R:CCTGAACCTCTCATTGCCA	NM_205518
闭锁小带蛋白-1 ZO-1	F:CTTCAGGTGTTTCTCTTCCTCCTC R:CTGTGGTTTCATGGCTGGATC	XM_413773
闭合蛋白Occludin	F:ACGGCAGCACCTACCTCAA R:GGGCGAAGAAGCAGATGAG	D21837.1
封闭蛋白-1 Claudin-1	F:CATACTCCTGGGTCTGGTTGGT R:GACAGCCATCCGCATCTTCT	AY750897.1
封闭蛋白-2 Claudin-2	F:CAAGGACCGAGTGGCAGTG R:TTTGATGGAGGGCTGAGGA	NM_001277622
E-钙黏蛋白E-cadherin	F:CCTCCAGGATGTGAATGACAACG R:ATGCTCCAGTGCTGCCTTGAAG	XM_015292581.1
黏蛋白2 MUC2	F:TTCATGATGCCTGCTCTTGTG R:CCTGAGCCTTGGTACATTCTTGT	XM_421035
黏蛋白5ac MUC5ac	F:TGTGGTTGCTATGAGAATGGA R:TTGCCATGGTTTGTGCAT	XM_003641322.2
绒毛蛋白Villin	F:CAAGAGGCTACAGGAAGAGAATC R:CCAAGTGTCCAGCAGGTAAA	NM_001396564.1
白细胞介素-1β IL-1β	F:ATGAACGGCAAGCTTGGAGCTG R:TCCAAGCACACCTCTCTTCCATCC	AJAJ009800
干扰素-γ INF-γ	F:AGCTGACGGTGGACCTATTATT R:GGCTTTGCGCTGGATTC21	NM_205149
肿瘤坏死因子-α TNF-α	F:GAGCGTTGACTTGGCTGTC R:AAGCAACAACCAGCTATGCAC	NM_204267
诱导型一氧化氮合酶iNOS	F:CAGCTGATTGGGTGTGGAT R:TTTCTTTGGCCTACGGGTC	U46504

1.4.4 空肠抗氧化指标

将空肠黏膜样品于液氮中研磨,取部分样品与4 ℃生理盐水以质量比1∶9充分研磨混合,在4 ℃下以3 000 r/min离心10 min。采用比色法测定GSH-Px活性,采用羟胺法测定总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性,采用钼酸铵显色法测定过氧化氢酶(CAT)活性,采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量,采用比色法测定过氧化氢(H₂O₂)含量。试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.4.5 盲肠微生物数量

取0.2 g盲肠食糜,根据QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒(Qiagen,德国)说明书的方法提取盲肠食糜中细菌总DNA。对于单一细菌DNA,用PCR方法扩增以提高DNA浓度,PCR产物经DNA纯化试剂盒回收后,与质粒载体相连,然后导入大肠杆菌感受态细胞制作标准质粒。使用SYBR^® Premix Ex Taq^TM试剂盒(TaKaRa,大连)进行实时荧光定量PCR测定,微生物引物序列见表3。用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算样品的量。对未知样品进行定量时,根据未知样品的Ct值,即可计算出拷贝数。最后,食糜中微生物数量用log₁₀(拷贝数/g食糜)表示。DNA拷贝数的计算公式如下:

DNA(copies)={[6.03×10²³(copies/mol)×DNA量(g)]/[DNA分子量(g/mol)]}。

表3 微生物引物序列

Table 3 Microbial primer sequences

微生物 Microbes	引物序列 Primer sequences (5'—3')	标准曲线 Standard curve
产气荚膜梭菌Clostridium perfringens	F:AAAGATGGCATCATCATTCAAC R:TACCGTCATTATCTTCCCCAAA	y=-3.619 4x+44.568(R²=0.998 0)
大肠杆菌Escherichia coli	F:GTTAATACCTTTGCTCATTGA R:ACCAGGGTATCTAATCCTGT	y=-3.752 1x+46.991(R²=0.996 3)
乳酸杆菌Lactobacillus	F:AGCAGTAGGGAATCTTCCA R:CACCGCTACACATGGAG	y=-3.751x+43.271(R²=0.999 9)
沙门氏菌Salmonella	F:CGGCCCGATTTTCTCGG R:CGGCAATAGCGTCACCT	y=-3.650 2x+43.527(R²=0.995 0)

