世界卫生组织和联合国粮农组织将益生菌定义为“活的微生物,当摄入足够的量时,对宿主的健康有益”[1]。益生菌正在被开发作为抗生素生长促进剂(antibiotic growth promoters,AGP)的替代品之一。数据显示,2022年,全球益生菌市场价值约为580亿美元,预计到2027年将超过850亿美元[2]。动物饲粮中使用的益生菌主要有乳杆菌属、双歧杆菌属、芽孢杆菌属、链球菌属和肠球菌属以及真菌等。已有文献报道,益生菌具有调节肠道微生物稳态、稳定胃肠道屏障功能、产生抗菌物质、调节免疫系统、促进消化酶活性和吸收、抑制致癌酶活性、干扰病原菌定植和感染黏膜的能力,对宿主有多种有益作用[3];益生菌还具有抗氧化、抗炎、抗过敏、抗病毒等多种功能[4];益生菌还可以预防多种退化性疾病,包括肥胖、糖尿病、癌症、心血管疾病、恶性肿瘤、肝脏疾病和炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)等[5]。由此可见,益生菌具有十分广阔的应用范围。在查阅大量相关文献的基础上,本文就益生菌在家禽生产中发挥抑制细菌感染、提高抗氧化能力、缓解毒性作用和改善肠道健康等的作用机制以及益生菌在家禽生产中的应用效果进行综述,并介绍了益生菌的筛选标准,以期为家禽生产中合理使用益生菌提供参考。
1 益生菌在家禽生产中的作用及其机制
1.1 抑制细菌感染
1.1.1 竞争排斥
竞争排斥是指益生菌菌株通过竞争空间、附着位点和可用营养物质来维持正常的肠道菌群并抑制致病菌的形成[6]。益生菌能有效抑制沙门氏菌在肉鸡盲肠、肝脏和脾脏中的定植。约氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、丁酸梭菌均可抑制沙门氏菌[8]。益生菌可通过竞争排斥或产生细胞因子阻止鼠伤寒沙门氏菌在鸡体内定植。体外试验表明,干酪乳杆菌ATTC334、短双歧杆菌JCM1192黏附Caco-2上皮细胞能力强于婴儿双歧杆菌BL2416;给肉鸡饲喂益生菌后攻毒鼠伤寒沙门氏菌,干酪乳杆菌和双歧杆菌可通过竞争排斥机制减少盲肠扁桃体中鼠伤寒沙门氏菌的定植;婴儿双歧杆菌虽然与上皮细胞结合较差,但它也降低了鼠伤寒沙门氏菌的定植,增加了干扰素(interferon,IFN)-γ和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的产生;结果表明,竞争排斥是短双歧杆菌和干酪乳杆菌发挥保护作用和减少盲肠扁桃体恢复率的机制,而婴儿双歧杆菌BL2416通过促进IFN-γ和TNF-α的产生发挥其保护作用,3株菌均可提高鼠伤寒沙门氏菌感染肉鸡的增重和饲料效率[9]。
1.1.2 产生抗菌物质或有机酸
体外试验表明,乳杆菌可以通过产生有机酸、过氧化氢、细菌素,或阻断空肠弯曲杆菌对肠道细胞黏附和侵袭、增强巨噬细胞吞噬能力,从而抑制空肠弯曲杆菌,其中唾液乳杆菌和罗伊氏乳杆菌抑制空肠弯曲杆菌的作用最强[10]。例如,罗伊氏乳杆菌可以产生有机酸、乙醇和罗伊氏蛋白等抗菌分子[11]。有试验证实,在46株乳酸杆菌中,有43株(93%)具有产生过氧化氢的能力[12]。研究显示,枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸片球菌也具有抑制空肠弯曲杆菌的作用[13]。Wisener等[14]报道,嗜酸乳杆菌NP51和丙酸杆菌NP24抑制大肠杆菌是最有效的。鼠李糖乳杆菌GG和乳酸双歧杆菌Bb12对禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic E. coli,APEC)也有较强的抑制作用,其作用机制可能是通过产生乳酸和生物活性肽进行抑制[15]。
1.1.3 免疫调节
