Chinese Journal of Animal Nutrition >

2023 , Vol. 35 >Issue 11: 7446 - 7460

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2023.677

Original article

Effects of Straw Species and Particle Size on in Vitro Fermentation, Microbial Physical Surface Characteristics and Composition of Cellulolytic Bacteria

  • MA Dongwang , 1, 2 ,
  • XI Linqiao , 2, * ,
  • TANG Jia 3 ,
  • ZHOU Xiaoling 2 ,
  • ZHONG Rongzhen 4 ,
  • TAN Zhiliang 1 ,
  • TANG Shaoxun , 1, *
Expand
  • 1 Key Laboratory of Agro-Ecological Processes in Subtropical Reign, Hunan Provincial Key Laboratory of Animal Nutritional Physiology and Metabolic Process, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China
  • 2 College of Animal Science, Tarim University, Alar 843300, China
  • 3 Zhangjiajie Jiyuan Biotechnology Co., Ltd., Zhangjiajie 427099, China
  • 4 Northeast Institute of Geography and Agroecology, Chinese Academy of Sciences, Changchun 130102, China
* XI Linqiao, professor, E-mail: ;
TANG Shaoxun, professor, E-mail:

Received date: 2023-06-15

  Online published: 2023-11-12

Fold

Abstract

This experiment was conducted to study the effects of straw species and particle size on in vitro fermentation, rumen microbial physical surface characteristics and composition of cellulolytic bacteria, and to provide theoretical basis for revealing the degradation mechanism of straw cellulose. The experiment was arranged in a 3×3 two-factors design, that is, three kinds of crop straws (rice straw, wheat straw and corn straw) and three kinds of particle sizes (<0.15 mm, 0.15 to 0.30 mm, and >0.90 mm). After 48 h of fermentation, the changes of in vitro fermentation characteristics, rumen microbial surface physical properties, number of total bacteria and cellulolytic bacteria in fermentation solution were measured. The results showed that compared with rice and wheat straws, corn straw had higher initial fermentation rate (FRD0), dry matter degradability (DMD), total volatile fatty acid (TVFA) concentration, molar percentage of propionic acid, microbial protein (MCP) concentration, the number of total bacteria and Ruminococcus albus, and the cell membrane hydrophobicity (CSH) of microbial (P<0.05). Increasing the straw crushing degree significantly improved FRD0, DMD, MCP and ammonia nitrogen (NH3-N) concentration(P<0.05) and potentially increased the number of Ruminococcus flavefaciens (P=0.05). At the same time, DMD, NH3-N and MCP concentration, the molar percentage of valeric acid and isobutyric acid, CSH, and the number of Ruminococcus albus and Fibrobacter succinogenes in fermentation liquor (P<0.05) influenced by the interaction between straw species and particle size. In conclusion, corn straw has better digestion and degradation characteristics among the three kinds of straw, and increasing the degree of straw crushing is conducive to the digestion and degradation of straw, and provides more MCP for ruminant livestock.

Key words： straw; in vitro fermentation characteristics; surface physical characteristics; cellulolytic bacteria

Cite this article

MA Dongwang , XI Linqiao , TANG Jia , ZHOU Xiaoling , ZHONG Rongzhen , TAN Zhiliang , TANG Shaoxun . Effects of Straw Species and Particle Size on in Vitro Fermentation, Microbial Physical Surface Characteristics and Composition of Cellulolytic Bacteria[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2023 , 35(11) : 7446 -7460 . DOI: 10.12418/CJAN2023.677

粗饲料是组成反刍家畜饲粮的必要部分,占反刍家畜饲粮的40%~70%甚至更高[1]。农作物秸秆,特别是水稻、小麦及玉米三大类作物秸秆是我国牛、羊粗饲料的重要组成来源,根据2022年国家统计年鉴数据及谷草比计算[2-3],2021年仅上述三大类作物秸秆产量就达7亿t以上。农业农村部发布的《全国农作物秸秆综合利用情况报告》表明,2021年我国秸秆饲料化利用量达1.32亿t,但其饲料化利用率仍仅占秸秆总产量的18%。随着我国草食畜牧业的持续快速发展,对粗饲料的需求也将日益增长。而农作物秸秆的消化利用除受其自身营养特性影响外,其他如秸秆种类、秸秆粉碎的粒度等因素也会影响秸秆纤维的消化降解,明确农作物秸秆消化降解过程中不同因素的作用是提高其利用率的重要基础。
前人对不同农作物秸秆降解特性的研究表明,秸秆发酵或降解特性不仅受其种类的影响,而且与秸秆的加工粉碎程度有关[4⇓-6]。陈晓琳等[5]研究表明,稻草秸秆、小麦秸秆及玉米秸秆体外48 h干物质降解率(DMD)以玉米秸秆最高,以小麦秸秆最低。于胜晨等[7]研究发现,玉米秸秆的瘤胃干物质及粗蛋白质有效降解率显著高于小麦秸秆和水稻秸秆,而小麦秸秆的瘤胃干物质有效降解率显著低于水稻秸秆,但其瘤胃粗蛋白质有效降解率要显著高于水稻秸秆。除粗饲料种类外,许多研究表明,粗饲料的长度也会影响其降解特性以及发酵后挥发性脂肪酸(VFA)的组成等[6,8]。减小稻草或蔗渣颗粒长度或饲粮粗饲料长度会提高稻草或蔗渣发酵时的产气量,或增强粗饲料的瘤胃消化程度进而提高VFA产量[6,9]。但也有研究发现,饲粮粗饲料长度的变化不会影响瘤胃环境pH以及VFA的浓度[10-11]。
粗饲料在消化道的降解是多种因子共同作用的结果,纤维降解菌种类、微生物表面物理特性,如表面电荷、微生物细胞膜疏水性(CSH)及细胞膜通透性(CMP)等都可能对微生物的吸附过程及胞内酶的释放产生影响[12⇓-14],进而影响对纤维素的降解。因此,试验通过研究3种农作物秸秆在不同粒度下的发酵特性、微生物表面物理特性以及纤维降解菌的组成等的变化规律,探明秸秆种类及粒度与微生物表面物理特性、秸秆发酵特性间的关系,以期为粗饲料的高效利用效率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

