1 TUDCA简介
熊胆作为传统中药,具有清热解毒、利胆排毒、抗炎消炎等作用,已被用来治疗各种疾病,且历史悠久。熊胆中主要成分包括TUDCA、牛磺鹅去氧胆酸(taurochenodeoxycholic acid,TCDCA)、UDCA、鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)[6];其中,TUDCA具有明显的抗氧化和抗炎作用,被认为是神经退行性疾病的潜在治疗药物,最重要的是TUDCA可以通过血脑屏障对大脑进行保护[7]。TUDCA是一种无毒的亲水胆汁酸,是熊去氧胆酸和牛磺酸的结合产物,在人体中的含量较低,其化学名为3α,7β-二羟基-胆烷酰-N-牛磺酸,分子式为C26H45NO6S,相对分子质量为499.70[8],分子结构如图1所示。最早获取TUDCA的方法是通过提取动物的胆汁,但因为取材方式在国际上备受争议,随后我国颁布了相关条例禁止采用活熊取胆法获取熊胆汁酸。近年来,化学半合成法、酶催化法以及微生物转化法成为了TUDCA主要获取途径[9]。
2 TUDCA的抗氧化活性
2.1 体外抗氧化活性
TUDCA本身具有氧化还原反应的能力,可以直接清除ROS,也可以通过调节线粒体膜的稳定性及B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X protein,Bax)、细胞色素C(cytochrome C,CytC)和半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)的表达来减轻氧化应激和减少由ROS引起的细胞损伤,并且在体内、体外都发挥着重要的抗氧化作用[10]。线粒体作为细胞的能量中心和氧化还原反应的主要场所,在氧化还原平衡过程中起着重要作用。Viana等[14]研究发现,TUDCA能够通过抑制线粒体凋亡基因Bax易位,阻止CytC释放到细胞质中,恢复线粒体的膜动态稳定和ATP产生,缓解氧化应激引起的细胞凋亡。此外,TUDCA还可以通过恢复线粒体的细胞呼吸和减少线粒体ROS的产生来保护线粒体的功能稳定性,从而减轻氧化应激对线粒体的损伤[15]。氧化应激可以刺激内质网(endoplasmic reticulum,ER)应激,而ER应激也可以导致氧化应激和细胞凋亡[16-17]。因此,TUDCA也可以通过抑制ER应激通路的激活来减轻氧化应激的程度,进而保护细胞免受氧化损伤[18]。
体外细胞试验表明,TUDCA具有良好的抗氧化活性。Pioltine等[19]研究发现,在体外成熟的牛卵母细胞培养基中添加200 μmol/L TUDCA表现出良好的ROS清除活性,并且增加了卵母细胞中过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和血红素氧合酶-1(heme oxygenase,HO-1)mRNA的相对丰度。另一项研究发现,TUDCA能够抑制体外培养牛卵母细胞中ROS的产生以及ER应激和促凋亡基因的表达,刺激线粒体代谢功能来增强葡萄糖代谢,增加Bcl-2和谷胱甘肽(glutathione,GSH)表达,提高囊胚发育率,并降低凋亡细胞的百分比,并且在IVC培养基中添加10 μmol/L效果最佳[20]。此外,TUDCA通过减少ROS和MDA的产生,上调抗氧化基因的表达以及增加GSH的产生,显著提高了过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)处理的人视网膜色素细胞的抗氧化能力[21]。在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理的小鼠小肠上皮细胞(IEC-6细胞)中,TUDCA增加了磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)的表达,使得CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT enhancer binding protein homologous protein,CHOP)活性降低,从而抑制LSP诱导的IEC-6细胞坏死[22]。
2.2 体内抗氧化活性
当体内产生的ROS超过机体清除能力时,就会导致细胞膜氧化、蛋白质和DNA的氧化损伤、细胞增殖和凋亡的失衡。但是机体存在的一些抗氧化酶[超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、CAT、GSH-Px]和抗氧化非酶物质(褪黑素、类胡萝卜素、维生素C、维生素E等)可以清除机体多余的ROS,保护细胞免受氧化损伤。SOD是机体重要的抗氧化酶,可以将超氧阴离子(superoxide anion,$\mathrm{O}_2^{-}$)歧化为氧气(oxygen,O2)和H2O2[23];GSH-Px和CAT是一种低分子清除剂,可清除O2-和H2O2[24-25]。相关体内研究发现,TUDCA通过调节体内抗氧化系统来发挥抗氧化作用。
3 抗氧化通路
3.1 Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch like ECH associated protein 1,Keap1)-核转录因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)-抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)调控途径