文献显示,多种乳杆菌、芽孢杆菌、肠球菌、双歧杆菌以及酿酒酵母等均能对产气荚膜梭菌产生一定的抑制作用[16-17]。约氏乳杆菌BS15可能通过提高抗氧化能力、增加血清免疫球蛋白和细胞因子的水平,以及增强肠道免疫力来预防肉仔鸡亚临床坏死性肠炎(subclinical necrotic enteritis,SNE)[18],也可以改善患SNE鸡的肝脏异常、脂质代谢、肠道菌群[19],还能通过减轻Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)信号通路、CD80和白细胞介素(interleukin,IL)-1β等促炎通路的作用来抑制肝脏炎症[20]。发酵乳杆菌104R可能通过降低肠道pH,在不影响细菌活力的情况下,抑制产气荚膜梭菌产生β2毒素[21]。发酵乳杆菌1.2029还能通过提高IL-10 mRNA表达,降低IFN-γ和TLR2 mRNA表达,调节肠道黏膜免疫反应,减轻由产气荚膜梭菌导致的炎症损伤[22]。芽孢杆菌可调节宿主免疫,显著刺激炎症和抗炎细胞因子,减少或对抗家禽肠道沙门氏菌、梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌或球虫病等微生物感染[23]。
嗜酸乳杆菌能通过抑制结肠组织中由辅助T细胞(T helper cell,Th)-17产生的促炎细胞因子,如IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-17,治疗结肠炎损伤,这可能是一种新的治疗IBD的方法[24]。研究显示,饲粮中添加丁酸梭菌YH018对患坏死性肠炎(necrotic enteritis,NE)鸡的肠道菌群、免疫应答和肠道屏障功能均有积极影响;丁酸梭菌不仅能提高病鸡抗炎因子IL-10基因的表达,还能抑制病鸡IL-17A基因的表达,降低病鸡封闭蛋白-1(claudin-1)基因的表达[25]。在家禽饲粮中添加屎肠球菌NCIMB11181,可上调患NE鸡中编码紧密连接蛋白基因的表达,也会导致髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、磷酸肌醇-3-激酶(phosphatidylinositide-3-kinase,PI3K)、胰高血糖素样肽-2(glucagon-like peptide-2,GLP-2)、IL-1β、IL-4和热休克蛋白(heat shock protein,HSP)70 mRNA表达量的增加[26]。与对照组相比,饲喂添加含有植物乳杆菌B90和酿酒酵母P11益生菌组合的饲粮能增加肉鸡空肠黏膜IL-10、IFN-α和分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,sIgA)的水平;在回肠黏膜中,与对照组和抗生素组相比,益生菌组sIgA的水平显著增加[27]。
1.2 提高抗氧化能力,缓解热应激反应
益生菌调节免疫反应的功能除了用于抑制和缓解细菌感染,还能用来改善热应激和炎症反应。Wang等[28]研究证实,饲喂枯草芽孢杆菌的肉鸡肝脏IL-6和HSP70水平极低,而IL-10水平较高,盲肠IgA和IgY水平极低。益生菌还可通过产生抗氧化物质(谷胱甘肽),并抑制和减少氧化应激反应来改善热应激[7]。硒被认为是家禽抗氧化能力、生长性能、蛋和肉品质、酶功能、刺激免疫系统和繁殖几种生物功能的必需营养素和重要微量矿物质之一,是谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的重要组成部分,而GSH-Px是一种在正常代谢过程中消除体内自由基的抗氧化酶;硒以无机形式(亚硒酸盐和硒酸盐)和有机形式(硒-蛋氨酸和硒-半胱氨酸)存在。与无机硒相比,有机硒的生物利用度高、安全性高、毒性小[29]。