Chinese Journal of Animal Nutrition >

2024 , Vol. 36 >Issue 1: 210 - 223

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.020

RESEARCH PAPER

Tolerance and Impact of Bug Defensin in Weaned Piglets’ Diet

  • AN Xiaokai , 1, 2 ,
  • LI Shuai 2 ,
  • HU Shenglan 2 ,
  • WANG Li 2 ,
  • YANG Xuefen 2 ,
  • WANG Wence 1 ,
  • XIAO Hao , 2, *
Expand
  • 1 College of Animal Science,South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
  • 2 Guangdong Key Laboratory of Animal Breeding and Nutrition, Guangdong Laboratory for Lingnan Modern Agriculture, Maoming Branch, State Key Laboratory of Livestock and Poultry Breeding, Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science in South China of Ministry of Agriculture, Institute of Animal Science, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640,China
* associate professor, E-mail:

Received date: 2023-07-21

  Online published: 2024-01-12

Fold

Abstract

In this experiment, we determined the appropriate additive amount of bug defensin (THA) in the diet of weaned piglets by testing the growth performance, organ indexes, serum biochemical indexes, antioxidant ability, body immunity and intestinal health of weaned piglets. A total of 108 piglets weaned at 21 days of age with the average intial body weight of (6.05±0.03) kg were used in a completely randomized grouping trial design, and randomly divided into 3 groups according to body weight, with 6 replicates of 6 pigs in each group and half of the male and half of the female. The control group (CON) was fed a corn-soybean meal basal diet and the experimental groups were fed the basal diet with 400 and 4 000 mg/kg THA for 28 days. The pigs were weighed every two weeks during the trial period, clinical signs were observed, and feed intake was recorded for each replicate. At the end of the trial, the pigs in each replicate that were closest to the average weight of that replicate were selected for slaughter sampling. The results showed as follows: 1) the addition of 400 mg/kg THA to the diet significantly increased the average daily feed intake (P<0.05) and significantly reduced the diarrhea rate (P<0.05) compared with the control group; the addition of 4 000 mg/kg THA had no significant effect on the growth performance of piglets (P>0.05). 2) Dietary THA supplementation at 400 and 4 000 mg/kg had no significant effect on the heart, liver, spleen, lung, and kidney indexes of weaned piglets compared with the control group (P>0.05). 3) Compared with the control group, 400 and 4 000 mg/kg THA had no significant effect on blood routine indexes (P>0.05).4) Compared with the control group, when the THA content in the diet was 400 mg/kg, it significantly decreased the serum albumin content (P<0.05); dietary addition of 4 000 mg/kg THA could significantly reduce the content of serum creatinine (P<0.05). 5) Compared with the control group, dietary supplementation of 400 and 4 000 mg/kg THA had no significant effect on serum antioxidant indexes of piglets (P>0.05). 6) Compared with the control group, dietary supplementation of 4 000 mg/kg THA significantly increased the content of serum interleukin-8 (IL-8) (P<0.05). 7) Compared with the control group, dietary supplementation of 400 and 4 000 mg/kg THA had no significant effect on the relative expression of tight junction protein genes in the jejunal mucosa of piglets (P>0.05). 8) Compared with the control group, 400 mg/kg THA significantly increased the activity of amylase in the ileum of piglets (P<0.05). 9) Compared with the control group, dietary supplementation of 400 mg/kg THA significantly increased the activity of amylase in the ileum of piglets (P<0.05). Compared with the control group, dietary supplementation of 400 mg/kg THA significantly increased jejunal villus height (P<0.05). The addition of 4 000 mg/kg THA to the diet had no adverse effect on the intestinal morphology of weanled piglets, and at the same time there was no damage to kidney and liver. THA supplementation can improve the immunity, intestinal morphology, and small intestinal digestion ability of weaned piglets. In conclusion, dietary supplementation of 400 mg/kg THA can reduce diarrhea and improve intestinal health in weaned piglets, while dietary supplementation of 4 000 mg/kg THA is safe for weaned piglets.

Key words： peptides; bug defensin; weaned piglet; tolerance

Cite this article

AN Xiaokai , LI Shuai , HU Shenglan , WANG Li , YANG Xuefen , WANG Wence , XIAO Hao . Tolerance and Impact of Bug Defensin in Weaned Piglets’ Diet[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2024 , 36(1) : 210 -223 . DOI: 10.12418/CJAN2024.020