1.5 数据分析

试验数据采用SPSS 21.0进行单因素方差分析,当组间差异显著时,采用Duncan氏法进行多重比较,采用多项式对比对山银花和大蓟提取物水平和各指标进行线性和二次分析。P<0.05表示差异显著,结果用平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 山银花和大蓟提取物对产蛋后期蛋鸡肠道形态的影响

由表4可知,78周龄时,随着山银花和大蓟提取物添加水平的提高,蛋鸡十二指肠隐窝深度呈线性降低(P<0.05),回肠绒毛高度呈线性提高(P<0.05),回肠V/C值呈二次变化(P<0.05)。与对照组相比,饲粮添加300 mg/kg山银花和大蓟提取物显著提高回肠绒毛高度和V/C值(P<0.05),饲粮添加1 000 mg/kg山银花和大蓟提取物显著提高回肠绒毛高度(P<0.05)。83周龄时,随着山银花和大蓟提取物添加水平的提高,蛋鸡十二指肠绒毛高度呈二次变化(P<0.05),空肠绒毛高度和隐窝深度呈线性降低(P<0.05),回肠绒毛高度和V/C值呈线性提高(P<0.05)。与对照组相比,各山银花和大蓟提取物添加组十二指肠绒毛高度显著提高(P<0.05),饲粮添加300 mg/kg山银花和大蓟提取物显著提高空肠V/C值(P<0.05);饲粮添加500和1 000 mg/kg山银花和大蓟提取物显著降低空肠绒毛高度(P<0.05),显著提高回肠绒毛高度和V/C值(P<0.05)。

表4 山银花和大蓟提取物对产蛋后期蛋鸡肠道形态的影响

Table 4 Effects of Lonicera flos and Cnicus japonicus extracts on intestinal morphology of laying hens in late laying period

项目 Items	山银花和大蓟提取物添加水平 Lonicera flos and Cnicus japonicus extract supplemental levels/(mg/kg)									P值P-value
										处理 Treatment	线性 Linear	二次 Quadratic
	0(对照Control)		300		500		1 000			处理 Treatment	线性 Linear	二次 Quadratic
78周龄78 weeks of age
十二指肠Duodenum
绒毛高度 Villus height/μm		1 047.93±116.10		1 117.3±210.06		1 051.55±246.83		1 027.92±172.41		0.755	0.658	0.460
隐窝深度 Crypt depth/μm		131.20±14.52		133.12±22.01		120.87±25.49		111.50±25.48		0.140	0.035	0.439
绒毛高度/隐窝深度 V/C		8.06±1.19		8.53±1.78		8.87±1.83		9.37±1.05		0.300	0.060	0.971
空肠Jejunum
绒毛高度 Villus height/μm		939.47±223.63		1 040.05±235.20		1 028.12±270.96		932.86±172.18		0.633	0.926	0.199
隐窝深度 Crypt depth/μm		123.56±25.11		124.43±18.37		119.02±25.09		110.53±32.30		0.636	0.247	0.576
绒毛高度/隐窝深度 V/C		7.70±1.51		8.59±2.51		8.67±1.61		9.01±2.47		0.585	0.202	0.687
回肠Ileum
绒毛高度 Villus height/μm		506.35±188.52^b		744.23±71.24^a		632.92±109.88^ab		701.66±164.13^a		0.003	0.023	0.066
隐窝深度 Crypt depth/μm		83.45±26.91		81.51±13.49		82.71±16.22		91.36±12.63		0.618	0.340	0.365
绒毛高度/隐窝深度 V/C		6.24±1.87^b		9.41±2.15^a		7.98±2.16^ab		7.60±1.03^b		0.006	0.320	0.005
83周龄83 weeks of age
十二指肠Duodenum
绒毛高度 Villus height/μm		909.55±130.41^b		1 123.17±77.68^a		1 047.35±109.99^a		1 041.69±168.98^a		0.005	0.087	0.011
隐窝深度 Crypt depth/μm		122.22±43.10		115.19±27.07		134.97±27.88		144.77±15.22		0.170	0.056	0.400
绒毛高度/隐窝深度 V/C		8.67±3.97		10.28±2.58		8.03±1.64		7.28±1.52		0.106	0.107	0.183
空肠Jejunum
绒毛高度 Villus height/μm		1 087.53±110.62^a		1 101.36±229.60^a		750.56±225.90^b		823.90±113.90^b		<0.001	<0.001	0.628
隐窝深度 Crypt depth/μm		118.26±12.93		95.15±31.34		103.82±37.60		85.30±16.39		0.106	0.039	0.801
绒毛高度/隐窝深度 V/C		9.25±1.08^b		12.49±4.29^a		8.11±3.76^b		9.93±2.10^ab		0.031	0.630	0.502
回肠Ileum
绒毛高度 Villus height/μm	592.56±77.24^b		637.82±63.10^b		837.54±187.85^a		915.57±132.12^a		<0.001		<0.001	0.682
隐窝深度 Crypt depth/μm	80.80±16.57		77.54±15.84		78.86±16.14		84.67±10.15		0.756		0.557	0.365
绒毛高度/隐窝深度 V/C	7.49±0.96^b		8.62±2.66^b		10.92±2.77^a		10.91±1.66^a		0.002		<0.001	0.417

