内质网(endoplasmic reticulum, ER)是存在于所有真核细胞中的重要细胞器,是细胞中蛋白质和脂质合成、加工、包装和运输的重要场所,也是钙离子(Ca2+)的储库。正常生理状态下,DNA在细胞核内转录为mRNA,再通过翻译在核糖体内转变为氨基酸,氨基酸脱水缩合形成肽链后,进入内质网加工形成蛋白质,正确折叠的蛋白质再由高尔基体分泌出细胞外,蛋白质的合成与分解处于动态平衡。但当细胞内Ca2+浓度上升、氧化还原状态改变、ATP水平下降、未折叠蛋白质增加和蛋白质过度积累时,动态平衡被打破,诱发内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)。参与ERS的通路主要有2条:一条是内质网过载反应(ER-overload response, EOR),另一条是未折叠蛋白质反应(unfolded protein response, UPR)。EOR的发生主要是因为内质网内的蛋白质超富集,EOR发生后会从内质网腔内释放Ca2+,刺激活性氧(ROS)分子的产生,并激活经典的炎症信号通路核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信号通路[1]。UPR由3种内质网跨膜应激传感器介导,分别是肌醇需要激酶1(inositol requiring enzyme 1, IRE1)、蛋白激酶受体样内质网激酶(protein kinase receptor like endoplasmic reticulum kinase, PERK)和激活转录因子6(activating transcription factor 6, ATF6)。正常生理情况下,这3种传感器与葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78, GRP78)结合且保持在非活性状态,但当错误折叠的蛋白质积累时,由于GRP78与错误折叠的蛋白质亲和力更高,GPR78会与以上3种传感器解离,转而作为UPR信号通路的启动子,释放应激传感器以引发下游的未折叠蛋白质反应。GRP78在蛋白质的合成、折叠和组装中发挥关键作用,是UPR过程中的关键参与者之一[2]。
多糖(polysaccharide)是由至少10个单糖通过糖苷键组成的高分子碳水化合物。根据单糖单位的组成可将多糖分为2种:由相同单糖组成称为同多糖,如葡聚糖和淀粉等;由不同的单糖组成称为杂多糖,如肝素是由D-葡萄糖醛酸和N-硫酸-D-葡萄糖胺组成。植物多糖是由醛糖或酮糖经糖苷键连接,具有生物学活性的天然高分子聚合物,是构成植物细胞壁的结构物质,其生物学活性与来源、提取工艺和单糖组成等有关[3]。研究表明,植物多糖有促进动物生长、改善动物肉品质、促进动物营养物质消化代谢、调节肠黏膜形态及肠道菌群等生物活性作用[4⇓⇓-7]。此外,植物多糖还可通过调控NF-κB、丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)、c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、C/EBP同源蛋白(CHOP)等信号通路缓解动物的免疫应激、氧化应激(oxidative stress, OS)和细胞凋亡。如前所述,ERS相关通路已成为缓解机体应激和治疗疾病的潜在靶点。为此本文主要综述植物多糖对ERS介导的动物细胞凋亡、炎症和氧化损伤的影响及其作用机制,以期为天然植物饲料添加剂的开发提供参考。
1 植物多糖通过缓解ERS调节动物的炎症反应
肌醇需要激酶1α(IRE1α)和PERK跨膜应激传感器介导的2条ERS信号通路均与炎症反应及其伴随的免疫反应的发生有密切关系。炎性小体是由胞浆内模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)构成的多蛋白质复合物,是先天免疫反应对抗病原体和死亡细胞等危险信号的关键组成部分[8]。目前已知的炎性小体主要有4种,即核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein, NLRP)1炎性小体、NLRP3炎性小体、NLR家族含CARD结构蛋白4(NLR family CARD domain-containing protein 4, NLRC4)炎性小体和黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2, AIM2)炎性小体[9]。其中,NLRP3炎性小体是目前研究最深入的炎性小体,其过度激活与自身免疫性疾病和炎性疾病有关[10],而IRE1α信号通路与NLRP3炎性小体诱导的炎症关系极为密切[11]。ERS可通过IRE1α诱导线粒体损伤,进而调控NLRP3-天冬氨酸蛋白水解酶(cysteine aspartate-specific protease, Caspase)-2轴激活NLRP3炎性小体,释放大量白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β),导致炎症反应的发生[12]。