Chinese Journal of Animal Nutrition >

2024 , Vol. 36 >Issue 1: 224 - 234

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.021

RESEARCH PAPER

Effects of Dietary 5-Aminolevulinic Acid Supplementation on Growth Performance, Blood Routine Indices, Immune Function and Intestinal Morphology in Broilers

  • CHEN Jiang , 1 ,
  • LIU Jiao 2 ,
  • GU Hongxia 3 ,
  • LIU Jinmei 4 ,
  • LIU Guohua , 4, *
Expand
  • 1 Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China
  • 2 Shandong Xintai Animal Husbandry and Veterinary Development Service Center, Xintai 271200, China
  • 3 Ganzhou Agricultural College, Ganzhou 341000,China
  • 4 Key Laboratory of Feed Biotechnology of the Ministry of Agriculture, Institute of Feed Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
* professor, E-mail:

Received date: 2023-07-13

  Online published: 2024-01-12

Fold

Abstract

This study aimed to investigate the effects of dietary supplementation with 5-aminolevulinic acid (5-ALA) on growth performance, blood routine indices, immune function and intestinal morphology in broilers. A total of 300 one-day-old Arbor Acres broilers were distributed into 5 groups with 6 replicates of 10 broilers by a completely randomized design. The broilers in the 5 groups were fed the basal diet with 0 (control), 15, 30, 45, and 60 mg/kg 5-ALA, respectively. The results showed as follows: 1) dietary 5-ALA supplementation had no significant effects on average daily feed intake (ADFI) and average daily gain (ADG). Dietary supplementation with 60 mg/kg 5-ALA reduced the feed to gain ratio (F/G) during 1 to 21 days of age and 22 to 42 days of age (P<0.05). Moreover, with the dietary 5-ALA supplemental level increased, the F/G was linearly decreased (P<0.05). 2) Dietary supplementation with 30, 45 and 60 mg/kg 5-ALA increased the blood hemoglobin (HGB) content of broilers on 21 days of age. At the same time, with the increase of 5-ALA supplemental level, the HGB content and red blood cell counts (RBC) were linearly increased (P<0.05). 3) Dietary supplementation with 45 mg/kg 5-ALA increased the contents of immunoglobulin M (IgM) and immunoglobulin G (IgG) in serum of broilers on 21 days of age (P<0.05), and dietary supplementation with 30 or 45 mg/kg 5-ALA increased the contents of IgM, IgG and immunoglobulin A (IgA) in serum of broilers on 42 days of age (P<0.05). Moreover, dietary supplementation with 45 and 60 mg/kg 5-ALA improved the contents of complement 3 (C3), complement 4 (C4), and interferon-γ (INF-γ) in serum of broilers on 21 days of age. And the C3 and C4 contents in serum of broilers on 21 days of age were linearly increased (P<0.05). 4) Compared with the control group, the mRNA relative expression levels of Avian β-defensin (AvBD) 1, AvBD2, AvBD7 and Cathelicidin (CATH) 1, CATH2, CATH3 in liver were upregulated in 5-ALA supplementation group (P<0.05). 5) Dietary supplementation with 30 and 60 mg/kg 5-ALA increased the ileal villus height/crypt depth ratio (V/C) of broilers on 42 days of age. Moreover, with the dietary 5-ALA supplemental level increased, the villous height of duodenum was linearly increased (P<0.05). In conclusion, dietary supplementation with 5-ALA promotes the formation of hemoglobin, improves the growth performance, immune function and intestinal mucosal morphology of broilers, and the appropriate supplemental level is 45 to 60 mg/kg.