	同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05),相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。
	In the same row, values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same letter or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 山银花和大蓟提取物对产蛋后期蛋鸡血清内毒素含量的影响

由表5可知,78周龄时,蛋鸡血清内毒素含量随山银花和大蓟提取物添加水平的提高呈二次变化(P<0.05)。与对照组相比,饲粮添加500 mg/kg山银花和大蓟提取物显著提高血清内毒素含量(P<0.05)。83周龄时,蛋鸡血清内毒素含量随山银花和大蓟提取物添加水平的提高呈线性降低(P<0.05)。与对照组相比,饲粮添加500和1 000 mg/kg山银花和大蓟提取物显著降低血清内毒素含量(P<0.05)。

表5 山银花和大蓟提取物对产蛋后期蛋鸡血清内毒素含量的影响

Table 5 Effects of Lonicera flos and Cnicus japonicus extracts on serum endotoxin content of laying hens in late laying period EU/L

项目 Items	山银花和大蓟提取物添加水平 Lonicera flos and Cnicus japonicus extract supplemental levels/(mg/kg)								P值P-value
									处理 Treatment	线性 Linear	二次 Quadratic
	0(对照Control)		300		500		1 000		处理 Treatment	线性 Linear	二次 Quadratic
78周龄78 weeks of age
内毒素Endotoxin		38.10±10.73^b		37.79±8.73^b		51.81±8.86^a		37.48±8.59^b	0.003	0.375	0.026
83周龄83 weeks of age
内毒素Endotoxin		91.06±17.22^a		85.10±24.56^a		61.65±9.51^b		59.70±14.95^b	<0.001	<0.001	0.699

2.3 山银花和大蓟提取物对产蛋后期蛋鸡空肠屏障相关基因表达的影响

由表6可知,78周龄时,随着山银花和大蓟提取物添加水平的提高,蛋鸡空肠occludin和E-cadherin的mRNA相对表达量呈线性和二次变化(P<0.05),空肠ZO-1的mRNA相对表达量呈线性降低(P<0.05),空肠MUC2的mRNA相对表达量呈线性提高(P<0.05)。与对照组相比,饲粮添加1 000 mg/kg山银花和大蓟提取物显著降低空肠ZO-1的mRNA相对表达量(P<0.05),饲粮添加500和1 000 mg/kg山银花和大蓟提取物显著提高空肠occludin和MUC2的mRNA相对表达量(P<0.05),饲粮添加1 000 mg/kg山银花和大蓟提取物显著提高空肠E-cadherin的mRNA相对表达量(P<0.05)。83周龄时,随着山银花和大蓟提取物添加水平的提高,蛋鸡空肠ZO-1的mRNA相对表达量呈二次变化(P<0.05),空肠claudin-1的mRNA相对表达量呈线性和二次变化(P<0.05)。与对照组相比,各山银花和大蓟提取物添加组空肠claudin-1的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。

表6 山银花和大蓟提取物对产蛋后期蛋鸡空肠屏障相关基因表达的影响

Table 6 Effects of Lonicera flos and Cnicus japonicus extracts on jejunum barrier related gene expression of laying hens in late laying period