早期断奶会引发仔猪应激综合征,断奶后会出现食欲减退、消化功能紊乱、生长迟滞、肠道病毒菌感染、腹泻甚至死亡等一系列的应激症状,给生猪养殖造成巨大的经济损失[1]。抗生素主要用于预防仔猪疾病和促进其生长发育,随着我国2020年7月1日开始对饲料端“禁抗”及养殖端“减抗”等相应政策的实施,寻求能够替代抗生素的物质成为研究重点。国内研究较多的抗生素替代品主要包括益生菌制剂、酸化剂、抗菌肽植物提取物等。
蝽防御素(THA)是20纪90年代在昆虫斑腹刺益蝽(Podisus maculiventris)体内发现的一种抗菌肽。THA的抗菌谱较广,不仅对革兰氏阴性菌(如大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌等)、革兰氏阳性菌(藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌等)有抑制杀灭活性,而且对某些真菌(如白色念珠菌等)也有一定的抑制作用,是抗生素的潜在替代品[2-3]。THA抑菌的最小肽段由C端环和相邻残基组成,C末端蛋氨酸(Met)残基的酰胺化对其抗菌活性是必要的。通过对其截短体以及THA的抗菌活性研究发现,THA可能通过多种机制对微生物产生影响,其作用方式可能是引起细菌凝集,破环细胞膜正常结构和阻断细胞膜上的呼吸链,从而造成细菌生长抑制甚至死亡。THA在浓度低于40 μmol/L时对猪的红细胞无溶血性,以ICR小鼠为模型进行的亚急性毒性试验,证明其半数致死剂量(LD50)为≤450 mg/kg BW。THA对热稳定,pH在2~8活性稳定,对胃蛋白酶不敏感,对胰蛋白酶不稳定[4]。因此,本研究以21日龄断奶仔猪为试验动物,研究在实际生产条件下,饲粮中添加THA对断奶仔猪的生长性能、血液相关指标、抗氧化能力和免疫功能的影响,同时监测高剂量添加对断奶仔猪血液指标及组织病理学等指标的影响,以确定THA在断奶仔猪饲粮中的耐受情况,为下一步试验和其在生产中合理应用提供依据和指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

THA有效成分抗菌肽实测值为1.02%,其他成分主要是载体淀粉(对照组饲粮中添加相同量的淀粉)。

1.2 试验设计

选取平均初始体重为(6.05±0.03) kg的21日龄杜×长×大断奶仔猪108头,采用完全随机分组试验设计,根据体重随机分为3组,每组6个重复,每个重复6头猪,公母各占1/2。对照组饲喂玉米-豆粕型基础饲粮,试验组饲喂在基础饲粮中分别添加400、4 000 mg/kg THA的试验饲粮,试验期28 d。

1.3 试验饲粮

基础饲粮参照NRC(2012)营养需要标准配制,其组成及营养水平见表1。试验饲粮配制成颗粒料后进行饲喂。待配料结束后,每一批饲粮按照四分法取200 g样品,装入样品袋,4 ℃冷藏用于测定饲粮各养分含量。饲粮的消化能采用ISO 9831:1998方法,使用氧弹式热量计(6400,Parr Instrument公司,美国)测定,饲粮中的粗蛋白质及钙、磷含量分别采用GB/T 6432—2018、GB/T 6436—2018和GB/T 6437—2018的方法进行测定。
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)%

项目Items 含量Content
原料Ingredients
玉米Corn 39.91
膨化玉米Puffed corn 16.00
发酵豆粕Fermented soybean meal 7.00
豆粕Soybean meal 6.00
膨化大豆Extruded soybean 10.00
鱼粉Fish meal 3.00
乳清粉Whey powder 7.50
乳清浓缩蛋白Whey protein concentrate 1.00
大豆油Soybean oil 1.40
蔗糖Cane sugar 2.00
氯化胆碱Choline chloride 0.12
食盐NaCl 0.35
磷酸氢钙CaHPO4 0.80
赖氨酸盐酸盐Lysine-HCl 0.68
DL-蛋氨酸DL-methionine 0.29
L-苏氨酸L-threonine 0.30
L-色氨酸L-tryptophan 0.05
柠檬酸钙Calcium citrate 1.60
预混料Premix1) 2.00
合计Total 100.00
营养水平Nutrient levels2)
消化能DE/(MJ/kg) 14.88
粗蛋白质Crude protein 18.26
赖氨酸Lysine 1.53
蛋氨酸Methionine 0.61
蛋氨酸+半胱氨酸Methionine+cysteine 0.90
苏氨酸Threonine 0.96
色氨酸Tryptophan 0.25
钙Ca 0.76
总磷Total phosphorus 0.54
标准全肠道可消化磷STTD P 0.36

1)预混料为每千克饲粮提供The premix provided the following per kg of the diet: VA 12 400 IU,VD3 2 800 IU,VE 30 mg,VK3 5 mg,VB12 40 g,VB1 3 mg,VB2 10 mg,烟酸 nicotinic acid 40 mg,D-泛酸 D-pantothenic 15 mg,叶酸 folic acid 1 mg,VB6 8 mg,生物素 biotin 0.08 mg,Fe 160 mg,Cu 40 mg,Mn 8 mg,Zn 100 mg,I 0.8 mg,Se 0.3 mg,Co 0.6 mg。

2)粗蛋白质、钙、总磷为实测值,其余均为计算值。CP, Ca and TP were measured values, while the others were calculated values.