试验所选玉米、小麦和水稻等农作物秸秆样品为去除籽实后的秸秆。将所收集的秸秆经65 ℃烘干24 h,在室温下冷却1 h后粉碎,然后用3种孔径(即100、50和20目)的筛网分筛得到3种粒度(PS)范围的样品,分别为<0.15 mm、0.15~0.30 mm和>0.90 mm,记为PS1、PS2和PS3,所有样品装入塑料自封袋中常温保存,以备后续分析。玉米、小麦和水稻秸秆营养成分含量以干物质计分别为:有机物75.8%、73.0%和72.2%;粗蛋白质5.2%、8.4%和6.2%;中性洗涤纤维63.6%、68.4%和63.2%;酸性洗涤纤维38.6%、42.6%和43.4%;粗纤维31.2%、34.5%和33.1%,粗脂肪14.3%、10.8%和8.0%。

1.2 试验动物与饲养管理

选取2头体重和年龄相近、体况良好、安装有瘤胃瘘管的去势成年浏阳黑山羊作为瘤胃液供体动物。动物饲粮粗料为稻秆,精料组成为豆粕24.00%、玉米47.00%、麸皮22.00%、石粉2.23%、食盐0.77%、预混料4.00%。整个试验期,每头瘘管羊每天补给粗料500 g,精料300 g,于每日08:00和18:00分2次饲喂粗料和精料,自由饮水。

1.3 体外发酵

参照Menke等[15]方法配制人工瘤胃缓冲液。接种瘤胃液前用恒温磁力搅拌器加热人工瘤胃缓冲液,温度为39.5 ℃,通入CO2保持溶液厌氧环境(刃天青变成无色)。晨饲前1 h,通过瘤胃瘘管等量采集2只山羊瘤胃食糜装入保温瓶运回实验室,然后用4层脱脂纱布过滤瘤胃食糜并混合,按瘤胃液与人工瘤胃缓冲液体积比为1∶4的比例配制培养液。
参考Zhang等[16]方法进行体外发酵培养。称取1.0 g底物放入145 mL发酵瓶中,在39.5 ℃的恒温培养箱中预热。取出发酵瓶,通入CO2,以保证发酵瓶中为厌氧环境。然后依次向每个发酵瓶中加入60 mL上述培养液,并将发酵瓶放入全自动体外厌氧发酵设备中培养。分别在不同时间进行3批次培养,每批次每个处理2个平行。全自动体外厌氧发酵设备由发酵瓶、恒温培养箱、压力测定系统和计算机控制系统组成,可实现气体产量的全自动记录。记录48 h发酵阶段的实时产气量。

1.4 样品采集与分析

pH:48 h后终止发酵,立即用pH计(REX PHS-3C,上海仪器设备厂)测定每个发酵瓶中发酵液的pH。
发酵液表面张力(ST):终止发酵后将发酵液迅速送到实验室,用KRÜSS Tensiometer K100(德国KRÜSS公司)表面张力仪在39 ℃的条件下测定发酵液的ST。
DMD:用37 μm的尼龙布在真空泵负压条件下抽滤厌氧培养瓶中的发酵液,收集发酵底物,包裹之后放于铝盒中105 ℃烘干,称重。DMD计算公式如下:
DMD(%)=100×(1-M1/M2)。
式中:M1表示发酵后底物干物质质量;M2为发酵前粗料的初始质量。
微生物蛋白(MCP)浓度:取2 mL发酵液,以酵母嘌呤与氮的比值为标准,采用嘌呤法估算发酵液中微生物总氮浓度[17],MCP浓度表示为MCP相对于发酵液体积的量。
VFA与氨态氮(NH3-N)浓度:取2 mL抽滤后发酵液于4 ℃、15 000 r/min离心10 min,取1 mL上清液,加入0.10 mL 25%偏磷酸固定,静置15 min后再次在4 ℃、15 000 r/min离心10 min,取0.60 mL上清液装于测定瓶中,在气相色谱仪(安捷伦 7890A,美国)中测定发酵液样品中VFA浓度。取0.40 mL上清液,参考Zhang等[16]的方法测定NH3-N浓度。
Zeta电荷(ZP):参考Pelletier等[18]的方法测定ZP。取抽滤后的发酵液2 mL,12 000 r/min离心10 min,去除上清液,得细胞沉淀。用5 mL 1 mmol/L KNO3溶液洗涤细胞2次(漩涡振荡2 min使细胞沉淀悬浮在溶液中,12 000 r/min再次离心10 min,重复上述操作),将洗涤好的细胞沉淀悬浮在5 mL 1 mmol/L KNO3溶液中,放于冰盒中静置30 min。用Zeta Potential Analyzer测定ZP。
CSH:参考Bellon-Fontaine等[19]和Hori等[20]的MATS方法测定微生物CSH。取2 mL抽滤后发酵液,4 ℃、12 000 r/min离心10 min,去除上清液,得细胞沉淀。用6 mL 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 6.6)洗涤2次(操作同上),最终得到6 mL 0.1 mol/L PBS的细胞悬浮液。取2 mL细胞悬浮液,用紫外分光光度计(日本岛津,UV2450)测定其在400 nm的吸光度(OD)(A0);然后再向每个样品管中加入2 mL十六烷,室温孵育10 min,然后再旋涡振荡混合2 min,待混合物完全两相分离,小心地移出水相(避免产生乳浊液)并测定其在400 nm的OD(A1)。CSH计算公式如下:
CSH(%)=100×(1-A1/A0)。
CMP:参考王福远等[21]方法采用荧光光度分析法测定。用荧光剂异硫氰酸荧光素-右旋糖苷来测定细胞膜通透性,浓度分别设为:0、10、20、30、40和50 mg/L,制备标准曲线;用双蒸水配制25 mg/L的FITC-Dextran,测定其光密度值作为空白对照,制备荧光剂标准曲线。发酵结束后,取3 mL发酵上清液,加入1 mL 100 mg/L的FITC-Detran溶液(A0)以保证FITC-Dextran在发酵液中的初始浓度为25 mg/L (0.25 mg FITC-Dextran于10 mL的离心管发酵液中),37 ℃避光厌氧培养1 h,取2 mL培养液厌氧条件下,经4 ℃、10 000 r/min离心10 min,取上清液1.5 mL,使用荧光分光光度计检测(激发波长488 nm,发射波长520 nm)OD(A1,发酵液中FITC-Detran最终浓度)。另取发酵液1 mL,4 ℃,10 000 r/min离心10 min,取0.75 mL上清液加0.25 mL双蒸水摇匀,同样条件下测定其荧光分光光度值(A0),以去除发酵原液对测定值的影响。CMP计算公式如下:
CMP(%)=100×[(A0-A1)/A0]。