项目 Items	山银花和大蓟提取物添加水平 Lonicera flos and Cnicus japonicus extract supplemental levels/(mg/kg)								P值P-value
									处理 Treatment	线性 Linear	二次 Quadratic
	0(对照Control)		300		500		1 000		处理 Treatment	线性 Linear	二次 Quadratic
78周龄78 weeks of age
闭锁小带蛋白-1 ZO-1		1.02±0.20^a		0.99±0.24^a		0.91±0.19^ab		0.73±0.22^b	0.021	0.004	0.271
闭合蛋白 Occludin		1.04±0.32^c		1.23±0.52^bc		2.13±0.43^a		1.60±0.51^b	<0.001	0.001	0.023
封闭蛋白-1 Claudin-1		1.01±0.15		1.12±0.26		1.11±0.34		0.98±0.25	0.549	0.807	0.159
封闭蛋白-2 Claudin-2		1.06±0.38		0.78±0.47		1.12±0.36		1.29±0.39	0.068	0.095	0.098
E-钙黏蛋白 E-cadherin		1.07±0.43^bc		0.78±0.35^c		1.39±0.19^ab		1.77±0.66^a	<0.001	<0.001	0.023
黏蛋白2 MUC2		1.06±0.35^b		1.33±0.51^b		2.21±0.70^a		2.61±0.73^a	<0.001	<0.001	0.747
黏蛋白5ac MUC5ac		1.04±0.31		0.84±0.27		1.12±0.25		1.20±0.58	0.195	0.171	0.243
绒毛蛋白Villin		1.08±0.44		0.86±0.36		1.08±0.45		1.23±0.43	0.294	0.277	0.182
83周龄83 week
闭锁小带蛋白-1 ZO-1		1.01±0.28		0.77±0.18		0.81±0.24		1.01±0.28	0.068	0.892	0.009
闭合蛋白 Occludin		1.03±0.37		0.97±0.52		0.67±0.30		0.92±0.37	0.250	0.286	0.223
封闭蛋白-1 Claudin-1		1.01±0.16^a		0.22±0.07^c		0.27±0.13^c		0.66±0.30^b	<0.001	0.002	<0.001
封闭蛋白-2 Claudin-2		1.06±0.37		1.08±0.47		0.89±0.30		1.00±0.52	0.767	0.575	0.747
E-钙黏蛋白 E-cadherin		1.04±0.32		1.02±0.44		0.97±0.44		1.05±0.32	0.969	0.958	0.684
黏蛋白2 MUC2		1.08±0.53		1.33±0.84		1.19±0.71		1.11±0.44	0.847	0.962	0.442
黏蛋白5ac MUC5ac		1.04±0.31		1.21±0.53		1.11±0.46		1.36±0.32	0.392	0.168	0.798
绒毛蛋白Villin		1.04±0.32		1.27±0.53		0.95±0.41		1.11±0.38	0.406	0.849	0.810

2.4 山银花和大蓟提取物对产蛋后期蛋鸡空肠免疫相关基因表达的影响

由表7可知,78周龄时,随着山银花和大蓟提取物添加水平的提高,蛋鸡空肠TNF-α的mRNA相对表达量呈线性提高(P<0.05),空肠iNOS的mRNA相对表达量呈线性降低(P<0.05)。与对照组相比,饲粮添加500 mg/kg山银花和大蓟提取物显著降低空肠iNOS的mRNA相对表达量(P<0.05)。83周龄时,随着山银花和大蓟提取物添加水平的提高,蛋鸡空肠IL-1β的mRNA相对表达量呈二次变化(P<0.05),空肠IFN-γ、TNF-α和iNOS的mRNA相对表达量呈线性提高(P<0.05)。与对照组相比,饲粮添加500 mg/kg山银花和大蓟提取物显著提高空肠IL-1β的mRNA相对表达量(P<0.05),饲粮添加500和1 000 mg/kg山银花和大蓟提取物显著提高空肠IFN-γ和iNOS的mRNA相对表达量(P<0.05)。

表7 山银花和大蓟提取物对产蛋后期蛋鸡空肠免疫相关基因表达的影响

Table 7 Effects of Lonicera flos and Cnicus japonicus extracts on immune-related gene expression in jejunum of laying hens in late laying period