1.4 饲养管理

试验猪舍内安装红外保温灯,将猪舍内环境温度维持在26~28 ℃。每个重复6头猪在同一个圈内,共用1个乳头饮水器及料槽。试验猪每天饲喂3次(08:00、14:00、17:00),添料量以料槽内有少量剩料为准,每天准确记录每个重复的饲粮添加量、剩余量、损耗量及料槽内清理的霉变料量。试验开始及整个试验期间每2周进行1次体重称量。试验前,清洗料槽和水槽,对猪舍进行彻底消毒,对试验猪进行常规免疫与驱虫。所有试验猪均自由饮水和采食。观察试验猪临床状况,记录腹泻及死亡情况。

1.5 样品采集

于试验第28天挑选接近该重复平均体重的猪只进行前腔静脉采血,采集10 mL血液于非抗凝管,室温静置1 h后,4 ℃、3 000×g离心10 min,分离出血清,1.5 mL离心管分装后液氮速冻,保存于-80 ℃用于后续分析。于试验第28天,在每个重复选取1头最接近该重复平均体重的仔猪进行采血屠宰。屠宰猪注射戊巴比妥那麻醉后放血,处死后迅速打开腹腔,迅速剥离内脏,无菌结扎胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠,置于冰盒内备用。取近端十二指肠、中段空肠、远端回肠肠段约1.5 cm组织样品,直接置于4%多聚甲醛,室温固定过夜,用于制作肠道组织苏木精-伊红(HE)染色切片。取近端十二指肠、中段空肠、远端回肠肠段纵向剪开,用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗内容物后,玻片轻轻刮取肠内壁黏膜样品分装于1.5 mL离心管中,液氮速冻,-80 ℃冷冻,用于后续测定。

1.6 指标测定

1.6.1 生长性能

分别于试验开始和结束时称重,计算平均日增重。试验过程中准确记录每个重复的采食量,记录猪只的腹泻情况,以计算平均日采食量、料重比及腹泻率。腹泻率:每天早、晚2次观察仔猪粪便情况,记录每个重复腹泻仔猪头数。腹泻率计算公式如下:

腹泻率(%)=[总腹泻头数/(仔猪头数×试验天数)]×100。

1.6.2 脏器指数

在对断奶仔猪进行解剖时,用手术刀将心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏这5个脏器剖离出来。擦拭干净脏器表面残留的血液之后进行称重,称量3次后取平均值进行统计并做好记录。

脏器指数(%)=100×脏器重量/仔猪体重。

1.6.3 肠道形态

取肠道样本使用苏木精-伊红染色检测空肠和回肠形态。在脱水、包埋、切片和染色后,用计算机辅助显微镜(尼康ECLIPSE E200,日本)测量绒毛高度、隐窝深度,计算绒隐比(绒毛高度/隐窝深度)。

1.6.4 血常规指标

在禁食后的12 h,取仔猪前腔静脉的血液1~2 mL装入含有乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管中。按照1∶1的比例混合血液和生理盐水,吸取1 mL混合液装入2 mL的EP管内,上机(全自动动物血液细胞分析仪,BC-5000)检测。检测指标如下:白细胞数量(WBC)、红细胞数量(RBC)、中性粒细胞数量(Neu)、淋巴细胞数量(Lym)、单核细胞数量(Mon)、嗜酸性粒细胞数量(Eos)、嗜碱性粒细胞数量(BAS)、中性粒细胞百分比(Neu%)、淋巴细胞百分比(Lym%)、单核细胞百分比(Mon%)、嗜酸性粒细胞百分比(Eos%)、嗜碱性粒细胞百分比(BAS%)、血红蛋白浓度(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞分布宽度变异系数(RDW-CV)、红细胞分布宽度标准差(RDW-SD)、血小板数量(PLT)、平均血小板体积(MPV)、血小板体积分布宽度(PDW)和血小板百分比(PLT%)。

1.6.5 血清生化指标

取500 μL断奶仔猪的血清,使用中生北控生物科技股份有限公司的试剂盒,根据试剂盒说明书在生化分析仪上进行检测。检测指标如下:白蛋白(ALB)、尿素(UREA)、葡萄糖(GLU)、总胆红素(TBIL)和肌酐(CRE)含量及谷丙转氨酶(ALP)、谷草转氨酶(AST)活性。

1.6.6 血清及空肠黏膜的免疫指标

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(江苏酶免实业有限公司)检测血清和空肠黏膜中分泌型免疫球蛋白A(SIgA)和免疫球蛋白M(IgM)含量。

1.6.7 血清及空肠黏膜的细胞因子含量

根据ELISA试剂盒的检测方法测定血清和空肠黏膜中细胞因子含量。检测指标如下:白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量。

1.6.8 血清抗氧化指标

采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定仔猪血清中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量和总抗氧化能力(T-AOC)。

1.6.9 肠道消化酶活性

采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测仔猪空肠及回肠中脂肪酶、胰蛋白酶、淀粉酶活性。

1.6.10 实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测

采用RNAiso Plus试剂盒提取肠黏膜组织总RNA,测定RNA浓度时吸光度(OD)260/OD280比值范围在1.8~2.2,表示RNA纯度较高。参考TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent Kit说明书完成cDNA制备,-80 ℃保存,用于后续基因表达的检测。根据TaKaRa相应试剂盒说明配制反应体系,以反转录的cDNA为模板扩增基因,进行RT-PCR,反应程序为:95 ℃ 30 s→95 ℃ 5 s→54 ℃ 10 s→72 ℃ 30 s(39个循环);熔解曲线95 ℃ 10 s→60 ℃ 5 s→95 ℃ 5 s。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参,测定闭锁蛋白(Occludin)、封闭蛋白-1(Claudin-1)、连接黏附分子(JAM-A)和闭锁小带蛋白-1(ZO-1)基因相对表达量。目的基因相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。引物序列见表2。
表2 实时荧光定量PCR引物序列

