Chinese Journal of Animal Nutrition >

2023 , Vol. 35 >Issue 12: 8148 - 8160

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2023.737

RESEARCH PAPER

Isolation, Identification, in Vitro Probiotic Function and Mouse Safety Evaluation of Canine-Derived Pediococcus acidilactici GLP236

  • ZHANG Yuanyuan , 1 ,
  • ZHAO Mengdi 1, 2 ,
  • LI Yueyao 1 ,
  • LIU Keyuan 1 ,
  • LI Guangyu , 1, *
Expand
  • 1 College of Animal Science and Technology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China
  • 2 College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
* professor, E-mail:

Received date: 2023-07-03

  Online published: 2023-12-11

Fold

Abstract

The aim of this study was to evaluate the probiotic properties and safety of canine-derived Pediococcus acidilactici GLP236. The taxonomic status of the strain was identified by Gram staining, 16S rRNA sequencing and physiological and biochemical characteristics. The probiotic properties and safety of the strain were evaluated by low pH, bile salts, gastrointestinal environment and high-temperature tolerance, strain self-coagulation, surface hydrophobicity, antioxidant activity, hemolytic activity, bacteriostatic activity, antibiotic susceptibility and mice instillation test. In the mice instillation test, eighty healthy Kunming mice with similar body weight were randomly divided into 4 groups with 20 mice in each group. Mice in the control group were orally administered 0.2 mL sterile physiological saline, and mice in other groups were orally administered 0.2 mL Pediococcus acidilactici GLP236 with concentrations of 1×109 (LG group), 1×1010 (MG group) and 1×1011 CFU/mL (HG group), respectively. The experiment lasted for 28 days. The results showed as follows: 1) GLP236 was identified as Pediococcus acidilactici in combination with 16S rRNA and physiological and biochemical results. 2) The strain entered the stabilization phase after 24 h of growth, and the pH was finally stabilized at 4.10. 3) The strain survival rates were 96.91%, 86.24% and 65.73% in 0.1%, 0.3% and 0.5% bile salts, respectively, and the survival rates were 73.81%, 94.11% and 64.18% in artificial gastric fluid, artificial intestinal fluid and artificial gastrointestinal fluid, respectively, and 80, 90 ℃ can withstand 5 min. 4) The strain self-coagulation rates were 57.02%, 77.56% and 87.22% at 8, 16 and 24 h, respectively, the surface hydrophobicity was 62.56%, and the free radical scavenging rates of 2,2-diazo-di (3-ethylbenzothiazole-6-sulfonic acid) diamine salt (ABTS) and 1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine (DPPH) were 87.28% and 80.70%. 5) The bacterial suspensions and cell-free cell supernatant could inhibit the growth of pathogenic bacteria, and the strains were insensitive to antibiotics such as benzoxacillin, ampicillin, gentamicinand so on, and showed gamma hemolysis. 6) The average daily gain of MG group was significantly higher than that of CK group and LG group (P<0.05), the average daily feed intake of MG group and HG group was significantly higher than that of CK group (P<0.05). The serum superoxide dismutase activity of MG group and HG group was significantly higher than that of CK group (P<0.05), and the serum malondialdehyde content was significantly lower than that of CK group (P<0.05); the serum aspartate aminotransferase activity of LG group, MG group and HG group was significantly lower than that of CK group (P<0.05), the serum urea nitrogen content of MG group was significantly lower than that of CK group (P<0.05). In conclusion, the canine-derived Pediococcus acidilactici GLP236 has good probiotic properties and can be used as a candidate for canine-derived probiotics.

Key words： canine; Pediococcus acidilactici; probiotic properties; safety evaluation

Cite this article

ZHANG Yuanyuan , ZHAO Mengdi , LI Yueyao , LIU Keyuan , LI Guangyu . Isolation, Identification, in Vitro Probiotic Function and Mouse Safety Evaluation of Canine-Derived Pediococcus acidilactici GLP236[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2023 , 35(12) : 8148 -8160 . DOI: 10.12418/CJAN2023.737

犬作为人们最主要的伴侣动物,其角色逐渐被拟人化,成为重要的家庭成员,宠物主也自称是宠物的“父母”[1-2]。犬作为人类关系最密切的宠物,也是最容易将致病菌传递给人类的携带者,宠物健康成为宠物主关心的主要问题[3]。据统计,2022年我国宠物消费市场规模已超过3 000亿元,其中宠物主对于科学配比、营养全面、具有保健功能的宠物食品消费量逐渐增加[4]。益生菌被定义为“食用足够数量时,对宿主健康产生有益作用的活体微生物”[5]。乳酸菌作为饲料添加剂中最常用的益生菌种类之一,可通过多种方式来改善动物机体健康,乳酸菌通过调节机体抗体分泌、干扰素-γ、肿瘤坏死因子、白细胞介素等细胞因子调控机体特异性和非特异性免疫系统,增强机体免疫功能[6]。乳酸菌能够提高营养物质消化率,合成部分维生素,促进动物生长[7]。此外,益生菌还具有抗癌、降胆固醇、预防宠物肥胖等功能[8⇓-10]。由于益生菌具有多种益生作用,因此被认为是一种良好的抗生素替代品。
由于宿主物种特异性,理想的益生菌往往来源于本源动物胃肠道。Raheem等[11]、Coman等[12]从犬中分离出植物乳杆菌、约氏乳杆菌和罗伊氏乳杆菌,这些乳酸菌在体外能够很好地生长,且具有较好的环境耐受性和益生特性。乳酸菌与致病菌竞争肠上皮细胞的黏附位点以及其分泌的代谢产物,如有机酸、细菌素等能够抑制病原菌的生长,调节肠道菌群组成,预防和治疗动物疾病的发生[13-14]。但关于犬源乳酸片球菌的研究还鲜见报道。目前益生菌在宠物市场中应用广泛,但大多数都是非犬源菌株,且大部分菌株未进行益生特性评价,使用效果也良莠不齐,无法满足快速发展的宠物市场需求[12,15]。因此,本研究旨在对犬源乳酸片球菌的益生特性和安全性进行评价,以期为宠物微生态制剂制备提供数据参考和科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