项目 Items	山银花和大蓟提取物添加水平 Lonicera flos and Cnicus japonicus extract supplemental levels/(mg/kg)								P值P-value
									处理 Treatment	线性 Linear	二次 Quadratic
	0(对照Control)		300		500		1 000		处理 Treatment	线性 Linear	二次 Quadratic
78周龄78 weeks of age
白细胞介素-1β IL-1β		1.10±0.49		1.50±0.53		1.03±0.36		1.39±0.38	0.125	0.536	0.879
干扰素-γ IFN-γ		1.07±0.59		1.13±0.49		0.70±0.20		1.26±0.75	0.216	0.848	0.193
肿瘤坏死因子-α TNF-α		1.02±0.20		1.17±0.43		1.11±0.51		1.43±0.44	0.146	0.048	0.523
诱导型一氧化氮合酶 iNOS		1.04±0.33^a		1.09±0.42^a		0.68±0.20^b		0.84±0.21^ab	0.023	0.024	0.606
83周龄83 weeks of age
白细胞介素-1β IL-1β		1.03±0.27^b		1.23±0.46^b		1.63±0.38^a		0.97±0.37^b	0.007	0.718	0.003
干扰素-γ IFN-γ		1.05±0.40^b		1.24±0.41^b		1.94±0.58^a		1.84±0.61^a	0.002	<0.001	0.416
肿瘤坏死因子-α TNF-α		1.01±0.17		1.19±0.47		1.15±0.29		1.40±0.33	0.103	0.025	0.721
诱导型一氧化氮合酶 iNOS		1.01±0.16^b		1.30±0.42^ab		1.66±0.51^a		1.61±0.50^a	0.007	0.001	0.217

2.5 山银花和大蓟提取物对产蛋后期蛋鸡空肠抗氧化指标的影响

由表8可知,78周龄时,随着山银花和大蓟提取物添加水平的提高,蛋鸡空肠CAT活性和MDA含量呈线性和二次变化(P<0.05),空肠GSH-Px和T-SOD活性呈线性降低(P<0.05)。与对照组相比,各山银花和大蓟提取物添加组空肠CAT活性和MDA含量显著降低(P<0.05),饲粮添加500和1 000 mg/kg山银花和大蓟提取物显著降低空肠T-SOD活性(P<0.05)。83周龄时,随着山银花和大蓟提取物添加水平的提高,蛋鸡空肠H₂O₂含量呈线性和二次变化(P<0.05),空肠CAT活性呈二次变化(P<0.05),空肠MDA含量呈线性降低(P<0.05)。与对照组相比,各山银花和大蓟提取物添加组空肠H₂O₂和MDA含量显著降低(P<0.05),空肠CAT活性显著提高(P<0.05)。

表8 山银花和大蓟提取物对产蛋后期蛋鸡空肠抗氧化指标的影响

Table 8 Effects of Lonicera flos and Cnicus japonicus extracts on antioxidant indices in jejunum of laying hens in late laying period

项目 Items	山银花和大蓟提取物添加水平 Lonicera flos and Cnicus japonicus extract added levels/(mg/kg)									P值P-value
										处理 Treatment	线性 Linear	二次 Quadratic
	0(对照Control)		300		500		1 000			处理 Treatment	线性 Linear	二次 Quadratic
78周龄78 weeks of age
过氧化氢 H₂O₂/(mmol/g prot)		23.69±4.50		21.44±5.60		18.72±4.34		21.54±4.43		0.175	0.203	0.110
过氧化氢酶 CAT/(U/mg prot)		6.34±1.43^a		4.51±0.67^b		3.93±0.58^b		4.32±0.78^b		<0.001	<0.001	0.001
谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px/(U/mg prot)		76.03±18.72		70.13±20.96		64.85±15.89		54.34±13.07		0.091	0.017	0.708
丙二醛 MDA/(nmol/mg prot)		2.23±0.42^a		1.79±0.30^b		1.63±0.31^b		1.72±0.18^b		0.001	0.001	0.011
总超氧化物歧化酶 T-SOD/(U/mg prot)	575.23±56.30^a		569.59±62.27^a		482.05±47.73^b		518.38±39.94^b		0.001		0.002	0.221
83周龄83 weeks of age
过氧化氢 H₂O₂/(mmol/g prot)	46.02±17.70^a		27.94±11.12^b		28.06±11.56^b		32.00±9.39^b		0.009		0.027	0.010
过氧化氢酶 CAT/(U/mg prot)	3.44±1.00^c		6.20±2.02^a		4.64±0.55^b		5.14±0.85^ab		<0.001		0.050	0.007
谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px/(U/mg prot)	66.55±21.39		82.54±17.05		74.17±17.24		67.32±21.00		0.293		0.842	0.089
丙二醛 MDA/(nmol/mg prot)	2.44±0.70^a		1.73±0.36^b		1.69±0.58^b		1.67±0.28^b		0.016		0.006	0.061
总超氧化物歧化酶 T-SOD/(U/mg prot)	613.83±71.13		585.42±68.64		587.56±52.94		563.61±73.43		0.436		0.130	0.919