1.5 发酵液总细菌及纤维降解菌数量

取1 mL未过滤培养液,根据制造商的说明,使用QIAamp DNA Stool Minikit(德国凯杰)提取基因组DNA。使用NanoDrop ND1000(NanoDrop Technologies,美国)对纯化的DNA进行定量。采用Denma等[22]的方法设计总细菌、黄色瘤胃球菌及产琥珀酸丝状杆菌的引物序列,参照Koike等[23]的方法设计白色瘤胃球菌的引物序列,引物序列如表1所示。用这些引物扩增得到的纯化PCR产物生成质粒DNA,通过连续稀释质粒拷贝数,构建Ct值与质粒拷贝数之间的标准曲线。以稀释后的基因组DNA为模板,使用诺唯赞的Taq DNA Polymerase在ABI 7900HT系统(应用生物系统,美国)进行定量PCR检测。通过将Ct值与标准曲线的关系来确定总细菌及纤维降解菌的拷贝数。
表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

目标微生物
Target microorganism		 引物序列
Primer sequences(5'—3')		 产物大小
Product size/bp
总细菌
Total bacteria		 F: CGGCAACGAGCGCAACCC
R: CCATTGTAGCACGTGTGTAGCC		 146
白色瘤胃球菌
Ruminococcus albus		 F: CCCTAAAAGCAGTCTTAGTTCG
R: CCTCCTTGCGGTTAGAACA		 176
黄色瘤胃球菌
Ruminococcus flavefaciens		 F: CGAACGGAGATAATTTGAGTTTACTTAGG
R: CGGTCTCTGTATGTTATGAGGTATTACC		 132
产琥珀酸丝状杆菌
Fibrobacter succinogenes		 F: GTTCGGAATTACTGGGCGTAAA
R: CGCCTGCCCCTGAACTATC		 121

1.6 数据计算

运用LE体外发酵产气模型[24]将各时间点测得的总产气量进行拟合,采用最小二乘法计算动态发酵产气参数,模型公式如下:
y=Vf[1-exp(-k×t)]/[1+exp(b-k×t)]。
式中:y表示t时间点底物的产气量(mL/g);Vf表示理论最大产气量(mL/g);k表示产气分率(/h);b为产气曲线形状指标;b>0表示曲线为s形;b<0表示曲线为非s形,下同。
采用以下计算公式计算产气动力学参数:
FRD0=k/[1+exp(b)];
T0.5=ln[2+exp(b)]/k。
式中:FRD0表示发酵初期(<12 h)产气分率(/h);T0.5表示达到最大产气量一半所需的发酵时间(h)[25]。

1.7 统计分析

采用SAS 8.2统计软件的GLM过程对所有数据进行方差分析,统计模型如下:
Yijk=μ+Ri+Vj+Pk+RiVj+RiPk+VjPk+RiVjPk+Eijk。
式中,Yijk为依变量;μ为总体平均值;Ri为批次i的影响;Vj为秸秆种类j的影响;Pk表示粒度k的影响;RiVj表示批次与秸秆种类j的交互作用;RiPk表示批次i与粒度k的交互作用;VjPk表示秸秆种类j与粒度k的交互作用;RiVjPk表示批次i、秸秆种类j与粒度k间的交互作用;Eijk表示随机残差。采用Tukey's检验对最小二乘方法的结果进行多重比较,P<0.05表示差异显著,0.05≤P<0.10表示有显著性趋势。

2 结果与分析

2.1 体外产气特性

不同秸秆种类在3种粒度下体外发酵累积产气量如图1所示,秸秆种类及粒度对其体外发酵产气量有明显的影响,在总体产气量方面,玉米秸秆表现出比水稻秸秆和小麦秸秆更高的产气量,而PS1粒度下3种秸秆在发酵初始阶段相对PS2和PS3粒度具有更快的产气速度。
图1 不同秸秆种类及粒度的秸秆体外发酵产气量

PS1、PS2和PS3分别表示粒度为<0.15 mm、0.15~0.30 mm和>0.90 mm。下同。

Fig.1 Gas production from in vitro fermentation of different straw species and particle sizes of straws

PS1, PS2 and PS3 indicate particle sizes<0.15 mm, 0.15 to 0.30 mm and >0.90 mm, respectively. The same as below.