Key words： 5-aminolevulinic acid; broilers; growth performance; immune function; intestinal morphology

Cite this article

CHEN Jiang , LIU Jiao , GU Hongxia , LIU Jinmei , LIU Guohua . Effects of Dietary 5-Aminolevulinic Acid Supplementation on Growth Performance, Blood Routine Indices, Immune Function and Intestinal Morphology in Broilers[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2024 , 36(1) : 224 -234 . DOI: 10.12418/CJAN2024.021

5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)是一种非蛋白质氨基酸,由甘氨酸和琥珀酰辅酶A在线粒体中合成,参与动物机体内血红素的合成。血红素又是血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素和过氧化物酶等物质的辅基,因而5-ALA通过血红素参与众多生理功能的调节[1]。近年来,5-ALA作为一种新型畜禽饲料添加剂,因具有提高动物免疫力、抗炎和抗氧化方面的功能而受到众多的关注。Pedrosa-Gerasmio等[2]研究发现,饲粮添加5-ALA能提高受到溶血弧菌攻毒的南美白对虾的存活率,在差异表达的101个基因中,其中上调了41个与免疫和防御相关的基因,提高了南美白对虾对溶血弧菌的抵御能力。Hendawy等[3]研究表明,奶牛饲喂添加5-ALA的饲粮能使血液中白细胞和粒细胞数增加,而且饲喂5-ALA饲粮的奶牛外周血中单核细胞的吞噬率和有丝分裂原诱导的增殖率高于饲喂基础饲粮的奶牛,并认为5-ALA具有免疫调节作用。此外,还有研究发现,饲粮添加5-ALA有利于促进母猪和断奶仔猪血清免疫球蛋白的生成,及减少妊娠母猪肠道中有害菌群的定植[4-5]。虽然也有研究报道5-ALA可以降低脂多糖诱导的肉鸡脾脏中促炎症细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-2(IL-2)、诱导型一氧化氮合酶和干扰素-γ的mRNA表达水平[6],但是在正常生理状态下,从先天性免疫、细胞因子表达与肠黏膜形态的角度探究5-ALA对肉鸡的免疫调节作用的影响目前鲜见报道。因此,本试验旨在研究饲粮添加不同水平5-ALA对肉鸡生长性能、血常规指标、免疫功能和肠道形态的影响,为5-ALA作为一种新型饲料添加剂在家禽养殖中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

选取300只1日龄爱拔益加(AA)肉公鸡随机分成5组,每组6个重复,每个重复10只鸡。各组分别饲喂5-ALA添加水平为0(对照)、15、30、45和60 mg/kg的饲粮。基础饲粮参考《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)配制,其组成及营养水平见表1,分别采用GB/T 6432—2018、GB/T 6437—2018、GB/T 6433—2006和GB/T 6436—2018中方法,检测饲粮中粗蛋白质、总磷、粗脂肪和钙含量。试验期为42 d,分为生长前期(1~21日龄)和生长后期(22~42日龄)。
表1 基础饲粮组成及营养水平(饲喂基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (as-fed basis)%

项目
Items		 含量Content
1~21日龄1 to 21 days of age 22~42日龄22 to 42 days of age
原料Ingredients
玉米Corn 53.25 52.44
豆粕Soybean meal 28.74 18.28
棉籽粕Cottonseed meal 3.00 6.00
菜籽粕Rapeseed meal 2.00 4.00
干酒糟及其可溶物Distiller’s dried grains with solubles 5.00 10.00
植物油Vegetable oil 3.42 5.31
食盐NaCl 0.32 0.32
磷酸氢钙CaHPO4 1.60 0.91
石粉Limestone 1.48 1.62
L-赖氨酸盐酸盐L-Lys·HCl 0.40 0.42
DL-蛋氨酸DL-Met 0.33 0.27
L-苏氨酸L-Thr 0.01 0.03
氯化胆碱Choline chloride 0.20 0.15
预混料Premix1) 0.25 0.25
合计Total 100.00 100.00
营养水平Nutrient levels2)
代谢能ME/(MJ/kg) 12.56 12.98
粗蛋白质CP 20.76 19.13
总磷TP 0.67 0.55
粗脂肪EE 6.32 9.04
钙Ca 0.99 0.88