2.6 山银花和大蓟提取物对产蛋后期蛋鸡盲肠微生物数量的影响

由表9可知,78周龄时,随着山银花和大蓟提取物添加水平的提高,蛋鸡盲肠产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)数量呈线性降低(P<0.05)。与对照组相比,饲粮添加500 mg/kg山银花和大蓟提取物显著减少盲肠乳酸杆菌(Lactobacillus)数量(P<0.05)。83周龄时,随着山银花和大蓟提取物添加水平的提高,蛋鸡盲肠乳酸杆菌数量呈线性提高(P<0.05)。与对照组相比,饲粮添加500 mg/kg山银花和大蓟提取物显著增加盲肠乳酸杆菌数量(P<0.05)。

表9 山银花和大蓟提取物对产蛋后期蛋鸡盲肠微生物数量的影响

Table 9 Effects of Lonicera flos and Cnicus japonicus extracts on microbe number in cecum of laying hens in late laying period log₁₀(copies/g)

项目 Items	山银花和大蓟提取物添加水平 Lonicera flos and Cnicus japonicus extract supplemental levels/(mg/kg)									P值P-value
										处理 Treatment	线性 Linear	二次 Quadratic
	0(对照Control)		300		500		1 000			处理 Treatment	线性 Linear	二次 Quadratic
78周龄78 weeks of age
产气荚膜梭菌 Clostridium perfringens		5.95±0.26		5.87±0.15		5.70±0.21		5.73±0.25		0.055	0.013	0.450
大肠杆菌 Escherichia coli		7.26±0.40		7.29±0.59		7.27±0.69		7.31±0.59		0.998	0.881	0.965
乳酸杆菌 Lactobacillus		7.28±0.43^a		7.43±0.47^a		6.66±0.54^b		7.21±0.44^a		0.005	0.150	0.197
沙门氏菌 Salmonella		6.31±0.17		6.14±0.33		5.83±0.82		6.08±0.32		0.184	0.143	0.166
83周龄83 weeks of age
产气荚膜梭菌 Clostridium perfringens		6.21±0.29		6.51±0.73		6.21±0.23		6.30±0.54		0.560	0.981	0.533
大肠杆菌 Escherichia coli	6.72±0.61		6.79±0.90		7.18±1.02		7.47±0.91		0.298		0.068	0.729
乳酸杆菌 Lactobacillus	7.62±0.44^bc		7.24±0.58^c		8.17±0.46^a		7.81±0.16^ab		0.001		0.038	0.956
沙门氏菌 Salmonella	5.96±0.19		6.02±0.11		5.97±0.08		5.85±0.12		0.089		0.085	0.058

3 讨论

3.1 山银花和大蓟提取物对产蛋后期蛋鸡肠道形态的影响

肠道黏膜结构的完整性是其有效利用饲粮营养物质、保证畜禽健康的基础,保持肠道健康对改善动物福利水平及保障人类食品安全具有重要意义。肠绒毛具有微生物屏障、化学屏障、机械屏障和免疫屏障^[9]。机械屏障不仅可以选择性允许小分子营养物质等通过肠腔进入到内环境参与机体内部循环,还可以防止毒素和病原体从胃肠道渗透到血液中^[10]。小肠绒毛高度、隐窝深度和V/C值是反映小肠对营养物质消化和吸收能力的重要指标^[11]。Liu等^[12]研究表明,饲粮中添加绿原酸可以提高氧化应激下肉鸡回肠绒毛高度和V/C值。Zhang等^[13]研究发现,绿原酸可以通过降低隐窝深度,提高十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度和V/C值,从而减轻产气荚膜梭菌感染造成的肠道损伤。刘晓静^[14]研究发现,饲喂富含黄酮类的植物性饲粮显著提高了肉鸡肠道绒毛高度。与前人研究结果相似,本试验中,饲粮添加山银花和大蓟提取物能够提高十二指肠和回肠绒毛高度与V/C值,降低隐窝深度,表明山银花和大蓟提取物可以促进绒毛生长,改善产蛋后期肠道黏膜完整性,进而改善肠道健康。