Table 2 Primer sequences for RT-PCR

基因
Genes		 GenBank登录号
GenBank accession number		 引物序列
Primer sequences (5'—3')
闭锁蛋白Occludin NM_001163647 F:TCAGGTGCACCCTCCAGATT
R:ATGTCGTTGCTGGGTGCATA
闭锁小带蛋白-1 ZO-1 XM_003480423.3 F:CCGAGAAGTTACGTGCTGAAG
R:CACGCTACGGCCCAGATAAA
连接黏附分子JAM-A NC_000067.7 F: GTGCCTTCAGCAACTCTTCC
R: GGTGTCCCATACCCATTCC
封闭蛋白-1 Claudin-1 AJ318102.1 F: ACGGCCCAGGCCATCTAC
R: TGCCGGGTCCGGTAGATG
甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH NM_001206359 F:CTGAGACACGATGGTGAAGGT
R:CACCCCATTTGATGTTGGCG

1.7 统计分析

试验数据采用Excel 2007整理后,用SPSS 23.0软件进行统计分析,数据均以平均值±均值标准误表示。评估组间差异前,采用Shapiro-Wilk检验数据的正态性。当变量数据呈非正态分布时,采用Kruskal-Wallis one-way ANOVA分析并用FDR进行多重比较,当数据呈正态分布时,采用one-way ANOVA分析并用LSD法进行多重比较。P<0.05为差异显著, 0.05<P<0.10为有差异显著的趋势。

2 结果与分析

2.1 THA对断奶仔猪生长性能的影响

如表3所示,与对照组相比,饲粮中添加400 mg/kg THA能显著提高平均日采食量(P<0.05),并显著降低腹泻率(P<0.05);其他指标各组间均无显著差异(P>0.05)。
表3 THA对断奶仔猪生长性能的影响

Table 3 Effects of THA on growth performance of weaned piglets

项目
Items		 蝽防御素添加水平THA additive levels/(mg/kg) SEM P值
P-value
0(对照Control) 400 4 000
初始体重IBW/kg 6.04 6.05 6.05 0.05 1.00
终末体重FBW/kg 13.02 14.03 13.31 0.21 0.14
平均日增重Average daily gain/g 249.95 284.75 258.53 7.24 0.12
平均日采食量Average daily feed intake/g 288.61b 341.40a 290.86b 9.84 0.03
料重比F/G 1.16 1.20 1.12 0.02 0.19
腹泻率Diarrhea rate/% 15.28a 10.62b 16.87a 0.75 <0.01

同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 THA对断奶仔猪脏器指数的影响

如表4所示,饲粮中添加THA对断奶仔猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏指数均无显著影响(P>0.05)。
表4 THA对断奶仔猪脏器指数的影响

Table 4 Effects of THA on organ indexes of weaned piglets%

项目
Items		 蝽防御素添加水平THA additive levels/(mg/kg) SEM P值
P-value
0(对照Control) 400 4 000
心脏Heart 0.54 0.56 0.56 0.01 0.73
肝脏Liver 3.49 3.63 3.60 0.10 0.85
脾脏Spleen 0.22 0.21 0.20 0.02 0.87
肺脏Lung 1.31 1.36 1.33 0.04 0.86
肾脏Kidney 0.52 0.55 0.51 0.01 0.55

2.3 THA对仔猪血常规指标的影响

如表5所示,与对照组相比,饲粮中添加400 mg/kg THA会使仔猪血液Mon%有升高的趋势(0.05<P<0.10);饲粮中添加THA对WBC、Neu、Lym、Mon、Eos、Bas、Neu%、Lym%、Eos%、Bas%、RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、RDW-CV、fL、PLT、MPV、PDW、PCT均无显著影响(P>0.05)。
表5 THA对断奶仔猪血常规指标的影响