如表2所示,不同秸秆及不同粒度的理论最大产气量及产气分率(k)无显著差异(P>0.05),二者的交互作用也不显著(P>0.05)。秸秆产气曲线形状(b)、初始发酵速率(FRD0)及达到最大产气量一半所需时间(T0.5)受秸秆种类及粒度的显著影响(P<0.05)。水稻秸秆及小麦秸秆的b值显著高于玉米秸秆(P<0.05),FRD0按玉米秸秆>水稻秸秆>小麦秸秆的顺序显著降低(P<0.05),而小麦秸秆的T0.5值显著高于玉米秸秆和水稻秸秆(P<0.05)。当秸秆粒度降低到PS1以下时,b值及T0.5值显著降低(P<0.05)。同时发现,玉米秸秆的粒度由PS2降低到PS1时其FRD0值提高幅度显著高于水稻秸秆和小麦秸秆(秸秆种类×粒度,P<0.05)。
表2 秸秆种类及粒度对秸秆体外发酵产气参数的影响

Table 2 Effects of straw species and particle size on in vitro fermentation gas production parameters of straws

项目
Items		 理论最大
产气量
Vf/(mL/g)		 产气曲
线形状
b		 产气分率
k/(/h)		 发酵初期
产气分率
FRD0/(/h)		 达最大产气量一半
所需发酵时间
T0.5/h
秸秆种类Straw species 粒度PS
PS1 125 0.763 0.069 6 0.019 3 19.1
水稻秸秆Rice straw PS2 153 1.130 0.051 0 0.011 3 31.8
PS3 150 1.686 0.058 3 0.009 2 30.2
PS1 121 0.700 0.042 9 0.014 5 28.5
小麦秸秆Wheat straw PS2 141 1.566 0.051 6 0.009 2 35.2
PS3 153 2.083 0.048 9 0.005 7 44.8
PS1 134 -0.879 0.069 6 0.041 6 13.6
玉米秸秆Corn straw PS2 185 1.049 0.045 0 0.011 2 33.9
PS3 168 1.613 0.055 5 0.009 7 33.1
SEM 17 0.389 0.010 1 0.002 3 3.7
主效应Main effect
秸秆种类Straw species
水稻秸秆Rice straw 143 1.193a 0.059 6 0.013 3b 27.0b
小麦秸秆Wheat straw 138 1.513a 0.047 8 0.009 4c 37.0a
玉米秸秆Corn straw 162 0.595b 0.056 7 0.020 8a 26.9b
SEM 11 0.195 0.005 6 0.001 3 2.1
粒度PS
PS1 127 0.149b 0.060 7 0.026 1a 19.7b
PS2 161 1.220a 0.049 2 0.010 7b 33.5a
PS3 157 1.794a 0.054 3 0.008 2b 36.0a
SEM 11 0.195 0.005 6 0.001 3 2.1
P值P-value
秸秆种类Straw species 0.222 0.018 0.285 <0.001 0.003
粒度PS 0.060 <0.001 0.325 <0.001 <0.001
秸秆种类×粒度Straw species×PS 0.901 0.146 0.494 <0.001 0.233

同列数据肩标不同字母表示差异(P<0.05),相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same column, values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 体外发酵特性

如表3所示,秸秆种类以及粒度对秸秆DMD、发酵液NH3-N浓度、pH以及MCP浓度存在显著影响(P<0.05)。同时发现,秸秆种类及粒度对DMD、NH3-N和MCP浓度有显著的交互作用(P<0.05)。水稻秸秆、小麦秸秆及玉米秸秆粒度分别为PS3、PS2及PS1时DMD最高,而分别为PS1、PS3及PS3时DMD最低。对于NH3-N浓度,水稻秸秆表现出随秸秆粒度的增大呈先上升后下降的现象,小麦秸秆和玉米秸秆则表现出随秸秆粒度的增大而下降的现象。玉米秸秆发酵时其发酵液pH显著低于水稻秸秆和小麦秸秆(P<0.05),而粒度为PS3时发酵液pH显著高于粒度较小的2种秸秆(P<0.05),但其pH都在6.8以上。3种秸秆间发酵液中MCP浓度按玉米秸秆>小麦秸秆>水稻秸秆的顺序显著降低(P<0.05),而在3种粒度间,MCP浓度则随粒度的增大而显著下降(P<0.05)。同时发现秸秆种类与粒度对MCP浓度有显著的交互作用(P<0.05)。
表3 秸秆种类及粒度对秸秆体外发酵特性的影响

Table 3 Effects of straw species and particle size on in vitro fermentation characteristics of straws

项目Items 干物质
降解率
DMD/%		 氨态氮
NH3-N/(mg/dL)		 pH 微生物蛋白
MCP/(mg/mL)
秸秆种类Straw species 粒度PS
PS1 55.3 9.98 6.89 0.205
水稻秸秆Rice straw PS2 55.4 10.51 6.87 0.220
PS3 56.6 9.74 6.94 0.175
PS1 53.8 14.39 6.87 0.261
小麦秸秆Wheat straw PS2 54.1 11.65 6.85 0.420
PS3 45.5 11.82 6.92 0.261
PS1 67.7 10.75 6.70 0.614
玉米秸秆Corn straw PS2 61.1 10.50 6.70 0.420
PS3 61.1 9.88 6.74 0.421
SEM 1.2 0.28 0.02 0.021
主效应Main effect
秸秆种类Straw species
水稻秸秆Rice straw 55.8b 10.10b 6.90a 0.200c
小麦秸秆Wheat straw 51.1c 12.60a 6.88a 0.314b
玉米秸秆Corn straw 63.3a 10.40b 6.71b 0.485a
SEM 0.7 0.20 0.01 0.012
粒度PS
PS1 58.9a 11.70a 6.82b 0.360a
PS2 56.9b 10.90b 6.81b 0.353a
PS3 54.4c 10.50b 6.87a 0.286b
SEM 0.7 0.20 0.01 0.012
P值P-value
秸秆种类Straw species <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
粒度PS <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
秸秆种类×粒度Straw species×PS <0.001 <0.001 0.892 <0.001
如表4所示,3种秸秆发酵后发酵液TVFA浓度及丙酸摩尔百分比按玉米秸秆>水稻秸秆>小麦秸秆的顺序显著降低(P<0.05),而乙丙比则按小麦秸秆>水稻秸秆>玉米秸秆的顺序显著降低(P<0.05)。玉米秸秆发酵后乙酸摩尔百分比显著低于小麦秸秆和水稻秸秆(P<0.05);水稻秸秆的发酵液中丁酸和戊酸摩尔百分比显著低于玉米秸秆和小麦秸秆(P<0.05);而小麦秸秆异丁酸和异戊酸摩尔百分比显著高于水稻秸秆和玉米秸秆(P<0.05)。
表4 秸秆种类及粒度对秸秆体外发酵液挥发性脂肪酸的影响