革兰氏阴性菌细胞壁成分是内毒素的主要来源,在肠道菌群紊乱或易位时,内毒素很容易穿过肠道屏障进入血液,所以血清内毒素含量常作为评价动物肠道屏障功能的指标之一^[15]。绿原酸可以抑制脂多糖(LPS)诱导的小鼠体内炎症小体的激活,降低血清内毒素含量^[16]。体外试验表明,黄酮类化合物对LPS有明显的中和作用^[17]。本试验中,饲粮添加山银花和大蓟提取物能够显著降低83周龄蛋鸡血清内毒素含量,可能是由于山银花和大蓟提取物改善了肠道形态和完整性,进而降低了血清内毒素含量。

3.2 山银花和大蓟提取物对产蛋后期蛋鸡空肠屏障相关基因表达的影响

细胞间的紧密连接结构是肠道屏障的重要结构基础,以保护肠道免受管腔内有害物质的侵害,这涉及肠上皮和黏膜层、紧密连接蛋白的相互作用,紧密连接蛋白调节肠上皮细胞的通透性,它们的构成可以反映肠道的完整性^[18]。紧密连接由包括occludin、封闭蛋白(claudin)和ZO-1等多种紧密连接蛋白组成^[19]。Liu等^[12]等研究表明,饲粮添加绿原酸可显著提高空肠中紧密连接蛋白的表达,从而改善肠道功能。Zhang等^[13]研究表明,绿原酸可以抑制肉鸡产气荚膜梭菌感染后肠道黏膜层结构和紧密连接损伤。黄酮类化合物可通过提高黏蛋白表达和增强杯状细胞的功能来改善黏液层屏障,从而发挥对肠道屏障的保护作用^[10]。本试验中,饲粮添加500 mg/kg山银花和大蓟提取物能提高蛋鸡空肠E-cadherin、MUC2和occludin的mRNA相对表达量,表明山银花和大蓟山银花和大蓟提取物能促进肠道紧密连接蛋白的表达,进而调控肠道屏障功能,从而改善肠道黏膜完整性。

3.3 山银花和大蓟提取物对产蛋后期蛋鸡空肠免疫相关基因表达的影响

细胞因子在免疫反应中起着重要作用,当肠道内环境紊乱时,会导致炎症因子的表达异常,从而导致免疫功能低下和病理性损伤^[20]。炎症是造成肠道上皮损伤的又一个重要因素,炎症因子的过度产生会直接破坏肠道上皮屏障结构的完整性,影响其屏障功能^[21]。TNF-α和IL-1β是介导炎症反应的关键细胞因子,并且两者会导致肠道黏膜紧密连接蛋白表达发生变化,引起肠道通透性增加^[22]。绿原酸具有抗炎作用,可以抑制促炎因子的表达,绿原酸对细胞Janus激酶(JAK)/信号转导与转录激活因子(STAT)和核因子-κB(NF-κB)信号通路中关键分子的表达具有一定抑制作用,并使这些信号通路在炎症反应中无法被激活,从而抑制滑膜细胞增殖^[23]。黄酮可通过影响细胞的有丝分裂、分泌过程以及细胞间的相互作用来发挥抗炎及免疫调节作用^[24]。Zhang等^[13]研究表明,绿原酸可以显著抑制IL-1β、TNF-α、IFN-γ和白细胞介素-2(IL-2)的表达。其他研究也表明,绿原酸具有良好的抗炎作用^[25]。周昭彬等^[26]研究发现,饲粮添加中剂量水飞蓟素提高了肉鸡生长前期空肠黏膜中IFN-γ和TNF-α的表达水平,饲粮添加低剂量和中剂量水飞蓟素提高了肉鸡生长后期空肠黏膜中IFN-γ和TNF-α的表达水平。本试验中,83周龄蛋鸡空肠IFN-γ的mRNA相对表达量随山银花和大蓟提取物添加水平的提高而线性提高,由此可知可能是IFN-γ诱导了免疫细胞分化,从而介导细胞的免疫应答。iNOS主要存在于巨噬细胞等参与免疫反应的细胞中,在细胞受到刺激后以精氨酸为底物生成大量一氧化氮(NO),并利用NO的氧化应激协助巨噬细胞参与免疫反应^[13]。本试验结果发现,饲粮添加山银花和大蓟提取物线性提高了蛋鸡空肠iNOS的mRNA相对表达量,表明山银花和大蓟提取物在一定程度上对能够提高机体的免疫力。