犬源乳酸片球菌为本实验室分离菌株。其他菌株包括大肠杆菌(ATCC25922)、沙门氏菌(ATCC14028)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)和单核细胞增生李斯特菌(ATCC19115)。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株活化

菌株按2%(V/V)接种量接种于MRS液体培养基(HB0384,青岛海博生物技术有限公司)中于37 ℃摇床恒温培养24 h,传代3次备用。

1.2.2 菌株鉴定

分子生物学鉴定:将待检测菌株按2%(V/V)接种量接种于10 mL MRS肉汤培养基,于37 ℃培养过夜,取1 mL菌液10 000 r/min离心10 min,弃上清,然后用等体积pH 7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬,10 000 r/min离心10 min洗涤,重复3次,收集菌体沉淀。根据细菌基因组提取试剂盒(TSP701-50,北京擎科生物技术股份有限公司)说明书提取菌株总基因组DNA。使用16S rRNA通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增。PCR反应体系50 μL:上游引物2 μL,下游引物2 μL,DNA模板2 μL,Taq Master Mix 25 μL,ddH2O 19 μL。PCR反应程序为:94 ℃预变性4 min,94 ℃变性45 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,30个循环,72 ℃延伸10 min,置于4 ℃保存。PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳,剩余PCR扩增产物送北京擎科生物科技有限公司进行16S rRNA测序。测序结果通过NCBI数据库进行在线同源性比对,利用MEGA 11软件构建系统发育树,分析菌株的进化关系。
形态学鉴定:将菌株划线于MRS琼脂平板于37 ℃培养18 h后用灭菌的接种环挑取单菌落,轻轻涂抹在滴有蒸馏水的载玻片上,然后进行革兰氏染色,染色完成后在显微镜下观察菌株形态。
生理生化鉴定:采用细菌微量生化鉴定管(SHBG13,青岛海博生物技术有限公司)进行菌株生理生化试验,具体步骤按照说明书进行。

1.2.3 生长曲线和产酸能力的测定

将菌株按照2%(V/V)接种量接种于MRS肉汤培养基中,分别在0、2、4、6、9、12、15、18、24、30、36 h吸取适量菌液检测600 nm处吸光度值(OD600)和菌液pH,以时间为横坐标,OD600和pH为纵坐标,绘制菌株的生长曲线和产酸曲线。

1.2.4 菌株在不同pH环境中的生长曲线

将菌株按照2%(V/V)接种量分别接种于pH为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0的MRS肉汤培养基中,分别在0、2、4、6、9、12、15、18、24、30、36、42、48 h吸取适量菌液检测OD600,以时间为横坐标,OD600为纵坐标,绘制生长曲线。

1.2.5 胃肠道耐受性试验

1.2.5.1 耐胆盐试验

取活化培养18 h后的菌液10 000 r/min离心10 min,弃上清,用PBS洗涤2次,分别重悬于含0.1%、0.3%和0.5%胆盐的MRS液体培养基中,置于37 ℃培养0和4 h,进行梯度稀释,取适量稀释液涂布在MRS琼脂平板上,置于37 ℃恒温培养箱培养24 h,进行平板活菌计数。重复3次试验,取平均值。按照如下公式计算存活率:
存活率(%)=100×lg(培养4 h活菌数)/lg(培养0 h活菌数)。

1.2.5.2 人工胃肠道模型耐受性试验

取活化培养18 h后的菌液10 000 r/min离心10 min,弃上清,用PBS洗涤2次,用等体积的人工胃液和人工肠液重悬,于37 ℃孵育1.5和3.0 h。人工胃液孵育后,10 000 r/min离心10 min,弃上清,用PBS洗涤2次,用等体积的人工肠液重悬,于37 ℃孵育3 h。在人工胃液和人工肠液孵育前、后分别取适量菌液进行梯度稀释涂布平板,置于37 ℃恒温培养箱培养24 h,进行平板活菌计数。重复3次试验,取平均值。按照如下公式计算存活率:
存活率(%)=100×lg(人工胃液或人工肠液孵育后活菌数)/lg(人工胃液或人工肠液孵育前活菌数)。

1.2.6 耐高温试验

参考Min等[16]方法并改进,取活化培养18 h后的菌液,分别于60、70、80、90 ℃水浴热处理5、10、15 min。热处理前、后分别取适量菌液进行梯度稀释涂布平板,置于37 ℃恒温培养箱培养24 h,进行平板活菌计数。重复3次试验,取平均值。按照如下公式计算存活率:
存活率(%)=100×lg(热处理后活菌数)/lg(热处理前活菌数)。

1.2.7 自凝聚力试验

取活化培养18 h后的菌液10 000 r/min离心10 min,弃上清,用PBS洗涤2次,然后重悬于等体积的PBS中,测量630 nm处吸光度值(OD630)(A1),然后涡旋振荡10 s,置于37 ℃恒温培养箱分别孵育8、16、24 h,仔细吸取上部,测量OD630(A2)。重复3次试验,取平均值。按照如下公式计算自凝聚率:
自凝聚率(%)=100×(1-A2/A1)。

1.2.8 表面疏水性试验

取活化培养18 h后的菌液10 000 r/min离心10 min,弃上清,用PBS洗涤2次,调节菌液OD630为(0.25±0.05)(A3)备用。然后,以1∶1的比例加入二甲苯和氯仿混合液,涡旋振荡5 min,置于37 ℃恒温培养箱孵育4 h。然后,小心地吸取水相,测量OD630(A4)。重复3次试验,取平均值。按照如下公式计算疏水率:
疏水率(%)=100×(1-A4/A3)。