Table 5 Effects of THA on blood routine indicators of weaned piglets

项目
Items		 蝽防御素添加水平THA additive levels/(mg/kg) SEM P值
P-value
0(对照Control) 400 4 000
白细胞数量WBC/(×109/L) 21.70 20.35 19.27 1.05 0.66
中性粒细胞数量Neu/(×109/L) 6.83 5.67 5.57 0.38 0.35
淋巴细胞数量Lym/(×109/L) 13.66 13.25 12.76 0.86 0.92
单核细胞数量Mon/(×109/L) 0.97 1.20 0.76 0.09 0.18
嗜酸粒细胞数量Eos/(×109/L) 0.22 0.19 0.15 0.03 0.54
嗜碱性细胞数量Bas/(×109/L) 0.02 0.04 0.03 0.01 0.29
中性粒细胞百分比Neu%/% 32.22 28.35 29.75 1.77 0.69
淋巴细胞百分比Lym%/% 62.32 64.72 65.40 1.73 0.77
单核细胞百分比Mon%/% 4.35 5.78 3.95 0.34 0.06
嗜酸粒细胞百分比Eos%/% 0.98 0.95 0.77 0.10 0.67
嗜碱性细胞百分比Bas%/% 0.13 0.20 0.13 0.02 0.37
红细胞数量RBC/(×1012/L) 5.06 5.18 4.95 0.14 0.82
血红蛋白浓度HGB/(g/L) 95.00 102.00 95.67 2.07 0.33
红细胞积压HCT/% 15.35 21.30 15.48 1.71 0.29
平均红细胞体积MCV/fL 121.73 126.20 125.40 1.33 0.36
平均红细胞血红蛋白含量MCH/pg 37.70 39.43 38.73 0.49 0.37
平均红细胞血红蛋白浓度MCHC/(g/L) 619.67 624.67 618.33 5.04 0.88
红细胞分布宽度RDW-CV/% 22.17 21.88 21.78 0.40 0.93
红细胞分布宽度标准差RDW-SD/fL 113.37 116.00 114.63 1.89 0.87
血小板数量PLT/(×109/L) 337.67 338.33 391.33 25.09 0.63
平均血小板体积MPV/fL 19.77 19.43 19.53 0.28 0.90
血小板分布宽度PDW/% 15.17 15.30 15.43 0.08 0.40
血小板积压PCT/% 0.17 0.16 0.19 0.01 0.63

2.4 THA对断奶仔猪血清生化指标的影响

如表6所示,与对照组相比,当饲粮中的THA添加量为400 mg/kg时,显著降低血清中ALB的含量(P<0.05);当饲粮中的THA添加量为4 000 mg/kg时,显著降低了血清中CRE的含量(P<0.05),且ALT的活性有升高的趋势(0.05<P<0.10)。与对照组相比,添加4 000 mg/kg THA对血清ALB含量无显著影响(P>0.05),且AST/ALT无显著差异(P>0.05),对UREA、GLU、TBIL含量均无显著影响(P>0.05)。
表6 THA对断奶仔猪血清生化指标的影响

Table 6 Effects of THA on serum biochemical indexes of weaned piglets

项目
Items		 蝽防御素添加水平THA additive levels/(mg/kg) SEM P值
P-value
0(对照Control) 400 4 000
肌酐CRE/(U/L) 101.69a 95.13a 49.90b 5.95 <0.01
谷丙转氨酶ALT/(U/L) 73.27 75.00 97.70 5.07 0.08
谷草转氨酶AST/(U/L) 80.76 94.21 71.43 5.57 0.26
谷草转氨酶/谷丙转氨酶AST/ALT 1.12 1.39 0.83 0.11 0.11
白蛋白ALB/(g/L) 20.83a 18.21b 21.44a 0.51 0.01
尿素UREA/(mmol/L) 6.47 7.67 5.99 0.38 0.18
葡萄糖GLU/(mmol/L) 2.65 3.62 2.54 0.28 0.23
总胆红素TBIL/(μmol/L) 4.02 3.75 4.28 0.34 0.83

2.5 THA对仔猪血清抗氧化指标的影响

如表7所示,饲粮中添加THA对仔猪血清中CAT、GSH-Px、T-SOD活性,MDA含量及T-AOC均无显著影响(P>0.05)。
表7 THA对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响

Table 7 Effects of THA on serum antioxidant indexes of weaned piglets

项目
Items		 蝽防御素添加水平THA additive levels/(mg/kg) SEM P值
P-value
0(对照Control) 400 4 000
过氧化氢酶CAT/(U/mL) 142.69 129.14 143.81 3.81 0.22
总超氧化物歧化酶T-SOD/(U/mL) 3.61 3.71 3.72 0.08 0.86
总抗氧化能力T-AOC/(μmol/mL) 0.56 0.56 0.57 0.01 0.59
谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px/(U/mL) 156.19 164.68 165.02 4.49 0.69
丙二醛MDA/(nmol/mL) 2.64 3.00 2.72 0.18 0.72

2.6 THA对断奶仔猪血清和空肠免疫指标和炎症因子含量的影响

如表8所示,与对照组相比,饲粮中添加4 000 mg/kg THA会显著提高血清中IL-8的含量(P<0.05),添加400与4 000 mg/kg THA,仔猪血清中的IFN-γ含量有降低的趋势(0.05<P<0.10)。饲粮中添加THA对断奶仔猪血清中炎症因子IL-6、IL-10、IL-1β、IgM、SIgA、TNF-α、IFN-γ含量均未产生显著影响(P>0.05)。
表8 THA对断奶仔猪血清免疫指标和炎症因子含量的影响

Table 8 Effects of THA on serum immune indexes and inflammatory factor contents of weaned piglets