Table 4 Effects of straw species and particle size on volatile fatty acids in in vitro fermentation liquid of straws

项目
Items		 总挥发性
脂肪酸
TVFA/
(mmol/L)		 挥发性脂肪酸的摩尔百分比
Molar percentage of volatile fatty acids/%		 乙丙比
A/P
乙酸
Acetic
acid		 丙酸
Propionic
acid		 丁酸
Butyric
acid		 戊酸
Valeric
acid		 异丁酸
Isobutyric
acid		 异戊酸
Isovaleric
acid
秸秆种类Straw species 粒度PS
PS1 24.7 72.2 21.2 5.02 0.597 0.442 0.786 3.51
水稻秸秆Rice straw PS2 31.2 71.8 21.9 5.06 0.473 0.332 0.597 3.30
PS3 26.9 72.0 21.5 5.29 0.494 0.349 0.581 3.35
PS1 25.3 71.6 19.6 6.10 0.827 0.466 1.455 3.66
小麦秸秆Wheat straw PS2 26.4 72.2 19.8 5.73 0.649 0.479 1.242 3.66
PS3 19.5 73.6 18.4 5.59 0.897 0.519 1.168 4.00
PS1 35.6 69.7 22.7 5.74 1.016 0.134 0.729 3.08
玉米秸秆Corn straw PS2 33.1 69.2 22.3 6.55 0.894 0.319 0.818 3.10
PS3 30.7 70.5 21.6 6.38 0.579 0.523 0.648 3.27
SEM 2.1 0.8 0.4 0.29 0.072 0.068 0.066 0.10
主效应Main effect
秸秆种类Straw species
水稻秸秆Rice straw 27.6b 72.0a 21.5b 5.12b 0.521b 0.374b 0.655b 3.39b
小麦秸秆Wheat straw 23.7c 72.5a 19.3c 5.81a 0.791a 0.488a 1.288a 3.77a
玉米秸秆Corn straw 33.1a 69.8b 22.2a 6.22a 0.830a 0.325b 0.732b 3.15c
SEM 1.1 0.4 0.2 0.15 0.043 0.039 0.040 0.06
粒度PS
PS1 28.5ab 71.2 21.2b 5.62 0.813a 0.347 0.990a 3.42
PS2 30.2a 71.0 21.3b 5.78 0.672b 0.377 0.886a 3.35
PS3 26.3b 71.9 20.7a 5.75 0.657b 0.464 0.799b 3.54
SEM 1.1 0.4 0.2 0.15 0.043 0.039 0.040 0.06
P值P-value
秸秆种类Straw species <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 0.004 <0.001 <0.001
粒度PS 0.012 0.197 0.027 0.706 0.017 0.074 0.003 0.084
秸秆种类×粒度Straw species×PS 0.064 0.624 0.272 0.113 0.002 0.005 0.156 0.159
当秸秆粒度为PS2时其TVFA浓度显著高于PS3(P<0.05),PS1和PS3间无显著差异(P>0.05)。秸秆粒度为PS3时其丙酸摩尔百分比显著低于PS1和PS2(P<0.05),而PS1的戊酸摩尔百分比显著高于PS2和PS3(P<0.05),PS1和PS2的异戊酸摩尔百分比显著高于PS3(P<0.05)。
戊酸及异丁酸摩尔百分比受秸秆种类及粒度交互作用的显著影响(P<0.05)。玉米秸秆发酵后其发酵液中戊酸摩尔百分比随粒度的增大而下降,而小麦秸秆和水稻秸秆则表现出先下降后上升或不变的现象(秸秆种类×粒度,P=0.002);玉米秸秆和小麦秸秆发酵时异丁酸摩尔百分比随粒度的增大而上升,而水稻秸秆发酵时异丁酸摩尔百分比则表现出先下降后平稳的现象(秸秆种类×粒度,P=0.005)。

2.3 发酵液及微生物表面物理特性

如表5所示,不同种类秸秆发酵48 h后,发酵液ST、微生物CSH及CMP存在显著差异(P<0.05)。小麦秸秆发酵后发酵液ST显著高于玉米秸秆(P<0.05),而玉米秸秆发酵后微生物CSH显著高于水稻秸秆和小麦秸秆(P<0.05),3种秸秆间微生物CMP按水稻秸秆>玉米秸秆>小麦秸秆的顺序依次显著降低(P<0.05)。
表5 秸秆种类及粒度对秸秆体外发酵液表面张力及微生物表面物理特性的影响

Table 5 Effects of straw species and particle size on surface tension of fermentation liquor and physical characteristics of microbial surface in in vitro fermentation liquid of straws