1.2.9 抗氧化试验

使用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(BC4750)和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)(BC4770)检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)测定分离菌株的DPPH和ABTS自由基清除能力,具体步骤按照说明书进行操作。

1.2.10 抑菌试验

采用牛津杯琼脂扩散法测定菌株抑菌活性。制备带有牛津杯孔的LB琼脂平板备用。取活化培养18 h后的菌液10 000 r/min离心10 min,去除无细胞上清液,将细菌沉淀重悬于等体积的PBS中。分别取100 μL浓度为1×107 CFU/mL大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和单核细胞增生李斯特菌涂布于带有牛津杯孔的LB琼脂平板(青岛海博生物技术有限公司)上。待菌液完全吸收后,牛津杯孔中分别加入100 μL的活化培养18 h后的菌液、无细胞上清液和细菌沉淀,置于37 ℃恒温培养箱培养24~48 h,观察是否有抑菌圈形成,并准确量取抑菌圈直径。重复3次试验,取平均值。

1.2.11 抗生素敏感性试验

采用纸片扩散法测定菌株抗生素敏感性。取活化18 h后菌液100 μL均匀涂布在MRS琼脂平板上,选取青霉素、苯唑西林、氨苄西林、哌拉西林、亚胺培南、万古霉素、链霉素、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素、四环素、氯霉素、米诺环素、强力霉素、复方新诺明、阿奇霉素、红霉素、克林霉素、诺氟沙星、环丙沙星和左氧氟沙星等抗生素纸片贴于MRS琼脂平板上,置于37 ℃恒温培养箱培养24~48 h,观察是否有抑菌圈形成,并准确量取抑菌圈直径。重复3次试验,取平均值。

1.2.12 安全试验

1.2.12.1 溶血试验

取活化培养18 h后的分离菌菌液在血平板上划线,置于37 ℃恒温培养箱培养48 h,检查血平板是否存在溶血迹象,并判断溶血类型。以金黄色葡萄球菌菌株(ATCC25923)作为阳性对照。

1.2.12.2 小鼠安全性试验

将生长健康、体重相近的80只昆明小鼠随机分为4组,每组20只,公母各占1/2。对照组(CK组)小鼠灌服0.2 mL无菌生理盐水,其他3组小鼠灌服0.2 mL浓度分别为1×109(LG组)、1×1010(MG组)和1×1011 CFU/mL(HG组)的分离菌株。试验期共28 d,每3 d称量1次小鼠体重和采食量,并记录小鼠的健康状况。第27天,将小鼠禁食12 h,然后用1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉。腹主动脉采血收集血液,并通过离心(4 000 r/min,4 ℃,10 min)收集血清,测定小鼠血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性及总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、间接胆红素(IBIL)、尿素氮(UN)、丙二醛(MDA)含量。

1.3 统计分析

使用Excel 2019进行数据记录,采用SPSS 26.0统计软件的one-way ANOVA模型进行单因素方差分析,通过LSD法进行组间多重比较,试验结果以“平均值±标准差”表示,P<0.05为显著差异,P>0.05为差异不显著。

2 结果

2.1 分子生物学鉴定结果

菌株16S rRNA基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳如图1-A所示,其大小约1 500 bp。基于16S rRNA测序基因序列,构建菌株GLP236系统进化树如图1-B所示,根据菌株序列对比,确定该菌株为乳酸片球菌,并将其命名为乳酸片球菌GLP236。
图1 乳酸片球菌GLP236琼脂糖凝胶电泳及进化树

Pediococcus acidilactici strain CPB3:乳酸片球菌菌株CPB3;Pediococcus acidilactici strain 3-161:乳酸片球菌菌株3-161;Pediococcus acidilactici strain HBUAS56314:乳酸片球菌菌株HBUAS56314;Lactiplantibacillus plantarum strain NBRC 15891:植物乳杆菌菌株NBRC 15891。

Fig.1 Results of agarose gel electrophoresis and evolutionary tree of Pediococcus acidilactici GLP236

2.2 菌株形态特征

乳酸片球菌GLP236在MRS琼脂培养基上菌落形态如图2-A所示,呈圆形、边缘光滑、中央凸起、乳白色菌落,为圆形,单个、成对或排列成链状;细胞形态如图2-B所示,菌体呈球状,革兰氏染色呈紫色,因此该菌株为革兰氏阳性菌。
图2 乳酸片球菌GLP236菌落形态(A)和革兰氏染色镜检图(B)

Fig.2 Colony morphology (A) and microscopic examination image of Gram staining (B) of Pediococcus acidilactici GLP236 (1 000×)

2.3 菌株生理生化特性

乳酸片球菌GLP236生理生化特性如表1所示,该菌株可利用葡萄糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖等单糖,纤维二糖、麦芽糖等二糖,木糖等多糖;甲基红试验阳性,其余为阴性。
表1 乳酸片球菌GLP236生理生化特性

Table 1 Physiological and biochemical characteristics of Pediococcus acidilactici GLP236

项目Items 结果Results 项目Items 结果Results
葡萄糖Aesculin + 水杨苷Salicin -
半乳糖Cellobiose + 菊粉Inulin -
纤维二糖Glucose + 1%马尿酸钠1% sodium equine -
麦芽糖Galactose + 硫化氢试验Hydrogen sulfide test -
蔗糖Sucrose - 淀粉水解试验Starch hydrolysis test -
鼠李糖Maltose - 吲哚试验Indole test -
果糖Fructose + 硝酸盐产气试验Nitrate gas production test -
棉子糖Raffinose - 硝酸盐还原试验Nitrate reduction test -
乳糖Lactose - 甲基红试验Methyl red test +
L-鼠李糖L-rhamnose - V-P试验Voges-Prokauer test -
阿拉伯糖Pectinose + 过氧化氢试验Hydrogen peroxide test -
木糖Xylose + 明胶液化试验Gelatin liquidized test -
甘露醇Mannitol - 流动性Mobility -
山梨糖醇Sorbitol - 尿素试验Urease test -
七叶苷Aesculin - 氧化酶试验Oxidase test -