Keap1-Nrf2信号通路是维持细胞内氧化还原平衡的重要途径,其中Keap1是Nrf2的负调控蛋白,而ARE是Nrf2的上游启动子区域。在正常情况下,Nrf2被Keap1绑定,形成Nrf2-Keap1复合物,防止Nrf2进入细胞核,并限制其转录活性;当细胞受到氧化应激、物理性刺激以及化学性刺激等信号时,会诱导Nrf2从Keap1上释放出来,随后Nrf2进入细胞核与ARE结合,启动抗氧化和解毒相关基因的转录和表达,并促进细胞内抗氧化能力的提高[27]。体内体外试验结果均表明,TUDCA可通过Nrf2途径提高GSH-Px活性,抑制ROS的生成。Moreira等[10]研究发现,神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)处理小鼠1 h后,其中脑和纹状体中ROS含量分别增加13%和20%;而TUDAC可以通过激活Nrf2信号通路,进一步增强下游抗氧化酶HO-1和GSH-Px的表达,降低人神经母细胞(SH-SY5Y细胞)中α-突触核蛋白诱导的氧化应激(图2);并且在处理前和处理后加入TUDCA均能降低细胞内MPTP诱导产生的ROS含量。同样,TUDCA可以通过激活Nrf2通路增加利福平(rifampicin,RFP)诱导的肝母细胞瘤细胞(HepG2细胞)中CAT、GSH-Px和SOD活性,降低MDA含量[11]。研究还发现,TUDCA通过与Keap1结合,破坏Nrf2-Keap1之间的相互作用,释放Nrf2进入细胞核与ARE相结合,启动下游多种抗氧化酶的合成,从而缓解氧化应激[28]。此外,氧化应激会导致Bax将CytC释放到细胞质中,激活Caspase诱导细胞凋亡[29-30],而TUDAC通过激活Nrf2通路抑制CHOP-死亡受体5(death receptor 5,DR5)-Caspase-8细胞凋亡途径,降低CHOP的表达,达到减少DR5转录和Caspase-8活化的目的,从而抑制细胞凋亡[31]。此外,TUDCA还可以通过Nrf2信号通路抑制急性脑梗死大鼠血清MDA和氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)的表达,增加SOD和GSH-Px活性,改变炎症反应中的脂质过氧化,缓解氧化应激损伤,并下调凋亡蛋白(Bax、Caspase-3)的表达,减少关节软骨损伤大鼠线粒体细胞凋亡[12]。
图2 TUDCA抗氧化机理示意图ROS:活性氧 reactive oxygen species;TGR5:武田G蛋白偶联受体5 Takeda G protein-coupled receptor 5;SIRT3:沉默调节蛋白3 sirtuin 3;PI3K:磷脂酰肌醇3-激酶 phosphatidylinositol 3-kinase;Akt:蛋白激酶B protein kinase B;p-Akt:磷酸化蛋白激酶B phosphorylated protein kinase B;PERK:蛋白激酶R-样内质网激酶 protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase;ATF4:激活转录因子4 activating transcription factor 4;CHOP:CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白 CCAAT enhancer binding protein homologous protein;eIF2α:真核起始因子2 eukaryotic initiation factor-2α;ERK:信号调节蛋白激酶 extracellular signal-regulated kinase;p-ERK:磷酸化信号调节蛋白激酶 phosphorylated extracellular signal-regulated kinase;p38:p38丝裂原激活蛋白酶 p38 mitogen-activated protein kinases;p-p38:磷酸化p38丝裂原激活蛋白酶 phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinases;p-JNK:磷酸化c-Jun N端激酶 phosphorylated c-Jun N-terminal kinase;JNK:c-Jun N端激酶 c-Jun N-terminal kinase;Nrf2:核转录因子E2相关因子2 nuclear factor erythroid 2-related factor 2;keap1:Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1 Kelch like ECH associated protein 1;ARE:抗氧化反应元件 antioxidant response element;SOD:超氧化物歧化酶 superoxide dismutase;CAT:过氧化氢酶 catalase;HO-1:血红素氧合酶-1 heme oxygenase-1;GSH-Px:谷胱甘肽过氧化物酶 glutathione peroxidase;Caspase-3:半胱氨酸蛋白酶-3 cysteinyl aspartate specific proteinase-3;HSP90α:热休克蛋白90α heat shock protein 90α;TUDCA:牛磺熊去氧胆酸 tauroursodeoxycholic acid;Activation:激活;Inhibition:抑制。 Fig.2 Schematic antioxidation mechanism diagram of TUDCA |
3.2 磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)调控途径
PI3K-Akt途径是一个重要的信号通路,参与了诸多细胞代谢过程,包括细胞增殖、存活、分化、代谢调节等。PI3K-Akt途径在细胞内的诱导与激活可以调控多种重要信号转导通路[32]。通过激活PI3K-Akt途径,Akt可以直接磷酸化并激活,使其从细胞质转移到细胞核中与ARE结合,从而增加抗氧化酶HO-1的表达[33],抑制ROS生成,从而增强细胞的抗氧化能力。Zhang等[34]研究发现,热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)已被证实是在缺氧、活性氧和热量等多种应激后从细胞分泌的,HSP90α激活PI3K-Akt途径导致ER应激,造成肺部纤维化,而ER应激抑制剂TUDCA可以调节该通路,有效降低血清中HSP90α含量,缓解ER应激(图2)。TUDCA处理乙酰胆碱诱导的糖尿病小鼠后,PI3K-Akt途径被激活且Akt活性明显增加,使得组织内ROS的生成量和MDA的含量都降低,从而缓解ER应激[35]。Akt磷酸化可以改变下游分子Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达来减弱细胞凋亡。蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)和激活转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)是内质网膜上能激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)的3种效应蛋白,其中PERK是ER应激的调节中枢,能够促进激活转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)和CHOP激活诱导细胞凋亡,而TUDCA可以通过激活Akt通路抑制PERK的活性,进而抑制PERK-ATF4-CHOP通路,从而增加Bcl-2/Bax的比值,降低ATF4、Caspase-12和CHOP的表达水平,消除ER应激并减少小鼠创伤性脑损伤后的神经元细胞的凋亡[36]。此外,TUDCA还能通过激活Akt通路来调节PERK-真核起始因子2(eukaryotic initiation factor-2α,eIF2α)途径诱导的ER应激,降低了CHOP、磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(phosphorylated protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,p-PERK)和磷酸化真核起始因子2(phosphorylated eukaryotic initiation factor-2α,p-eIF2α)蛋白的表达水平以及血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)含量,从而减少坏死性小肠结肠炎小鼠模型肠道细胞凋亡[22]。
3.3 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)调控途径
MAPK途径广泛存在于机体细胞中,是细胞增殖、应激、凋亡、炎症等转导通路的共同交汇通路[37],在抗氧化方面起到重要作用。最经典的MAPK信号通路包括细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路、c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路以及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,p38)通路。氧化应激可以激活MAPK信号通路,导致JNK、ERK和p38的磷酸化水平分别增强[38],而TUDCA可以通过调控MAPK通路缓解氧化应激(图2)。Han等[39]研究发现,TUDCA诱导的小鼠M2巨噬细胞抑制MAPK信号通路中ERK、JNK和p38的磷酸化,减少促炎因子白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、TNF-α和IL-6的表达,改善了脊髓损伤大鼠脊髓的组织病理学损伤,并促进了脊髓的功能恢复。TUDCA还可以通过抑制p38通路,降低小鼠肠道上皮应激标志物葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)和炎症因子白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)的表达,达到缓解三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)诱导的小鼠肠道ER应激导致的炎症性肠病的目的[40]。此外,研究还发现LPS可能通过p38与Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)结合激活下游通路,促进TNF-α、IL-1β和IL-8等炎症因子的产生和分泌,而TUDCA可以调控p38通路降低这些炎症因子的分泌[41]。
3.4 武田G蛋白偶联受体5(Takeda G protein-coupled receptor 5,TGR5)-沉默调节蛋白3(sirtuin 3,SIRT3)途径
TGR5是一种质膜结合的G蛋白偶联胆汁酸受体,SIRT3是位于线粒体中的沉默信息调节因子蛋白家族的成员,通过抑制细胞凋亡来防止神经元缺血[42]。TUDCA是TGR5的激动剂,可以通过激活TGR5及其下游信号通路起作用[43]。Dicks等[44]研究发现,TGR5是TUDCA用于细胞DNA损伤修复中的必要组分,TUDCA通过刺激TGR5信号传导来减少紫外线辐射暴露后的DNA损伤和ER应激(图2),且TUDCA-TGR5信号通路协调调节基因组损伤反应(genome damage response,GDR)和UPR通路来增加DNA修复中DNA依赖蛋白激酶的催化亚基、p53结合蛋白1(p53-binding protein 1,53BP1)以及X-框结合蛋白1重组蛋白(X-box binding protein 1,XBP1)的含量来减少DNA损伤。随后进一步研究发现,TUDCA可以通过TGR5受体缓解葡萄糖引起的猪胚胎氧化应激和UPR引起的ER应激,并且TUDCA在胚胎中是通过TGR5信号传导而不是与细胞内蛋白质直接作用,所以抑制TGR5受体会干扰TUDCA促进DNA损伤修复的能力[45]。除此之外,激活TGR5通路可以诱导SIRT3的表达,并增加SIRT3的翻译后修饰,从而增强SIRT3激活抗氧化酶的能力。Wu等[46]研究表明,TUDCA可以在自发性蛛网膜下腔出血后通过激活TGR5-SIRT3信号通路增加Bcl-2的表达,并降低Bax和裂解的Caspase-3的表达,从而减轻蛛网膜下腔出血后神经元细胞的凋亡,并改善神经功能。
4 小结
TUDCA是存在于动物胆汁中的亲水性天然抗氧化物,因其毒性极小、安全性高被用于多种实验室试验和临床试验。大量研究证实了TUDCA可以通过Keap1-Nrf2-ARE、PI3K-Akt、MAPK、TGR5-SIRT3等途径调控抗氧化酶系统和非酶系统,清除体内多余ROS,从而缓解氧化损伤。基于TUDCA具有多种生物活性特征,其具有作为饲料添加剂应用于畜牧生产中的潜力,以提高畜禽的生长性能和改善畜禽健康。然而,目前对于TUDCA抗氧化的研究还局限在细胞及小鼠和大鼠等模型动物层面上,关于在家畜和家禽方面的研究尚未见报道,因此,进行进一步研究来寻找TUDCA的最佳作用剂量和作用时间并运用到畜禽生产上是很有必要的。