项目
Items		 表面张力
ST/(mN/m)		 Zeta电位
ZP/mv		 细胞膜疏水性
CSH/%		 细胞膜通透性
CMP/%
秸秆种类Straw species 粒度PS
PS1 51.1 -31.5 21.7 13.2
水稻秸秆Rice straw PS2 49.9 -32.4 20.4 14.0
PS3 51.3 -30.3 23.9 14.3
PS1 51.9 -30.9 19.8 10.3
小麦秸秆Wheat straw PS2 50.2 -31.0 23.0 10.8
PS3 53.0 -31.7 24.3 13.0
PS1 49.0 -29.6 24.8 12.1
玉米秸秆Corn straw PS2 49.6 -29.0 22.6 11.9
PS3 52.5 -31.2 25.3 13.9
SEM 0.6 1.3 0.8 0.5
主效应Main effect
秸秆种类Straw species
水稻秸秆Rice straw 50.8ab -31.4 22.0b 13.8a
小麦秸秆Wheat straw 51.7a -31.2 22.4b 11.4c
玉米秸秆Corn straw 50.4b -29.9 24.2a 12.6b
SEM 0.4 0.7 0.5 0.3
粒度PS
PS1 50.7b -30.7 22.1b 11.9b
PS2 49.9b -30.8 22.0b 12.2b
PS3 52.3a -31.1 24.5a 13.7a
SEM 0.4 0.7 0.5 0.3
P值P-value
秸秆种类Straw species 0.035 0.299 0.002 <0.001
粒度PS <0.001 0.919 <0.001 <0.001
秸秆种类×粒度Straw species×PS 0.098 0.524 0.009 0.171
3种粒度间,发酵液ST以PS3最高,显著高于PS1和PS2(P<0.05)。微生物CSH及其CMP也以PS3最高,显著高于PS1和PS2(P<0.05),后两者间无显著差异(P>0.05)。
同时发现,CSH受秸秆种类与粒度交互作用的显著影响(P<0.05),水稻秸秆和玉米秸秆发酵时微生物CSH随粒度的增大先略微降低,然后再上升,而小麦秸秆则表现出一直上升的现象。

2.4 总细菌及纤维降解菌数量

如表6所示,小麦秸秆发酵后总细菌数量显著低于水稻秸秆与玉米秸秆(P<0.05),而水稻秸秆发酵后白色瘤胃球菌数量显著低于玉米秸秆与小麦秸秆(P<0.05)。3种粒度间总细菌数量以PS2最低,显著低于其他2种粒度(P<0.05),黄色瘤胃球菌数量随秸秆粒度的增大呈下降趋势(P=0.05),而白色瘤胃球菌数量以PS1最低,显著低于其他2种粒度(P<0.05)。产琥珀酸丝状杆菌数量以PS3最高,显著高于其他2种粒度(P<0.05)。
表6 Effects of straw species and particle size on number of total bacteria and cellulolytic bacteria in in vitro fermentation liquid of straws log10 (拷贝数/mL)

Table 6

项目
Items		 总细菌
Total bacteria		 黄色瘤胃球菌
Ruminococcus
flavefaciens		 白色瘤胃球菌
Ruminococcus
albus		 产琥珀酸丝状杆菌
Fibrobacter
succinogenes
秸秆种类Straw species 粒度PS
PS1 9.48 5.98 5.93 6.77
水稻秸秆Rice straw PS2 9.45 5.79 5.87 6.25
PS3 9.69 5.58 6.04 6.77
PS1 9.41 5.79 6.02 5.99
小麦秸秆Wheat straw PS2 9.25 5.76 6.65 6.76
PS3 9.43 5.71 6.65 6.91
PS1 9.67 5.82 6.15 6.86
玉米秸秆Corn straw PS2 9.47 5.81 6.63 6.50
PS3 9.62 5.81 6.73 6.62
SEM 0.05 0.08 0.07 0.09
主效应Main effect
秸秆种类Straw species
水稻秸秆Rice straw 9.54a 5.78 5.95b 6.60
小麦秸秆Wheat straw 9.36b 5.75 6.44a 6.55
玉米秸秆Corn straw 9.59a 5.81 6.50a 6.66
SEM 0.03 0.05 0.04 0.05
粒度PS
PS1 9.52a 5.86 6.03b 6.54b
PS2 9.39b 5.79 6.38a 6.50b
PS3 9.58a 5.70 6.47a 6.77a
SEM 0.03 0.05 0.04 0.05
P值P-value
秸秆种类Straw species <0.001 0.693 <0.001 0.359
粒度PS <0.001 0.050 <0.001 0.002
秸秆种类×粒度Straw species×PS 0.166 0.191 <0.001 <0.001
发酵后白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌数量受秸秆种类与粒度二者交互的显著影响(P<0.05)。小麦秸秆与玉米秸秆发酵时白色瘤胃球菌数量随粒度的增大先快速上升后平稳,而水稻秸秆则表现为略微降低,然后上升的现象。而对于产琥珀酸丝状杆菌数量,水稻秸秆与玉米秸秆发酵时先随粒度的增大而先下降,然后上升,而小麦秸秆则表现先快速上升,然后缓慢上升的现象。