+:阳性 positive;-:阴性 negative。

2.4 菌株生长曲线和产酸曲线

乳酸片球菌GLP236生长曲线和产酸曲线如图3所示,菌株接种0~2 h处于生长迟缓期,接种2 h后菌株生长迅速进入对数期,接种24 h后菌液OD600趋于稳定,菌株生长进入稳定期。菌液pH接种2 h内下降缓慢,从5.63下降至5.48,接种3 h后pH下降迅速,接种24 h后pH趋于稳定,最终pH稳定在4.10左右。
图3 乳酸片球菌GLP236生长曲线和产酸曲线

OD600:600 nm处吸光度值 absorbance value at 600 nm。图4同 the same as Fig.4.

Fig.3 Growth curve and acid production curve of Pediococcus acidilactici GLP236

2.5 菌株在不同pH中的生长曲线

乳酸片球菌GLP236在不同pH环境下生长曲线如图4所示,pH<3.5时,完全抑制菌株的生长。pH=4.0时,菌株能够生长,但OD600明显低于pH=5.0、6.0、7.0时。pH≥5.0时,菌株能够正常生长,其OD600存在一定差异,pH 5.0<pH 6.0<pH 7.0。菌株不能耐受pH=12的碱性环境。
图4 乳酸片球菌GLP236在不同pH中的生长曲线

Fig.4 Growth curves at different pH of Pediococcus acidilactici GLP236

2.6 胃肠道耐受性试验

2.6.1 菌株耐胆盐结果

如图5所示,乳酸片球菌GLP236在胆盐浓度为0.1%、0.3%和0.5%的培养基中耐受4 h后,菌株的存活率分别为96.91%、86.24%和65.73%,活菌数分别约为1.14×109、1.37×106和1.92×103 CFU/mL。
图5 乳酸片球菌GLP236在不同浓度胆盐中的存活率

Fig.5 Survival rate of Pediococcus acidilactici GLP236 in different concentrations of bile salt

2.6.2 菌株对人工胃肠道模型耐受性结果

如表2所示,接种于人工胃液1.5 h后菌株的存活率为73.81%,接种于人工肠液3 h后菌株存活率为94.11%,接种于人工胃肠液4.5 h后菌株的存活率为64.18%。
表2 乳酸片球菌GLP236在人工胃肠液中的存活率

Table 2 Survival rates of Pediococcus acidilactici GLP236 in gastrointestinal juices

项目
Items		 人工胃液
Artificial gastric juice		 人工肠液
Artificial intestinal juice		 人工胃肠液
Artificial gastrointestinal juice
耐受时间Tolerance time/h 0 1.5 0 3.0 0 4.5
活菌数Viable count/[lg(CFU/mL)] 8.42 6.21 10.93 10.29 8.42 5.43
存活率Survival rate/% 73.81±0.74 94.11±0.76 64.18±2.07

2.7 菌株耐高温结果

如表3所示,乳酸片球菌GLP236经60和70 ℃高温处理15 min后仍有近1/2存活率,可耐受80 ℃高温处理10 min和90 ℃高温处理5 min。
表3 乳酸片球菌GLP236耐高温处理后存活率

Table 3 Survival rates of Pediococcus acidilactici GLP236 after resistance to heat treatment %

项目
Items		 热处理时间Heat treatment time/min
5 10 15
60 ℃ 74.27±0.16 71.11±0.33 54.19±0.10
70 ℃ 66.22±0.31 65.07±0.47 46.44±0.16
80 ℃ 48.45±0.24 18.16±0.75 0.00±0.00
90 ℃ 36.82±0.60 0.00±0.00 0.00±0.00

2.8 菌株自凝聚力结果

如图6所示,乳酸片球菌GLP236培养8、16和24 h后的自凝聚率分别为57.02%、77.56%和87.22%,说明菌株具有高自凝聚力。
图6 乳酸片球菌GLP236自凝聚率试验结果

Fig.6 Self-condensation rate test results of Pediococcus acidilactici GLP236

2.9 表面疏水性结果

如表4所示,乳酸片球菌GLP236表面疏水率为62.56%,说明菌株具有高度表面疏水性。
表4 乳酸片球菌GLP236表面疏水性试验结果

Table 4 Results of surface hydrophobicity test of Pediococcus acidilactici GLP236 %

项目Item 表面疏水率Hydrophobic surface
乳酸片球菌GLP236 Pediococcus acidilactici GLP236 62.56

2.10 菌株抗氧化结果

如表5所示,乳酸片球菌GLP236对ABTS和DPPH自由基均具有较高的清除能力,ABTS自由基清除率为87.28%,DPPH自由基清除率为80.70%。
表5 乳酸片球菌GLP236自由基清除率试验结果

Table 5 Results of free radical scavenging rate test of Pediococcus acidilactici GLP236 %

项目Items 自由基清除率Free radical scavenging rate
2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐ABTS 87.28
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼DPPH 80.70

2.11 菌株抑菌性能结果

如图7所示,乳酸片球菌GLP236的菌悬液和无细胞上清液能够有效抑制5种致病菌的生长增殖,而菌体沉淀和MRS液体培养基无抑菌作用。如表6所示,菌悬液对铜绿假单胞菌和单核细胞增生李斯特菌的抑制效果显著优于大肠杆菌(P<0.05),无细胞上清液对铜绿假单胞菌和单核细胞增生李斯特菌的抑制效果显著优于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌(P<0.05)。
图7 乳酸片球菌GLP236对致病菌抑菌效果