炎症反应作为ERS的下游反应,是一个重要的细胞反应过程,而香菇多糖不仅通过抑制ERS相关蛋白如IRE1α的表达缓解了ERS,还显著减少了促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、IL-1β和白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)的表达,进而缓解炎症反应[13]。此外,茯苓多糖(Poria cocos polysaccharide, PCP)和桔梗多糖也均会显著降低促炎细胞因子表达水平,进而缓解炎症反应[14-15]。Sule等[16]研究发现,X-盒结合蛋白1(X-box binding protein 1, XBP1)的上游IRE1α还可促进系统性红斑狼疮小鼠外周血中性粒细胞过度活化,有助于中性粒细胞产生ROS,从而导致炎症反应增强;而减少狼疮小鼠IRE1α的表达,可以减轻中性粒细胞的活化,降低ROS的产生,进而缓解炎症反应。研究表明,饲粮中添加辣木叶多糖可清除奶牛体内的ROS,减少炎症反应的发生[17]。此外,IRE1α能与TNF-α受体相关因子2(TRAF2)相互作用,激活凋亡信号调节激酶1(ASK1),通过JNK和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路的激活[18],诱导炎症基因的表达。添加植物多糖如黑沙蒿多糖,可通过抑制Toll样受体4(Toll-like receptor, TLR4)/MAPK/NF-κB信号通路的过度激活,缓解脂多糖(LPS)导致的肉仔鸡免疫应激[19]。IRE1α还能与TRAF2和核因子-κB抑制物蛋白激酶(nuclear factor-κB inhibitor protein kinase, IKK)结合,诱导NF-κB的核易位,进而发生炎症反应[20]。卢红[21]的研究表明,添加黄芩多糖可抑制NF-κB的活性,降低促炎细胞因子的表达水平,进而缓解炎症反应。综上所述,IRE1α信号通路可通过NLRP3炎性小体的激活,ROS的增加,JNK、p38 MAPK、NF-κB信号通路的激活,诱导炎症反应。而目前的研究发现,植物多糖可通过激活免疫细胞、刺激细胞因子释放和免疫球蛋白的分泌、缓解ERS等发挥免疫调节作用[22],但关于植物多糖通过IRE1α信号通路调控机体炎症反应作用机制的研究仍鲜见报道,需进一步深入研究。
PERK通过自身磷酸化激活下游靶点,增加CHOP的表达,激活NF-κB,导致白细胞介素-8(interleukin-8, IL-8)和TNF-α直接从肝细胞分泌,诱导细胞死亡和炎症反应[23]。NF-κB二聚体与NF-κB抑制蛋白(NF-κB inhibitor protein, IκB)在静息状态下结合形成p50-p65-IκB三聚体,在细胞质中以无活性形式存在。当细胞受到胞内外刺激后,IκB激酶被激活,导致IκB蛋白降解,随后游离的NF-κB二聚体迅速与κB序列在细胞核中结合,引起多种致炎因子的表达和分泌[24]。周漫钰等[25]研究发现,添加慈姑多糖可缓解ERS,下调PERK信号通路关键蛋白表达,进而调节NF-κB信号通路,缓解炎症反应。这表明PERK通路可通过激活NF-κB信号通路,诱导炎症反应,但植物多糖与PERK信号通路直接的相关关系的探讨还不够深入,仍需进一步研究。
由此可见,在饲粮中添加植物多糖后,可通过调控IRE1α和PERK相关信号通路缓解ERS,进而下调促炎因子、炎性小体和NF-κB等的表达,缓解动物机体炎症反应和免疫反应,但是其相关机制仍不明确,有待进一步研究。
2 植物多糖通过缓解ERS调节动物的抗氧化能力
动物机体在应激状态下会产生大量自由基,导致OS的发生,OS会干扰细胞的氧化还原平衡和内质网环境的稳态,导致ERS[26-27]。ROS和丙二醛(MDA)是造成蛋白质、脂质和核酸等生物分子氧化损伤的主要原因[28]。抗氧化酶是超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、硫氧还蛋白过氧化物酶(thioredoxin peroxidase, TPX)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和过氧化氢酶(catalase, CAT)等的统称。其中,SOD作为清除ROS的最强抗氧化酶,是检测动物机体OS反应发生的重要指标[29]。大量研究表明,植物多糖可以提高动物机体内抗氧化酶活性,清除过量的ROS,这可能与植物多糖可提高核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2, Nrf2)的表达有关[19,30]。
Nrf2是与红细胞、血小板发育有关的蛋白质,Nrf2在抗氧化作用期间不会被消耗,相对半衰期长,因此在动物机体内发挥着重要的抗氧化保护作用。Nrf2对ROS反应非常灵敏,当其超过安全值时,Nrf2会迅速诱导下游基因抗氧化酶的表达,消除过多的ROS,减缓对蛋白质、脂质和核酸等生物分子的损伤。黑沙蒿多糖可通过提高Nrf2/Keap1信号通路中相关因子的表达,缓解LPS导致的肉仔鸡氧化损伤[19]。枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide, LBP)和桔梗多糖通过激活Nrf2信号通路,降低氧自由基的侵害,增加了肝细胞的抗氧化效应[15,31]。由此可见,Nrf2是植物多糖调控动物抗氧化能力的关键靶点,而相关研究表明PERK可以直接磷酸化Nrf2,促使Nrf2的核易位并诱导Nrf2靶基因的转录[32]。慈姑多糖可通过激活PERK/Nrf2通路,使GSH-Px和SOD活性升高,MDA含量降低,进而缓解ERS,减轻6种重金属联用导致的小鼠肝脏氧化应激[25]。红芪多糖也通过激活PERK/Nrf2信号通路,从而提高ob/ob小鼠的血清SOD活性,降低MDA含量,表明红芪多糖可有效缓解ERS,改善ob/ob小鼠肝脏的氧化应激[33]。以上结果提示,由植物多糖调控的PERK的活化,对Nrf2的磷酸化和核易位及其下游抗氧化基因的表达至关重要。