3 讨论

3.1 体外发酵特性

饲草的体外发酵产气参数在很大程度上可反映其在瘤胃内的降解动力学特性。饲草中可发酵碳水化合物含量越多,瘤胃的产气量也越高,同时也预示着其DMD也越高。FRD0表示饲草发酵12 h以内的产气分率,T0.5表示达到最大产气量一半所需的发酵时间,FRD0值越大表示饲草在发酵初始阶段产气速率越高,T0.5值越小表示可发酵碳水化合物在发酵前期的降解程度越高。本研究中玉米秸秆相对小麦秸秆具有较高的FRD0和T0.5值,表明其比小麦秸秆在发酵初期具有更高的有机物降解率。而秸秆的FRD0不仅与秸秆中可溶性成分含量有关,而且与秸秆表面定植纤维降解菌的数量相关,如玉米秸秆中性洗涤可溶物含量(26.4%)要高于小麦秸秆(21.6%),同时其3种纤维降解菌数量也要高于小麦秸秆,这可能是随粒度增大玉米秸秆FRD0下降程度大于小麦秸秆的主要原因。有研究认为,粗料在反刍动物瘤胃中正常消化时间在30 h左右[26],而本研究发现,发酵48 h时玉米秸秆DMD显著高于水稻秸秆,而水稻秸秆显著高于小麦秸秆,这预示着在相对较短的体内消化过程中,小麦秸秆相对玉米秸秆和水稻秸秆为家畜提供的可利用营养物质更少。陈晓琳等[5]研究中也发现,玉米秸秆和水稻秸秆的干物质有效降解率要高于小麦秸秆。而秸秆粒度由PS3以上降低到PS1以下时,FRD0值显著提高,T0.5值显著降低,表明通过提高秸秆粉碎程度有利于提高秸秆的初始阶段的发酵速率,进而提高干物质的降解,表3中DMD数据也证明了这一结果。同时本研究发现,秸秆种类与粒度对DMD存在显著的交互作用,即玉米秸秆DMD在粒度由PS1增大到PS2时快速降低,小麦秸秆则表现出粒度由PS2增大到PS3时快速降低,而水稻秸秆则一直变化较小。这意味着不同种类秸秆DMD随粒度的增加并不完全呈线性变化。其原因可能与粒度达到一定程度后,秸秆中可溶物质或可消化物质的含量并不呈线性变化有关。如齐慧等[27]研究表明,当芦苇秸秆粒度由<0.85 mm降到<0.18 mm时其水提液中葡萄糖与木糖含量、可溶性葡聚糖和木聚糖含量都呈幂函数式下降,而半纤维素与木质素含量分别呈指数式和线性下降。而郭栋豪等[28]研究发现,当玉米秸秆粒度由>0.450 mm降到<0.075 mm时其水提液中葡萄糖含量幂函数式下降,木糖含量先快速下降,然后缓慢降低,而可溶性葡聚糖和木聚糖含量分别呈线性上升和先下降后上升的二次曲线变化。
NH3-N是瘤胃微生物合成菌体蛋白的主要原料,其浓度高低是微生物对饲料氮的降解与利用的综合结果,而MCP浓度直接反映秸秆在瘤胃中降解后可合成MCP的程度。有研究认为,瘤胃中适宜的NH3-N浓度为6.30~27.50 mg/dL[29]。本研究中,各处理NH3-N浓度在这一范围之内,说明微生物的生长不受影响。而本研究中玉米秸秆发酵时具有较低的NH3-N浓度,可能与其MCP合成较高有关(MCP浓度显著高于水稻秸秆和小麦秸秆)。而水稻秸秆发酵时NH3-N和MCP浓度都较低,可能与水稻秸秆中的蛋白质主要以结构性蛋白质为主,从而限制了微生物对蛋白质的降解有关[30],进而导致其虽然具有比小麦秸秆更高的DMD,但其MCP浓度反而低于小麦秸秆。而秸秆粒度从PS3以上降低到PS1以下时,NH3-N浓度会提高11.40%,其原因可能是秸秆粒度减小时可为微生物提供更多可降解位点,进而提高微生物对秸秆有机物的降解(如秸秆粒度减小时DMD相对提高8.27%),进而也提高了对粗蛋白质的降解,相应地为微生物的生长提供更多碳源和氮源,进而合成更多MCP(MCP浓度相对提高25.90%)。本研究还发现,NH3-N及MCP浓度受秸秆种类及粒度的交互作用影响,即小麦秸秆NH3-N及MCP浓度随粒度的增大先分别快速下降和上升,然后变化平稳和快速下降,水稻秸秆的NH3-N及MCP浓度随粒度的增大表现出相似的先略微上升后略微下降的平稳变化,而玉米秸秆的NH3-N浓度随粒度的增大表现出与水稻秸秆相似的变化,但其MCP浓度则随粒度的增大先快速下降,然后维持平稳。3种秸秆的NH3-N及MCP浓度随粒度的增大与DMD表现出相似的变化规律,因此二者受秸秆种类与粒度交互作用影响的主要因素与秸秆DMD的变化相关。
反刍动物机体70%~80%的能量来源于瘤胃中的VFA[31],秸秆发酵时产生更多的VFA意味着可为反刍家畜提供更多的能量来源。本研究中,玉米秸秆和稻草秸秆发酵时相对小麦秸秆具有更高的TVFA浓度,从其组成来看,增加的VFA主要为丙酸。此结果与汪营等[32]的结果不完全一致,可能是由于不同研究中所选秸秆的营养组成及纤维结构等存在差异所致。同时发现玉米秸秆和水稻秸秆的乙丙比显著低于小麦秸秆,汪营等[32]也发现水稻秸秆发酵时乙丙比要低于小麦秸秆。这说明玉米秸秆和水稻秸秆更趋向于丙酸型发酵,而小麦秸秆趋向于乙酸型发酵。此外,本研究发现提高秸秆粉碎程度可显著提高发酵液中TVFA的浓度,但当秸秆粒度为PS1时,其TVFA浓度反而比中间粒度的浓度略低,但高于最大粒度的秸秆,其增加量主要来源于乙酸和丙酸,但发酵液中乙丙比并没有显著差异,说明提高粉碎程度并未改变瘤胃发酵模式。发酵液中TVFA的浓度并未随秸秆粒度的增加而持续增加,可能与秸秆粉碎到PS1以下后微生物的活力并未持续增加有关,如2种较小粒度秸秆具有相近的MCP浓度。