项目
Items		 蝽防御素添加水平THA additive levels/(mg/kg) SEM P值
P-value
0(对照Control) 400 4 000
白细胞介素-6 IL-6/(ng/L) 250.43 249.69 260.61 4.04 0.50
白细胞介素-8 IL-8/(ng/L) 404.40b 427.23b 485.23a 11.15 <0.01
白细胞介素-10 IL-10/(pg/mL) 6.06 6.07 6.07 0.00 0.41
白细胞介素-1β IL-1β/(pg/mL) 20.81 19.17 15.84 1.25 0.27
免疫球蛋白M IgM/(pg/mL) 5.66 5.27 4.74 0.26 0.38
分泌型免疫球蛋白A SIgA/(μg/mL) 6.14 5.97 5.94 0.06 0.32
肿瘤坏死因子-α TNF-α/(ng/mL) 1.05 1.04 1.08 0.02 0.71
干扰素-γ IFN-γ/(ng/mL) 2.39 2.07 2.05 0.07 0.07
如表9所示,与对照组相比,饲粮中添加400 mg/kg THA时,仔猪空肠黏膜中的IL-1β含量有升高的趋势(0.05<P<0.10)。饲粮中添加THA对断奶仔猪空肠黏膜中炎症因子IL-6、IL-10、IgM、SIgA、TNF-α、IFN-γ含量均未产生显著影响(P>0.05)。
表9 THA对断奶仔猪空肠黏膜免疫指标和炎症因子含量的影响

Table 9 Effects of THA on immune indexes and inflammatory factor contents in jejunal mucosa of weaned piglets

项目
Items		 蝽防御素添加水平THA additive levels/(mg/kg) SEM P值
P-value
0(对照Control) 400 4 000
白细胞介素-6 IL-6/(ng/mg prot) 3.92 4.40 3.08 0.33 0.26
白细胞介素-8 IL-8/(pg/mg prot) 30.31 29.35 17.24 2.79 0.10
白细胞介素-10 IL-10/(pg/mg prot) 4.06 4.56 3.77 0.35 0.67
白细胞介素-1β IL-1β/(pg/mg prot) 1.94 2.46 1.61 0.16 0.09
肿瘤坏死因子-α TNF-α/(pg/mg prot) 13.56 17.84 12.85 1.25 0.22
分泌型免疫球蛋白A SIgA/(μg/mg prot) 1.33 1.71 1.29 0.11 0.25
干扰素-γ IFN-γ/(pg/mg prot) 63.37 77.09 66.75 5.47 0.59
免疫球蛋白M IgM/(μg/mg prot) 0.99 1.11 0.88 0.07 0.42

2.7 THA对断奶仔猪空肠黏膜紧密连接蛋白表达的影响

如表10所示,饲粮中添加THA对仔猪空肠黏膜中紧密连接蛋白ZO-1、JAM-A、Occludin、Claudin-1的基因相对表达量均无显著影响(P>0.05)。
表10 THA对断奶仔猪空肠黏膜紧密连接蛋白表达的影响

Table 10 Effects of THA on expression of tight junction protein in jejunal mucosa of weaned piglets

项目
Items		 蝽防御素添加水平THA additive levels/(mg/kg) SEM P值
P-value
0(对照Control) 400 4 000
闭锁小带蛋白-1 ZO-1 1.00 1.10 0.89 0.11 0.80
连接黏附分子JAM-A 1.00 0.75 0.90 0.12 0.70
闭锁蛋白Occludin 1.00 0.83 1.07 0.13 0.79
封闭蛋白-1 Claudin-1 1.00 1.40 1.19 0.21 0.73

2.8 THA对仔猪肠道消化酶活性的影响

如表11所示,与对照组相比,饲粮中添加400 mg/kg THA会显著提高仔猪回肠中淀粉酶活性(P<0.05);饲粮中添加THA对仔猪空肠中脂肪酶、胰蛋白酶、淀粉酶活性未产生显著影响(P>0.05),对回肠中的脂肪酶、胰蛋白酶活性也未产生显著影响(P>0.05)。
表11 THA对断奶仔猪肠道消化酶活性的影响

Table 11 Effects of THA on intestinal digestive enzyme activities of weaned piglets

项目
Items		 蝽防御素添加水平THA additive levels/(mg/kg) SEM P值
P-value
0(对照Control) 400 4 000
空肠Jejunum
脂肪酶Lipase/(U/mg prot) 28.32 28.62 49.92 5.76 0.21
胰蛋白酶Trypsase/(U/g prot) 5.22 3.19 6.34 0.76 0.22
淀粉酶Diastase/(U/g prot) 0.26 0.27 0.33 0.04 0.80
回肠Ileum
脂肪酶Lipase/(U/mg prot) 68.82 73.61 67.53 8.83 0.96
胰蛋白酶Trypsase/(U/g prot) 5.42 3.88 5.89 0.59 0.36
淀粉酶Diastase/(U/g prot) 0.24b 0.44a 0.17b 0.04 0.02

2.9 THA对断奶仔猪肠道形态的影响

由表12所示,与对照组相比,饲粮中添加THA水平为400 mg/kg时,仔猪空肠绒毛高度显著升高(P<0.05);与对照组相比,饲粮中添加THA水平为400 mg/kg时,回肠绒毛高度及绒隐比均升高,但差异不显著(P>0.05)。
表12 THA添加水平对断奶仔猪空肠、回肠肠道形态的影响

Table 12 Effects of THA on intestinal morphology of jejunum and ileum of weaned piglets