此外,Niu等[34]的研究表明,当归多糖中的主要成分选择性激活ATF6信号通路,可以降低ROS、MDA和乳酸脱氢酶(LDH)表达水平,提高抗氧化酶CAT表达水平,进而缓解ERS,改善氧化应激。
综上所述,当动物机体面临氧化应激时,可以通过添加植物多糖激活PERK/Nrf2信号通路和ATF6信号通路缓解ERS,进而改善氧化应激,但其具体作用机制有待进一步完善。
3 植物多糖通过缓解ERS调节动物的细胞凋亡
常见的由内质网介导的细胞凋亡相关通路有3条:PERK/真核翻译起始因子2α(eIF2α)通路、IRE1α/TRAF2/ASK1/Caspase-12通路、ATF6/CHOP通路,其中IRE1α/TRAF2/ASK1/Caspase-12通路是目前发现的唯一1条完整的ERS诱发的细胞凋亡通路[35]。含半胱氨酸的Caspase-12是附于内质网外膜的一种ERS介导的凋亡关键蛋白酶[36],CHOP是激活内质网凋亡的信号分子[37]。正常生理条件下,CHOP含量不高且位于细胞浆中,在细胞应激时,CHOP表达显著提高且移位至细胞核[38]。当ERS发生时,CHOP受到上游转录元件IRE1、PERK和ATF6的调控,其中ATF6被蛋白水解酶裂解,释放N-端胞质区(P50ATF6),P50ATF6作为转录因子之一提高CHOP表达[39],CHOP通过上调促凋亡基因B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(B-cell lymphoma-2-associated X protein, Bax)和下调抑凋亡基因B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma 2, Bcl-2)的表达,促使细胞周期停滞,进而使细胞凋亡。此外,CHOP与Caspase-12也具有关联性,细胞凋亡的关键蛋白酶Caspase-12可通过Caspase级联反应释放,而CHOP过表达有促进Caspase级联反应的作用[40]。
黄芪多糖(Astragalus polysaccharides, APS)有调节免疫、抗氧化和抗凋亡等作用。前人研究表明,APS可以通过减少CHOP的表达,上调Bcl-2表达,下调Bax表达,进而缓解二型糖尿病(T2DM)大鼠过强的ERS,抑制或延缓细胞凋亡[41];APS还可以通过降低GRP78蛋白表达量,阻断Caspase-12凋亡通路,抑制玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)诱导的鸡胸腺细胞凋亡,恢复细胞活性[42]。红芪药效优于黄芪,主要活性成分红芪多糖具有清除自由基、缓解ERS、抗氧化等作用[43]。先前研究发现,红芪多糖不仅能直接通过提高胃窦组织Bcl-2/Bax比值抑制细胞凋亡,还能通过抑制ATF6/CHOP通路,间接提高Bcl-2/Bax比值,从而抑制胃窦组织黏膜细胞凋亡[44-45]。此外,附子多糖可通过抑制Caspase-12,上调Bcl-2蛋白表达,下调GRP78、Caspase-12、CHOP、Bax蛋白表达,缓解ERS,抑制细胞凋亡[46]。
此外,当ERS发生时,活化的PERK可先通过eIF2α磷酸化抑制蛋白质的合成,减轻内质网压力,当ERS仍无法缓解时,则通过减少Bcl-2、B细胞淋巴瘤/白血病-xl(Bcl-xl)表达,增加BH3结构域凋亡诱导蛋白(BH3 interacting domain death agonist, Bid)、B细胞淋巴瘤2相互作用细胞死亡介质(B cell lymphoma 2 interacting mediator of cell death, Bim)表达,诱导细胞凋亡[47-48],而植物多糖可以通过缓解ERS,抑制细胞凋亡。郑烈等[49]的研究证明,毒胡萝卜素内酯(Tg)通过激活PERK/eIF2α凋亡信号通路诱导肠上皮细胞(IECs)凋亡,而添加黄芪多糖可有效缓解ERS,抑制细胞凋亡。
4 小结
免疫应激和氧化应激均会导致动物采食量和生长速度下降、饲料转化率降低等,持续的免疫应激还会导致动物出现免疫抑制,处于亚临床健康状态。而过度的细胞凋亡将会导致动物的免疫功能丧失或引发炎症反应。近年来研究发现,多糖作为植物中常见且非常重要的生物大分子,可以有效缓解动物机体的免疫应激、氧化应激和细胞凋亡,同时,ERS的相关通路也在以上3个方面发挥着重要的作用。已有研究证实,植物多糖能够缓解ERS,减少细胞因子的释放,从而抑制炎症反应;能够通过PERK/Nrf2信号通路、ATF6信号通路,缓解ERS,改善氧化应激;还可通过PERK/eIF2α信号通路、IRE1α/TRAF2/ASK1/Caspase-12信号通路、ATF6/CHOP信号通路,缓解ERS,从而抑制细胞凋亡。然而,植物多糖通过ERS发挥以上作用的相关机制还不够完善,仍需进一步深入研究。