目前,经常将益生菌与硒等抗氧化剂一起使用。在热应激条件下,添加富硒益生菌可有效降低肉鸡氧化应激,保持肉质稳定性[29]。Khan等[30-31]研究证实,在高温应激下,饲粮中添加富硒益生菌后肉鸡肝脏丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量降低,而谷胱甘肽、GSH-Px和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性升高;此外,肝脏中GPx1、GPx4、IL-6和IL-10 mRNA表达量显著上调,促炎细胞因子的mRNA表达量下调,HSP70水平降低;富硒益生菌通过抑制肝脏氧化、炎症和坏死促进肝脏保护。
1.3 缓解毒素、重金属毒性
益生菌可通过代谢转化、物理吸附、增加排泄、提高抗氧化作用等机制发挥缓解毒素毒性的作用。
1.3.1 缓解真菌毒素毒性
微生物对真菌毒素的解毒作用可能是微生物代谢转化的结果,也可能是通过将它们吸附在细菌或酵母细胞壁上而产生的,根据现有文献,乳酸菌和酵母缓解真菌毒素的主要作用机制是细胞壁黏附,甚至死亡细胞也保留了上述活性,也有证据表明乳酸菌和酿酒酵母对黄曲霉毒素(aflatoxin,AF)B1的代谢转化具有活性[32]。在细菌细胞吸附霉菌毒素机制中,细胞内的肽聚糖和胞外多糖、壁酸以及与细胞疏水性和静电性能相关的反应可能起着重要作用;在酵母细胞吸附霉菌毒素机制中,细胞壁的β-D-葡聚糖和甘露低聚糖发挥主要作用,范德华力、氢键或疏水相互作用也参与了吸收过程[32]。研究发现,受到AFB1污染的肉鸡饲喂了含有罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌和酿酒酵母的益生菌制剂后,明显改善了毒性的负面影响,显著降低了肝脏和肾脏器官的变化,并导致AFB1排泄量显著增加[32]。研究发现,一株乳杆菌PL149对产毒黄曲霉具有抑制活性,可阻止黄曲霉毒素的产生,而且具有AFB1体外结合能力[33]。真菌毒素也可以用酵母细胞壁或食用真菌产生的酶来处理,杏侧耳产生的漆酶和氧化酶可以降低真菌毒素的毒性[34]。Chang等[35]在肉鸡饲粮中添加枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌和产朊假丝酵母菌复合益生菌组合,以期缓解AFB1和玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)对肉鸡生长性能和肠道菌群毒性作用的影响,结果证明,复合益生菌制剂能稳定肉鸡肠道菌群,降解霉菌毒素,缓解组织损伤,提高生长性能,降低霉菌毒素毒性。研究发现,枯草芽孢杆菌、酪蛋白乳杆菌和念珠菌属复合益生菌(CFSCP)的细胞游离上清与米曲霉霉菌毒素降解酶(mycotoxin-degrading enzymes,MDEs)结合,能够减轻ZEA和AFB1的细胞毒性[36]。
1.3.2 缓解重金属毒性
益生菌还能通过增强肠道内重金属的隔离、肠道内重金属的解毒、改变金属转运蛋白的表达来减少肠道中重金属的吸收,维持肠道屏障功能[37]。研究表明,对有害重金属具有高亲和力的乳酸菌可作为高效的解毒工具[38]。Elazab等[39]研究了肉桂与含有嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和屎链球菌的益生菌组合对硫酸铜(CuSO4)诱导的肉鸡肾毒性的潜在保护作用,结果显示,与对照组相比,添加肉桂和益生菌组合可降低铜中毒鸡肾组织铜和血清尿素、肌酐和尿酸水平,降低鸡肾脏脂质过氧化作用,提高抗氧化酶活性,显著降低TNF-α、IL-2以及促凋亡蛋白Bax mRNA表达量和环氧酶(cyclooxygenase,COX)-Ⅱ mRNA表达量,显著升高IL-10和抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA表达量,提示益生菌对铜诱导的鸡肾毒性具有较大的保护作用。有研究表明,鼠李糖乳杆菌GR-1的吸收特性可以固定铅和镉,有效地减少它们在体外肠道上皮的易位,从而降低宿主重金属生物积累[40]。最近的研究表明,几种植物乳杆菌可以吸附或降解某些化学污染物,并减轻其引起的炎症和氧化应激[41]。