项目
Items		 蝽防御素添加水平THA additive levels/(mg/kg) SEM P值
P-value
0(对照Control) 400 4 000
空肠Jejunum
绒毛高度Villus height/μm 474.42b 543.10a 474.07b 7.31 <0.01
隐窝深度Crypt depth/μm 278.00 283.50 299.47 6.81 0.45
绒隐比Villus height/crypt depth 1.78 1.94 1.66 0.05 0.11
回肠Ileum
绒毛高度Villus height/μm 472.60ab 501.93a 440.67b 7.82 <0.01
隐窝深度Crypt depth/μm 260.47 258.47 295.47 7.79 0.09
绒隐比Villus height/crypt depth 1.84ab 2.00a 1.57b 0.06 0.02

3 讨论

3.1 THA对断奶仔猪生长性能及腹泻率的影响

断奶应激使仔猪易产生腹泻,降低生长性能甚至死亡。断奶应激导致肠道通透性升高,大量微生物和有毒有害物质入侵肠道黏膜,导致肠道黏膜免疫监视和防御功能障碍,引发肠道炎症反应[5⇓-7]。研究表明,抗菌肽Cathelicidin可通过免疫调控作用缓解肠道炎症[8]。Wu等[9]研究表明,断奶仔猪饲粮中添加400 mg/kg天汀素AD可缓解大肠杆菌K88感染导致的腹泻和生长性能下降。Yoon等[10]研究发现,饲粮中添加90 mg/kg抗菌肽A3可促进断奶仔猪生长性能。断奶仔猪的饲粮中添加5 g/kg抗菌肽重组猪β-防御素2(rpBD2)可提高仔猪的体重、平均日增重、平均日采食量,同时降低仔猪断奶后腹泻的发生率[11]。饲粮添加1.5 g/kg的抗菌肽可提高断奶仔猪的采食量与平均日增重,且降低料重比[12]。断奶仔猪的饲粮中添加牛源抗菌肽B-13可显著提高平均日增重,降低料重比[13]。抗菌肽Cathelicidin-BF可有效改善断奶仔猪腹泻,提高仔猪免疫力,减轻肠道炎症反应,增强肠道屏障功能[14]。饲粮中添加肠杆菌肽可提高断奶仔猪的平均日增重,降低料重比。在仔猪饲粮添加抗菌肽可增加肠道益生菌数量,控制腹泻率,提高仔猪生长性能,提高成活率[15]。本试验结果表明,饲粮中添加400 mg/kg THA能改善仔猪生长性能,降低腹泻率,而4 000 mg/kg THA对仔猪生长性能无不利影响。

3.2 THA对断奶仔猪血清免疫指标的影响

机体免疫系统内存在免疫活性物质,如免疫球蛋白、细胞因子、补体等,当机体遭受应激时,机体内会产生抗炎因子、免疫球蛋白及补体对抗病原菌[16-17]。血清中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)和IgM等的含量是衡量机体体液免疫的重要指标。适量添加抗菌肽可通过调节血清及组织中免疫因子的分泌,改善肠屏障功能,对断奶仔猪免疫功能产生影响。在断奶仔猪基础饲粮中添加一定量的多肽抗生素,可提高其血清中IgA、IgG和IgM的含量[18]。研究发现,断奶会降低仔猪生长速度和采食量,并使T细胞亚群的分布发生改变,CD4+T淋巴细胞比例降低,CD4+/CD8+比值下降,循环抗体水平下降[19]。在28日龄断奶仔猪饲粮中添加维生素E可增高血清IgG含量。添加抗菌肽KR-32可降低断奶仔猪腹泻率和腹泻指数,同时降低断奶仔猪血清IL-6和TNF-α含量[20]。在断奶仔猪基础饲粮中添加500和1 000 mg/kg的抗菌肽,IgG、IgA、IgM、IL-2、IFN-γ含量均显著提高,添加量为1 000 mg/kg时效果最好[21]。在28日龄断奶仔猪的基础饲粮中添加200 mg/kg天蚕素抗菌肽和300 mg/kg PR39抗菌肽,可显著提高血清中IL-1β、IL-2的含量,且对断奶仔猪的小肠黏膜形态有改善作用,同时可减少病原微生物感染率,增强仔猪免疫力[22]。抗菌肽可促进动物机体血清中免疫球蛋白、补体及细胞因子的生成,从而改善机体体液免疫的功能。本试验研究结果显示,添加4 000 mg/kg THA增加了仔猪血清中免疫因子IL-8的含量,提高了断奶仔猪的免疫性能。