A:大肠杆菌 Escherichia coli;B:金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus;C:沙门氏菌 Salmonella;D:铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa;E:单核细胞增生李斯特菌 Listeria monocytogenes;a:无细胞上清液 cell free supernatant;b:菌悬液 bacterial suspensions;c:MRS液体培养基 MRS liquid culture medium;d:细菌沉淀 bacterial precipitation。

Fig.7 Antibacterial effects of Pediococcus acidilactici GLP236 on pathogenic bacteria

表6 乳酸片球菌GLP236抑菌试验结果

Table 6 Results of bacteriostatic test of Pediococcus acidilactici GLP236mm

项目
Items		 菌悬液抑菌圈直径
Inhibition circle diameter of
bacterial suspension		 无细胞上清液抑菌圈直径
Inhibition circle diameter of
cell free supernatant
大肠杆菌Escherichia coli 16.92±2.34a 17.25±1.05a
金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus 17.62±1.26ab 17.19±1.57a
沙门氏菌Salmonella 18.87±3.53abc 17.44±3.63a
铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 21.11±1.20bc 20.37±1.03b
单核细胞增生李斯特菌Listeria monocytogenes 20.16±0.72c 20.91±0.87b

同列数据肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05),肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

In the same column, values with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

2.12 菌株抗生素敏感性结果

药敏片直径为6 mm,故设抑菌圈直径大于7 mm的具有抑菌性,小于等于7 mm视为无抑菌性。如表7所示,乳酸片球菌GLP236对米诺环素、红霉素和氯霉素3种抗生素敏感性强,抑菌圈直径大于23 mm;对青霉素、哌拉西林、头孢唑林、头孢呋辛钠、头孢曲松、头孢哌酮、阿奇霉素、克林霉素、亚胺培南、强力霉素和氟苯尼考11种抗生素的抑菌圈直径在15~22 mm;对头孢氨苄和左氧氟沙星2种抗生素的抑菌圈直径在7~14 mm;对苯唑西林、氨苄西林、头孢他啶、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、四环素、诺氟沙星、环丙沙星、林可霉素、万古霉素、多黏菌素B和复方新诺明14种抗生素不敏感。
表7 乳酸片球菌GLP236抗生素敏感试验结果

Table 7 Results of antibiotic susceptibility test of Pediococcus acidilactici GLP236

抗生素
Antibiotics		 浓度
Concentration/
(μg/片)		 结果
Result		 抗生素
Antibiotics		 浓度
Concentration/
(μg/片)		 结果
Result
青霉素PEN 10 ++ 阿米卡星AMK 30 -
苯唑西林OX 1 - 庆大霉素GEN 10 -
氨苄西AMP 10 - 卡那霉素KAN 30 -
哌拉西林PIP 100 ++ 链霉素S 10 -
头孢氨苄CN 30 + 四环素TET 30 -
头孢唑林CZ 30 ++ 米诺环素MI 30 +++
头孢呋辛CXM 30 ++ 红霉素E 15 +++
头孢他啶CAZ 30 - 阿奇霉素AZI 15 ++
头孢曲松CRT 30 ++ 诺氟沙星NOR 10 -
头孢哌酮CPZ 75 ++ 环丙沙星CIP 5 -
林可霉素MY 2 - 克林霉素CC 2 ++
万古霉素VAN 30 - 左氧氟沙星LEV 5 +
多黏菌素BPB 300 - 亚胺培南IPM 10 ++
复方新诺明SXT 25 - 强力霉素DO 30 ++
氯霉素C 30 +++ 氟苯尼考FFC 30 ++

+++:抑菌圈直径23~30 mm;++:抑菌圈直径15~22 mm;+:抑菌圈直径7~14 mm;-:没有抑菌圈。

+++: inhibition circle diameter 23 to 30 mm; ++: inhibition circle diameter 15 to 22 mm; +: inhibition circle diameter 7 to 14 mm; -: no inhibition circle.

2.13 安全评价

2.13.1 溶血试验结果

如图8所示,乳酸片球菌GLP236无溶血环,为γ溶血;阳性对照金黄色葡萄球菌周围有透明溶血环,为β溶血。
图8 乳酸片球菌GLP236溶血试验结果

GLP:乳酸片球菌GLP236 Pediococcus acidilactici GLP236。

Fig.8 Hemolysis test results of Pediococcus acidilactici GLP236

2.13.2 小鼠安全性试验结果

2.13.2.1 乳酸片球菌GLP236对小鼠生长性能的影响

在饲喂乳酸片球菌GLP236期间均无小鼠死亡,剖检未见异常。如表8所示,MG组小鼠平均日增显著高于CK组和LG组(P<0.05),MG组和HG组小鼠平均日采食量显著高于CK组(P<0.05);与对照组相比,各试验组小鼠的终末体重有所提高,料重比有所降低,但无显著差异(P>0.05)。
表8 乳酸片球菌GLP236对小鼠生长性能的影响

Table 8 Effects of Pediococcus acidilactici GLP236 on growth performance of mice

项目
Items		 组别Groups
CK LG MG HG
初始体重IBW/g 33.44±2.01 33.30±2.22 32.46±2.93 33.54±2.65
终末体重FBW/g 44.59±2.23 44.88±2.94 45.62±4.29 45.46±3.03
平均日增重ADG/(g/d) 0.40±0.04a 0.42±0.07a 0.47±0.07b 0.43±0.08ab
平均日采食量ADFI/(g/d) 5.11±0.08a 5.22±0.17ab 5.42±0.12b 5.34±0.12b
料重比F/G 12.39±0.44 12.19±0.56 11.17±0.68 12.19±1.33