3.4 山银花和大蓟提取物对产蛋后期蛋鸡抗氧化功能的影响

肠道黏膜包含酶促和非酶促在内的许多抗氧化防御系统^[27]。酶促体系包括超氧化物歧化酶(SOD)、CAT和GSH-Px。SOD能参与歧化反应,减少氧自由基对细胞的损伤;SOD和CAT可相互作用,清除由歧化反应生成的H₂O₂;GSH-Px可以清除MDA,分解H₂O₂及其他过氧化产物,从而阻止体内自由基引起的膜脂质过氧化^[28]。Chen等^[29]研究表明,饲喂绿原酸提高了热应激条件下断奶仔猪十二指肠T-SOD活性。刘英等^[30]体内体外试验均证明绿原酸具有较强的清除自由基的能力,有利于促进动物机体健康生长。Oskoueian等^[31]研究发现,水飞蓟素可提高热应激鸡肝细胞中SOD和CAT活性。关于山银花和大蓟提取物对蛋鸡肠道抗氧化指标的研究较少,因此,本试验检测了78和83周龄蛋鸡空肠黏膜上述抗氧化指标,结果显示,山银花和大蓟提取物降低了不同时期空肠MDA和H₂O₂含量,提高了空肠CAT活性。这可能是由于山银花和大蓟提取物中的绿原酸和黄酮等活性物质能清除自由基,从而增强肉鸡的抗氧化功能。

3.5 山银花和大蓟提取物对产蛋后期蛋鸡盲肠微生物数量的影响

家禽肠道微生物群在消化、屏障和免疫功能中起重要作用,肠道微生物群是数百种不同微生物的复杂群落,它影响宿主并在调节免疫系统、营养消化、肠道功能以及整体健康和生长方面发挥作用^[12]。肠道菌群关乎着畜禽是否能够健康生长,关于植物提取物可以调节畜禽肠道微生态平衡报道已有很多。刘亚楠^[32]研究发现,饲粮添加山银花和黄芩提取物可以提高肉鸡盲肠乳杆菌属的丰度。Chen等^[33]研究表明,绿原酸不仅显著改变了猪肠道菌群结构,而且提高了盲肠微生物的α多样性,降低了盲肠微生物中厚壁菌门和变形菌门的相对丰度,提高了有益菌的相对丰度。周昭彬等^[26]研究表明,水飞蓟素可以提高肉鸡盲肠优势菌属的丰度而增强肠黏膜屏障功能。和贵文等^[34]研究表明,饲喂黄酮类化合物能提高肉鸡盲肠乳杆菌属丰度。本试验中,饲粮添加山银花和大蓟提取物线性减少了78周龄蛋鸡盲肠产气荚膜梭菌数量,饲粮添加500 mg/kg山银花和大蓟提取物显著增加了83周龄末乳酸杆菌数量,表明山银花和大蓟提取物可调控肠道菌群组成,增加有益菌数量,减少有害菌数量,其原因可能是山银花和大蓟提取物能促进有益菌生长而间接抑制有害菌繁殖,从而起到抗菌作用。

4 结论

饲粮添加山银花和大蓟提取物能够通过增强产蛋后期蛋鸡空肠的免疫功能及抗氧化能力改善肠道屏障功能,并通过减少盲肠有害菌数量,增加有益菌数量,从而改善蛋鸡肠道健康。在本试验条件下,饲粮中山银花和大蓟提取物的适宜添加水平为500 mg/kg。

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