1.4 改善肠道环境
益生菌可通过改善养分利用、提高饲料效率、平衡肠道菌群、降低粪便pH等方式降低粪便异味、氨气(NH3)排放。有报道称,副干酪乳杆菌CP133、植物乳杆菌CP134具有相对除臭能力[42]。饲粮中添加乳杆菌或芽孢杆菌益生菌可降低肉鸡排泄物中NH3含量,这可能是由于氨基酸回肠消化率的提高和肠道乳杆菌群落的富集[4]。法氏乳杆菌CNMA67-4R和丁酸梭菌CBM588饲喂肉鸡后,提高了粪尿干物质含量,降低了粪尿氮比,从而降低NH3排放;其可能的机制是丁酸和乳酸降低了盲肠pH,从而抑制了盲肠蛋白酶的活性,导致微生物对氨基酸和氨的摄入增加,从而导致粪便中氮含量增加,肾脏氮排泄减少;尿氮排泄量越低,水分摄取量越低,排泄物干物质含量越高[43]。
2 益生菌在家禽生产中的应用
大量研究证明,益生菌可以提高家禽生产性能,主要包括提高体重和改善肉质、提高产蛋率和改善蛋壳质量(颜色)、提高饲料转化率、增加肠道绒毛高度和降低隐窝深度、改善骨骼健康等。
2.1 在肉鸡生产中的应用
芽孢杆菌能够分泌胞外淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶等,可提高肠道对营养物质的消化和吸收能力[3],改善肉鸡的生长性能、免疫状态和抗氧化能力[44]。益生菌可以改善肉鸡的肉品质,饲喂含芽孢杆菌、乳酸菌、链球菌、梭状芽胞杆菌、酵母菌和念珠菌等益生菌饲粮的肉鸡,胸肉和大腿肉中不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例有更高的趋势,从而使肉的质地更光滑[45]。酵母或酿酒酵母提取物能改善鸡肉的嫩度[46]。有研究表明,益生菌可以通过促进钙的吸收,进而对改善骨骼健康发挥潜在作用[4]。例如,枯草芽孢杆菌通过增加钙的肠道吸收、以中枢血清素系统抑制交感神经活性来减少骨吸收,从而改善肉鸡的骨骼特征[47]。Mohammed等[48]研究发现,饲喂枯草芽孢杆菌PB6的肉鸡站立时间更长,胫骨长度、重量和强度更大,血浆钙和磷水平更高;屠宰后鸡腿肌肉颜色亮度较高、持水能力较强、pH较低、口感更好。研究证明,饲粮中添加益生菌,一方面可以通过激活细胞有丝分裂和诱导肠道上皮细胞增殖来增加鸡肠道绒毛高度,促进营养物质的吸收;另一方面可以通过降低隐窝深度,提高绒毛组织的周转率,减少能量消耗,从而提高生产性能[6,45]。饲粮中添加多种芽孢杆菌组合,接种产气荚膜梭菌后,试验组肉鸡的饲料转化率、十二指肠绒毛高度、十二指肠绒毛高度/隐窝深度比值、空肠绒毛高度/隐窝深度比值较对照组显著增加[49]。
2.2 在蛋鸡生产中的应用
饲粮中添加粪肠球菌可改善产蛋后期蛋鸡的生产性能,包括显著提高产蛋率,降低料蛋比,同时能够影响盲肠微生物群落结构;但对平均日蛋重、破蛋率、死亡率和蛋品质无显著影响[50]。饲粮中添加枯草芽孢杆菌ATCC PTA-6737后,与对照组比较,蛋黄颜色和蛋白品质显著提高,蛋壳厚度和断裂强度显著增加,蛋黄胆固醇含量显著降低;但蛋鸡平均蛋重、产蛋率、日采食量、饲料转化率和蛋黄脂肪酸含量与对照组比较均无显著差异[51]。饲粮中添加含有屎肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌和罗伊氏乳杆菌的混合益生菌能改变产蛋鸡盲肠菌群组成,降低无壳蛋产量,提高骨矿化水平[52]。饲粮中添加枯草芽孢杆菌可显著提高老龄蛋鸡的胫骨断裂强度、蛋壳厚度、蛋壳钙含量、肠道绒毛高度与绒毛高度/隐窝深度比值、血清钙水平和钙结合蛋白(calbindin,CALB)1 mRNA相对表达量[53]。有试验证实,益生菌能刺激肠上皮屏障功能,调节产生肠道黏膜,刺激蠕动;降低肠道pH,促进蛋白质以及铜、钙、铁、锰和镁等矿物质吸收[4]。