3.2 发酵液及微生物表面物理特性

瘤胃液低ST可促进食物快速湿润和消化[33],研究发现通过调节瘤胃液ST可调节瘤胃发酵和饲料利用[34]。本研究发现,玉米秸秆及水稻秸秆以及较小粒度秸秆发酵时,发酵液的ST更低,这可能是其发酵过程中更多的微生物代谢产物(如VFA等也可以降低溶液的ST)降低了发酵液的ST,而这更有利于微生物对底物的黏附与降解[35]。
ZP表示微生物表面固液界面上的电势差,是反映微生物表面物理化学特性的因素之一,它与微生物的黏附过程及生物膜的形成有关[12]。ZP绝对值越高,则微生物聚集程度越低,体系越稳定,并且死亡细菌的ZP绝对值更低[36]。本研究发现,3个种类秸秆及3种粒度秸秆发酵48 h后微生物表面ZP没有显著差异,表明发酵体系中微生物的稳定性不受秸秆种类及粒度的影响。
微生物CSH是评价细胞表面特性的一个重要指标,其不仅影响微生物的黏附和互相凝集的能力,而且还影响它们摄取降解有机质的效率[37]。从化学角度看,疏水性细胞倾向于黏附在疏水性基质上,而亲水性细胞表面倾向于黏附在亲水性基质上[38],微生物CSH越强,其黏附性也越强[36]。本研究中,玉米秸秆发酵时微生物CSH显著高于水稻秸秆和小麦秸秆,表明其对底物的黏附作用可能要高于后面二者。有研究表明,秸秆纤维素呈现亲水性,而木质素则呈疏水性[39]。较小粒度秸秆发酵时其微生物CSH要低于粒度较大秸秆,可能是秸秆在粉碎过程其木质素结构受到破坏,进而降低了其疏水性。由于这方面的研究文献相对较少,具体原因需要进一步研究。此外,在本研究中秸秆种类与粒度对微生物CSH还表现出交互作用的影响,即当秸秆粒度由小增大时,水稻秸秆和玉米秸秆发酵时微生物CSH先降低,然后再上升,而小麦秸秆则一直表现为上升现象。有研究表明,微生物CSH受培养时间、培养基以及微生物自身特性等多种因素的共同影响[40-41],微生物CSH受秸秆种类与粒度交互作用影响的机理目前并不清楚。
微生物细胞保持适宜的通透性与流动性是保证其与外界进行物质交换,维持其自身生长代谢的重要条件,当细胞膜的通透性及流动性发生改变时,其生理功能也可能发生改变[42]。适当提高CMP可使胞内酶更容易流向胞外,进而提高干物质降解[43]。本研究中,水稻秸秆及玉米秸秆发酵时微生物CMP更高,而增大秸秆粒度时微生物CMP也随之提高。微生物CMP在多少范围内较为适宜目前并不清楚,引起这一变化的机制也需进一步研究。

3.3 瘤胃纤维降解菌

瘤胃中纤维降解菌主要包括产琥珀酸丝状杆菌、黄色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌和梭菌属等[44]。产琥珀酸丝状杆菌、黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌是最有代表性的3种纤维分解菌,它们消化纤维素的能力要强于瘤胃中的其他纤维分解菌,在牛瘤胃的总纤维分解菌中所占比例分别为33.0%、2.6%和46.0%[23]。本试验中,3种秸秆发酵时的主要纤维降解菌为产琥珀酸丝状杆菌和黄色瘤胃球菌,牛瘤胃纤维降解菌分布不一致,这可能与本试验中所有动物及饲料不一样有关。同时玉米秸发酵时,其3种纤维降解菌数量最高也可能是其DMD最高的原因之一。
粉碎会改变瘤胃微生物及酶与底物的接触面积,从而改变瘤胃的发酵[45],引起瘤胃微生物组成的变化,最终影响发酵速度和终产物的形成[46]。本研究发现,随着秸秆粒度的增加,总细菌、产琥珀酸丝状杆菌及白色瘤胃球菌数量逐渐增大,其原因可能是秸秆粒度的增加延迟了微生物接触可发酵有机物的时间,导致在发酵后期时才表现出更高的总细菌与纤维降解菌数量[47]。而黄色瘤胃球菌数量表现出随秸秆粒度增加而降低的现象,上述结果表明,相对较小粒度的秸秆,秸秆粒度较大时有更多的黄色瘤胃球菌参与纤维的降解。
在本研究中发现,秸秆种类与粒度对秸秆发酵时产琥珀酸丝状杆菌及白色瘤胃球菌数量存在显著的交互作用。即玉米秸秆与水稻秸秆发酵时产琥珀酸丝状杆菌数量随秸秆粒度的增大而先下降后上升,而小麦秸秆则表现出先快速升,然后平稳上升的现象,同时玉米秸秆与小麦秸秆发酵时白色瘤胃球菌数量随秸秆粒度的增大先快速上升,而再平稳或缓慢下降,而水稻秸秆则表现出先缓慢上升然后又缓慢下降的现象。由于纤维降解菌在分解底物的增殖过程中受多种因素(如底物的碳氮营养组成、不同细菌间的竞争、细菌生长阶段、植物的表面结构、细菌生存pH、离子强度环境等)的影响,如玉米秸秆、水稻秸秆及小麦秸秆在相同粒度下其比表面积并不相同,并表现出随秸秆粒度减少呈非线性的变化现象[48]。另外,水稻秸秆在粉碎过程中其表面硅质受到不同程度去除,进而改变水稻秸秆表面的疏水性[49],最终引起纤维降解菌黏附与增殖的变化。因此,引起秸秆种类与粒度对2种纤维降解菌产生交互影响的内在机制究竟是什么还有待深入研究。

4 结论

不同农作物秸秆在体外发酵特性、纤维降解菌组成及微生物细胞表面物理特性方面存在显著差异。玉米秸秆相对水稻秸秆和小麦秸秆具有更高的FRD0、DMD、TVFA和MCP浓度、总细菌和白色瘤胃球菌数量,以及微生物CSH。提高秸秆粉碎程度会有效提高秸秆的发酵时的FRD0、DMD、MCP和NH3-N浓度以及黄色瘤胃球菌数量。同时秸秆发酵特性与微生物细胞膜表面物理特性还受秸秆种类与粒度交互作用的影响,在对不同秸秆粉碎时还应考虑其粉碎程度。

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