同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.13.2.2 乳酸片球菌GLP236对小鼠血清生化指标的影响

由表9可知,MG组和HG组血清SOD活性显著高于CK组(P<0.05),血清MDA含量显著低于CK组(P<0.05);LG、MG和HG组血清AST活性显著低于CK组(P<0.05);MG组血清UN含量显著低于CK组(P<0.05);各组之间血清ALT活性和TBIL、DBIL、IBIL含量无显著差异(P>0.05)。
表9 乳酸片球菌GLP236对小鼠血清生化指标的影响

Table 9 Effects of Pediococcus acidilactici GLP236 on serum biochemical indices of mice

项目
Items		 组别Groups
CK LG MG HG
超氧化物歧化酶SOD/(U/mL) 81.21±14.84a 85.48±15.21a 107.75±16.48b 106.14±11.18b
丙二醛MDA/(nmol/mL) 8.58±0.65a 7.98±1.02ab 7.47±0.63b 7.75±0.87b
天冬氨酸氨基转移酶AST/(U/L) 239.91±41.85a 191.19±65.04b 187.52±22.61b 192.94±33.72b
丙氨酸氨基转移酶ALT/(U/L) 155.26±20.61 136.71±24.77 137.70±24.48 135.45±27.72
尿素氮UN/(mmol/L) 8.92±0.99a 8.47±1.21a 7.00±1.50b 7.83±0.86ab
总胆红素TBIL/(μmol/L) 7.31±1.63 6.55±1.03 6.42±1.39 6.57±1.49
直接胆红素DBIL/(μmol/L) 4.93±1.59 4.37±0.96 4.20±1.23 4.20±1.47
间接胆红素IBIL/(μmol/L) 2.38±1.06 2.18±0.85 2.21±1.15 2.37±1.10

3 讨论

3.1 菌株对环境耐受性

本研究从健康比格犬的粪便中分离出一株乳酸片球菌GLP236,并进行体外益生功能和安全性评价,目的是为宠物源乳酸菌的益生功能提供数据参考。乳酸菌经口腔进入动物胃肠道的过程中,胃液的pH、胃蛋白酶和胆汁酸是影响益生菌生存的关键因素。因此,耐低pH、耐胆盐和胃肠道模型耐受性是评价益生菌益生功能的关键因素。研究表明,乳酸菌对胃肠道环境具有较好的耐受性[17]。Li等[18]对鸡、猪和兔子盲肠中分离得到的乳酸片球菌进行酸耐受性试验,结果表明,pH<5时对乳酸片球菌都具有一定增殖抑制作用。本研究中,pH<4.0时对乳酸片球菌GLP236具有增殖抑制作用,与其他研究结果一致。本研究中,乳酸片球菌GLP236在0.3%和0.5%胆盐中4 h后的存活率仍达到86.24%和65.73%,明显高于Li等[18]分离鉴定的乳酸片球菌胆盐耐受性,可能是因为菌株来源不同。乳酸片球菌GLP236对人工胃肠道模型中也具有较好的存活率,因此该菌株对胃肠道环境具有较好的耐受性,经口腔到达肠道后能够保留较好的存活率。益生菌在加工过程中通常需要经过高温喷涂过程,因此耐热稳定性好的菌株具有加工工艺优势[19]。本研究中乳酸片球菌GLP236具有较好的耐高温特性。

3.2 菌株益生特性

益生菌需要黏附定植在肠道中才发挥其益生作用。细菌黏附性受到细胞表面蛋白表达水平的变化以及环境对某些蛋白质表达的影响,这些蛋白质负责细胞表面疏水性或细胞黏附性[20]。细菌自聚集能力是相同菌株细胞之间的聚集,评估了细菌在肠道中的持久性,菌株必须具备疏水性才能黏附在肠黏膜或肠上皮[21]。细菌自凝聚能力一般分为:低(自凝聚率16%~35%)、中等(自凝聚率35%~50%)、高(自凝聚率50%以上)3类[22]。根据细菌表面疏水性定义标准,一般设定表面疏水率>50%为高度疏水,表面疏水率20%~50%为中度疏水,表面疏水率<20%为非疏水[22]。本研究中,乳酸片球菌GLP236具有高度自凝聚率和表面疏水率,因此该菌株在犬肠道中可能会很好的黏附定植。
一些研究报道,乳酸菌有很强的抗氧化活性[23]。微生物具有自己的抗氧化系统,能够维持机体较低的自由基水平,减少氧化损伤[24]。ABTS和DPPH自由基被广泛用于抗氧化活性评估,自由基的清除率越高,抗氧化活性越强。本研究中,乳酸片球菌GLP236对ABTS和DPPH自由基的清除率均超过80%,均高于Ji等[25]关于乳酸菌抗氧化活性的研究,说明该菌株具有较好抗氧化活性,可增强机体抗氧化能力。

3.3 菌株体外安全性评价

许多研究表明,乳酸菌可以产生细菌素、有机酸、过氧化氢等多种抗菌代谢产物,对致病菌产生抑制作用[26-27]。本研究对与胃肠道疾病相关的5种致病菌进行抑菌试验。MRS液体培养基无抑菌作用,排除了培养基对致病菌生长增殖的影响。乳酸片球菌GLP236的菌悬液和无细胞上清液具有明显的抑菌效果,而菌体沉淀无抑菌效果,说明起抑菌作用的可能是乳酸片球菌GLP236的代谢产物而非菌体蛋白。有研究表明,乳酸菌可能含有抗生素抗性基因[28-29]。携带可转移抗生素耐药性基因的益生菌进入动物机体中可能会转移到共生菌或致病菌身上,从而产生耐药性。因此,抗生素耐药性是评估益生菌安全性的重要指标[28,30]。据报道,大多数乳酸菌对庆大霉素、链霉素和环丙沙星耐药[31],与本研究结果相一致。先前研究表明,多数乳酸菌对氨苄西林、青霉素、红霉素、四环素和氯霉素敏感[28]。在本研究中,乳酸片球菌GLP236对氨苄西林与四环素耐药与先前研究结果不一致,可能与菌株特异性有关。溶血性也是评价益生菌安全性的一项重要指标。本研究中,乳酸片球菌GLP236无溶血现象,与Tarrah等[32]报道的益生菌无溶血现象相一致,说明该菌株可能是安全的益生菌。