3 益生菌的筛选标准
根据世界卫生组织、联合国粮农组织、欧洲食品安全局等机构制定的标准,益生菌菌株的安全性、功能性和实用性是选择益生菌的关键标准[54]。益生菌必须符合特定的标准,例如该菌在消化道传代时的生存和保存能力、非致病性和毒性、无不良副作用、稳定性、大规模生产潜力、并对给药动物产生确定的有益健康的临床效果。潜在的候选产品应该能够改变特定的生理参数或免疫系统,减弱病原体,治疗和预防感染、炎症和疾病,同时还能起到生物控制作用,防止腐败[55]。其中生存能力是益生菌功能性的先决条件,包括黏附上皮细胞、降低黏膜肠通透性和免疫调节效应等[56]。益生菌安全性方面的风险主要有全身感染、有害的代谢活动、易感个体的过度免疫刺激、基因转移4个方面[56]。益生菌筛选标准[1]详见表1。
表1 益生菌筛选标准Table 1 Screening criteria for probiotics[1] |
| 序号No. | 安全性Safety | 功能性Functionality | 实用性Practicability |
|---|---|---|---|
| 1 | 人类或动物起源 | 肠道生态系统中 微生物群的竞争力 | 易于生产高生物量和 高生产力的培养 |
| 2 | 从健康人或动物的 胃肠道中分离出来 | 能够生存和维持代谢活动, 并在目标位点生长 | 益生菌在固定过程(冷冻、冷冻干燥), 制备和销售益生菌产品过程中所需 特性的活力和稳定性 |
| 3 | 安全的使用历史 | 抗胆盐和酶 | 成品贮藏存活率高 |
| 4 | 精确的诊断鉴定(表型和 基因型性状) | 能抵抗胃里的低pH | 成品感官性能的保证 |
| 5 | 无传染病相关数据 | 肠道生态系统中微生物种类的 竞争力(包括密切相关的病 原体的拮抗活性) | 遗传稳定性 |
| 6 | 无胆汁酸盐的产生能力 | 对病原菌的拮抗活性 | 抗噬菌体 |
| 7 | 无不良影响 | 对肠道内生菌群产生的 细菌素和酸的抵抗力 | |
| 8 | 不存在不稳定元件的 基因缺失导致的 抗生素耐药性 | 在宿主体内某些特定部位的黏附和 定植能力,以及在胃肠道 系统中适当的存活力 |
4 小结
综上所述,益生菌具有提高生产性能、抑制或缓解病原体感染、提高抗氧化能力、缓解毒性作用和改善肠道环境等多方面的作用,在家禽养殖中的应用潜力巨大,是理想的抗生素替代产品。但鉴于其可能造成的安全性风险,在功能性的差异和尚未阐明的作用机理,以及实用性上面临的诸多要求,益生菌在家禽养殖中的开发研究和应用推广仍任重道远。农业农村部已经制定印发《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南》,对菌株鉴定及产毒、致病、耐药等安全性评价作出规定,下一步应抓好落实。因此,提出如下建议:一是加强微生物饲料添加剂标准体系建设,逐渐建立和完善益生菌菌株鉴定、安全性评价、产品功效和含量等方面的检测方法和企业标准,上升为国家标准或行业标准;二是加强益生菌遗传资源保护利用,保持益生菌遗传稳定性,建立具有知识产权保护的国家益生菌菌种资源库;三是加强益生菌在家禽养殖中各种作用的机理研究以及功效一致性评价;四是开发完善加工工艺,提高益生菌在恶劣环境下的生存能力,提高益生菌的产量,提高其在畜禽生产中使用的效益。