3.3 THA对断奶仔猪血清生化指标的影响

血清生化指标对猪的疾病诊断和生长性能有重要的参考价值[23]。血清中TP、ALB、UREA、ALT等是机体氮代谢途径的重要指标。其中血清UREA是蛋白质的代谢产物,其含量可反映动物体内氨基酸合成蛋白质效率的高低,当蛋白质合成和饲料转化效率增加时,UREA含量降低[24],血清中AST、ALT活性,尤其是AST/ALT值常作为判断肝脏功能的指标。正常生理状态下ALT活性较低,当组织细胞通透性增加或者受损时,血清中ALT活性随之增加[25]。代谢异常、炎症性肠病等会导致ALT活性慢性升高[26]。当肝细胞病变时,AST/ALT值显著升高。研究表明,断奶仔猪血清中AST/ALT值在1.66~2.07波动[27]。本研究中,添加4 000 mg/kg THA对AST/ALT值无显著影响且在正常范围内波动,并且肝脏器官指数在各组间没有显著差异,表明添加4 000 mg/kg THA没有损伤仔猪肝脏。血清CRE是哺乳动物肌肉肌酸代谢的最终副产物,经由肾小球过滤再排出体外。血清CRE含量随着肾脏功能损害程度增加而升高[28];另有研究发现,育肥猪限饲之后,血清CRE含量显著升高[29]。本研究中,添加4 000 mg/kg THA显著降低了断奶仔猪血清CRE含量,且没有改变肾脏指数,说明4 000 mg/kg THA没有造成仔猪肾脏损伤,与对照组相比,添加4 000 mg/kg THA对血清ALB含量无显著影响,且AST/ALT值正常,对UREA、GLU、TBIL含量均未产生显著影响。这表明断奶仔猪可以耐受饲粮中添加4 000 mg/kg THA且对肝脏和肾脏均无不利影响。

3.4 THA对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响

动物生命活动会产生大量氧自由基,体内自由基的累积会导致机体发生应激[30]。自由基过多则会使膜脂过氧化,损坏正常功能。T-SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶在清除自由基和减缓氧化应激中有重要影响,是机体抗氧化能力的关键指标。抗菌肽能提高断奶仔猪的抗氧化活性。在断奶仔猪的基础饲粮中加入抗菌肽,可提高仔猪血清中的T-SOD、GSH-Px的活性和T-AOC,降低MDA含量[31]。饲粮中添加复合抗菌肽(猪防御素和苍蝇抗菌肽)可提高仔猪组织中的T-SOD、GSH-Px的活性、T-AOC以及羟基自由基的抑制能力,降低MDA含量[32]。抗菌肽可提高断奶仔猪的抗氧化能力,减少活性氧自由基及其产物的生成,降低仔猪受到的氧化伤害,保护仔猪健康。在本试验中,添加400和4 000 mg/kg THA对仔猪的抗氧化能力均无显著影响。

3.5 THA对断奶仔猪肠道健康的影响

在消化系统中,小肠是各种营养物质吸收的主要器官,绒毛高度的增加及隐窝深度的降低均可使绒毛与营养物质接触的表面积增加,促进营养物质的吸收利用。在肠道中,微生物和饲粮的刺激会使肠道自由基增多,造成肠细胞膜的破坏,导致肠绒毛损伤,增加隐窝深度,增加分泌细胞,减少吸收细胞,降低营养吸收能力[33-34]。研究表明,抗菌肽可改善肠道微生物菌群的作用,降低猪肠道中大肠杆菌、沙门氏菌等有害细菌的数量,增加猪肠道中双歧杆菌、乳酸杆菌等有益菌的数量[35]。肠道菌群可通过发酵产生短链脂肪酸,然后激活淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等,从而提高蛋白质和能量的利用率[36]。本试验结果表明,饲粮中添加400 mg/kg THA可提高断奶仔猪回肠淀粉酶的活性,在一定程度上促进肠道对营养物质的吸收。
在饲粮中添加400 mg/kg THA时,仔猪回肠绒隐比较对照组有一定提高;相比与对照组,添加4 000 mg/kg THA增加了空肠隐窝深度,说明添加4 000 mg/kg THA可促进断奶仔猪肠道发育。饲粮中添加4 000 mg/kg THA时,对仔猪空肠黏膜炎症因子含量均无显著影响,表明4 000 mg/kg THA是可耐受剂量且对断奶仔猪肠道健康无不利影响。

3.6 THA对断奶仔猪肠道屏障功能的影响

断奶仔猪肠道屏障功能损伤会导致肠道炎症及腹泻。肠道屏障由上皮屏障、免疫屏障、化学屏障及生物屏障组成。其中肠道上皮屏障作为抵抗病原体入侵的第1道屏障,可保护机体免受病原菌等微生物侵袭,而紧密连接结构在肠道上皮屏障中发挥重要作用[37-38]。研究表明,断奶应激导致仔猪肠道紧密连接蛋白表达下降,肠道上皮跨膜电阻值(TER)下降,肠道通透性升高,破坏肠道物理屏障[5]。ZO-1、Occludin及Claudin-1是紧密连接结构中重要的蛋白[39]。研究发现,LL-37也可促进Claudins和Occludin的表达,提高TER,增强肠道屏障功能[40]。利用DSS诱导的结肠炎小鼠模型,结果发现抗菌肽pBD2能提高肠道紧密连接蛋白ZO-1、Occludin及Claudin-1的基因表达[39]。然而在本试验中,THA并未影响空肠黏膜ZO-1、JAM-A、Occludin、Claudin-1的表达,其可能原因是不同种类的抗菌肽对紧密连接蛋白的调控作用存在差异。

4 结论

本试验结果表明,饲粮中添加4 000 mg/kg THA不影响断奶仔猪生长性能,没有引起肠道、肾脏和肝脏的损伤,也没有导致断奶仔猪抗氧化能力和免疫功能的下降。综上所述,饲粮中添加4 000 mg/kg THA对断奶仔猪属于安全水平,但是其是否能够耐受更高剂量THA仍需进一步验证。

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