3.4 菌株体内安全性评价

乳酸片球菌GLP236经过一系列体外益生性评价,发现该菌株具有良好的益生潜力。进一步开展小鼠体内安全性评价。整个试验期内所有小鼠均无死亡现象,且MG组小鼠平均日增重显著提高,说明乳酸菌GLP236可能改善小鼠生长性能。血清AST、ALT、TBIL、DBIL和IBIL是常用的肝功能评价指标,其活性或含量升高可能出现肝功能障碍或肝细胞损伤[33]。本研究中,饲喂益生菌小鼠血清肝功指标较对照组未出现升高。UN是肾功能评价指标,UN含量升高可能出现肾脏损伤,SOD活性与MDA含量表示机体抗氧化水平[34-35]。本研究中,MG组小鼠血清SOD活性升高,MDA和UN含量显著降低。这些结果表明,饲喂乳酸片球菌GLP236对小鼠肝脏和肾脏无毒副作用,还具有增强机体抗氧化作用。因此,乳酸片球菌GLP236是一株具有良好益生功能的益生菌。

4 结论

经分子生物学鉴定,菌株GLP236为乳酸片球菌,该菌株对低pH、胆盐、高温和胃肠道环境具有良好的耐受性,菌株表面疏水性和自凝聚性强,具有较强抗氧化应激能力和致病菌的抑菌效果,对庆大霉素和链霉素等耐药,对青霉素和红霉素等敏感,γ溶血,对小鼠无毒副作用。综上所述,乳酸片球菌GLP236具有良好的益生菌特性和安全性,可作为犬源益生菌的候选菌株。

References

Publishing order | Descend order by publishing year | Descend order by cited within
[1]
GRZEŚKOWIAK Ł, ENDO A, BEASLEY S, et al. Microbiota and probiotics in canine and feline welfare[J]. Anaerobe, 2015, 34:14-23.

DOI PMID

[2]
DE GODOY M R C, HERVERA M, SWANSON K S, et al. Innovations in canine and feline nutrition:technologies for food and nutrition assessment[J]. Annual Review of Animal Biosciences, 2016, 4:311-333.

DOI

[3]
SONG S J, LAUBER C, COSTELLO E K, et al. Cohabiting family members share microbiota with one another and with their dogs[J]. eLife, 2013, 2:e00458.

DOI

[4]
佚名. 宠物保健品消费态度洞察白皮书[C]// 艾瑞咨询系列研究报告(2022年第8期). 上海: 上海艾瑞市场咨询有限公司, 2022:2-47.

Anon. White paper on perception of consumer attitudes towards pet health products[C]// IResearch Consulting Series Research Report (Issue 8,2022). Shanghai: Shanghai Airui Market Consulting Co., Ltd, 2022:2-47. (in Chinese)

[5]
HILL C, GUARNER F, REID G, et al. Expert consensus document.The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics consensus statement on the scope and appropriate use of the term probiotic[J]. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 2014, 11(8):506-514.

[6]
RIAZRAJOKA M S, SHI J L, ZHU J, et al. Capacity of lactic acid bacteria in immunity enhancement and cancer prevention[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2017, 101(1):35-45.

DOI PMID

[7]
文生攀. 乳酸菌在动物营养中的研究进展[J]. 中国畜牧兽医文摘, 2017, 33(12):230.

WEN S P. Research progress of lactic acid bacteria in animal nutrition[J]. Chinese Abstracts of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2017, 33(12):230. (in Chinese)

[8]
BENDER M J, MCPHERSON A C, PHELPS C M, et al. Dietary tryptophan metabolite released by intratumoral Lactobacillus reuteri facilitates immune checkpoint inhibitor treatment[J]. Cell, 2023, 186(9):1846-1862.e26.

DOI

[9]
BHAT B, BAJAJ B K. Multifarious cholesterol lowering potential of lactic acid bacteria equipped with desired probiotic functional attributes[J]. 3 Biotech, 2020, 10(5):200.

DOI PMID

[10]
LU X J, JING Y, LI Y Y, et al. The differential modulatory effects of Eurotium cristatum on the gut microbiota of obese dogs and mice are associated with improvements in metabolic disturbances[J]. Food & Function, 2021, 12(24):12812-12825.

[11]
RAHEEM A, WANG M Y, ZHANG J W, et al. The probiotic potential of Lactobacillus plantarum strain RW1 isolated from canine faeces[J]. Journal of Applied Microbiology, 2022, 132(3):2306-2322.

DOI

[12]
COMAN M M, VERDENELLI M C, CECCHINI C, et al. Probiotic characterization of Lactobacillus isolates from canine faeces[J]. Journal of Applied Microbiology, 2019, 126(4):1245-1256.

DOI

[13]
XU H Y, ZHAO F Y, HOU Q C, et al. Metagenomic analysis revealed beneficial effects of probiotics in improving the composition and function of the gut microbiota in dogs with diarrhoea[J]. Food & Function, 2019, 10(5):2618-2629.

[14]
ANJANA,TIWARI S K. Bacteriocin-producing probiotic lactic acid bacteria in controlling dysbiosis of the gut microbiota[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2022, 12:851140.

DOI

[15]
PILLA R, SUCHODOLSKI J S. The role of the canine gut microbiome and metabolome in health and gastrointestinal disease[J]. Frontiers in Veterinary Science, 2019, 6:498.

DOI PMID

[16]
MIN B, YOO D, LEE Y, et al. Complete genomic analysis of Enterococcus faecium heat-resistant strain developed by two-step adaptation laboratory evolution method[J]. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2020, 8:828.

DOI

[17]
NOOHI N, EBRAHIMIPOUR G, ROHANI M, et al. Evaluation of potential probiotic characteristics and antibacterial effects of strains of Pediococcus species isolated from broiler chickens[J]. British Poultry Science, 2016, 57(3):317-323.

DOI

[18]
LI C, WANG S L, CHEN S, et al. Screening and characterization of Pediococcus acidilactici LC-9-1 toward selection as a potential probiotic for poultry with antibacterial and antioxidative properties[J]. Antioxidants, 2023, 12(2):215.

DOI

[19]
SANTIVARANGKNA C, KULOZIK U, FOERST P. Inactivation mechanisms of lactic acid starter cultures preserved by drying processes[J]. Journal of Applied Microbiology, 2008, 105(1):1-13.

DOI PMID

[20]
CHAFFANEL F, CHARRON-BOURGOIN F, SOLIGOT C, et al. Surface proteins involved in the adhesion of Streptococcus salivarius to human intestinal epithelial cells[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2018, 102(6):2851-2865.

DOI

[21]
FARID W, MASUD T, SOHAIL A, et al. Gastrointestinal transit tolerance,cell surface hydrophobicity,and functional attributes of Lactobacillus acidophilus strains isolated from indigenous Dahi[J]. Food Science Nutrition, 2021, 9(9):5092-5102.

DOI

[22]
ANGMO K, KUMARI A, SAVITRI, et al. Probiotic characterization of lactic acid bacteria isolated from fermented foods and beverage of Ladakh[J]. LWT-Food Science and Technology, 2016, 66:428-435.

DOI

[23]
SHI Y J, CUI X Y, GU S S, et al. Antioxidative and probiotic activities of lactic acid bacteria isolated from traditional artisanal milk cheese from northeast China[J]. Probiotics and Antimicrobial Proteins, 2019, 11(4):1086-1099.

DOI PMID

[24]
RWUBUZIZI R, KIM H, HOLZAPFEL W H, et al. Beneficial,safety,and antioxidant properties of lactic acid bacteria:a next step in their evaluation as potential probiotics[J]. Heliyon, 2023, 9(4):e15610.

DOI

[25]
JI K, CHO Y S, KIM Y T. Tyrosinase inhibitory and anti-oxidative effects of lactic acid bacteria isolated from dairy cow feces[J]. Probiotics and Antimicrobial Proteins, 2018, 10(1):43-55.

DOI PMID

[26]
HASANNEJAD BIBALAN M, ESHAGHI M, ROHANI M, et al. Determination of bacteriocin genes and antibacterial activity of Lactobacillus strains isolated from fecal of healthy individuals[J]. International Journal of Molecular and Cellular Medicine, 2017, 6(1):50-55.

[27]
GILES-GÓMEZ M, SANDOVAL GARCÍA J G, MATUS V, et al. In vitro and in vivo probiotic assessment of Leuconostoc mesenteroides P45 isolated from pulque,a Mexican traditional alcoholic beverage[J]. SpringerPlus, 2016, 5(1):708.

DOI

[28]
HUMMEL A S, HERTEL C, HOLZAPFEL W H, et al. Antibiotic resistances of starter and probiotic strains of lactic acid bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(3):730-739.

PMID

[29]
KUSHIRO A, CHERVAUX C, COOLS-PORTIER S, et al. Antimicrobial susceptibility testing of lactic acid bacteria and bifidobacteria by broth microdilution method and Etest[J]. International Journal of Food Microbiology, 2009, 132(1):54-58.

DOI PMID

[30]
MATHUR S, SINGH R. Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria—a review[J]. International Journal of Food Microbiology, 2005, 105(3):281-295.

DOI

[31]
KASTNER S, PERRETEN V, BLEULER H, et al. Antibiotic susceptibility patterns and resistance genes of starter cultures and probiotic bacteria used in food[J]. Systematic and Applied Microbiology, 2006, 29(2):145-155.

DOI PMID

[32]
TARRAH A, DA SILVA DUARTE V, DE CASTILHOS J, et al. Probiotic potential and biofilm inhibitory activity of Lactobacillus casei group strains isolated from infant feces[J]. Journal of Functional Foods, 2019, 54:489-497.

DOI

[33]
YAGHCHI S S, FATEMI M, GHANDEHARI F. Comparing the effects of Saccharomyces boulardii and Selenium-enriched S. boulardii on hematological parameters and total antioxidant capacity in aluminum induced toxicity in rats[J]. Journal of Kermanshah University of Medical Sciences, 2018, 22(3):e80282.

[34]
DAI Y L, QUAN J J, XIONG L L, et al. Probiotics improve renal function,glucose,lipids,inflammation and oxidative stress in diabetic kidney disease:a systematic review and Meta-analysis[J]. Renal Failure, 2022, 44(1):862-880.

DOI

[35]
MISHRA V, SHAH C, MOKASHE N, et al. Probiotics as potential antioxidants:a systematic review[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 63(14):3615-3626.

DOI

Options
Outlines

/

〈 〉

京ICP备17050989号-2
Copyright © Chinese Journal of Animal Nutrition, All Rights Reserved.
Tel: 010－62817823　E-mail: cjan@vip.163.com
Powered by Beijing Magtech Co., Ltd.