1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of diets:VA 8 000 IU,VD3 1 000 IU,VE 20 mg,VK3 0.5 mg,VB1 2 mg,VB2 8 mg,VB6 3.5 mg,VB12 0.01 mg,D-泛酸 D-pantothenic acid 10 mg,烟酸 niacin 35 mg,叶酸 folic acid 0.55 mg,生物素 biotin 0.18 mg,Cu(as copper sulfate)8 mg,Fe(as ferrous sulfate) 100 mg,Zn(as zinc sulfate) 80 mg,Mn(as manganese sulfate) 80 mg,I(as potassium iodide) 0.7 mg。

2)代谢能为计算值,其余均为实测值。ME was a calculated value, while the others were measured values.

1.2 检测指标

1.2.1 生长性能测定

肉鸡1日龄时以重复为单位记录肉鸡的初始体重。于21和42日龄时,鸡只禁食8 h后,称量每个重复的肉鸡体重(BW)。分别统计试验期间生长前期和后期各重复耗料量,计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)。

1.2.2 血常规指标测定

在肉鸡21和42日龄时,每个重复中挑选与平均体重接近的肉鸡1只,颈静脉取2 mL血样储存在抗凝管中,用TEK-Ⅱ微型全自动血细胞分析仪(TEK5000P,江西泰康科技有限公司)分析红细胞数(RBC)、血红蛋白(HGB)含量、白细胞数(WBC)、淋巴细胞数(LYM)、中间细胞数(MID)和粒细胞数(GRA)。

1.2.3 血清免疫指标测定

使用购自上海酶联生物科技有限公司的鸡特异性酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、补体3(C3)、补体4(C4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-4(IL-4)的含量。

1.2.4 肠道组织形态结构

42日龄时,每个重复屠宰1只肉公鸡,取十二指肠、空肠和回肠中间部位1.5 cm左右长的部分,用生理盐水冲洗干净后,置于4%多聚甲醛溶液中固定保存。将甲醛固定好的肠段制成5 μm切片,苏木精-伊红染色,400×显微镜观察。每个切片随机选取10个隐窝和绒毛完整、定向良好的视野,测量绒毛高度和隐窝深度,并计算绒毛高度和隐窝深度的比值。

1.2.5 肝脏β-防御素和Cathelicidins抗菌肽基因表达量

取来自同一侧肝脏组织(约5 g),用无菌生理盐水溶液清洗以去除血迹,并立即保存在液氮中,然后保存在-70 ℃用于后续分析。根据Trizol法流程提取21日龄肉鸡肝脏组织中总RNA。使用NanoDrop-2000分光光度计(赛默飞世尔科技公司,美国)检测吸光度(OD)260/280和RNA凝胶成像检测RNA样品的质量和浓度。使用反转录cDNA第一链合成试剂盒(天根生化科技有限公司),按照试剂盒推荐的程序将提取的RNA反转录成cDNA。通过NCBI的Primer Blast在线设计引物并检查它们的特异性。引物由生工生物技术有限公司合成。引物序列见表2。
表2 实时荧光定量PCR引物序列

Table 2 Sequence primers used for RT-PCR

基因
Genes		 引物序列
Primer sequence (5'—3')		 GenBank登录号
GenBank Accession No.		 扩增大小
Amplicon size/bp
鸡源Cathelicidins抗菌肽1 CATH1 F:GACAGCTGCGAGTTCAAGGA
R:CGCCCGGTAGAGGTTGTATC		 NM_001001605.3 183
鸡源Cathelicidins抗菌肽2 CATH2 F:ACTGATCCAGGCTGTGGACT
R:CAGTCCCTGATGACCCCATTC		 NM_001024830.2 210
鸡源Cathelicidins抗菌肽3 CATH3 F:GACAGCTGCGAGTTCAAGGA
R:TTGTAGAGGTTGATGCCCGC		 NM_001311177.1 188
禽β-防御素1 AvBD1 F:GGGACAGACGTAAACCATGC
R:CTGGCTCTTCAGCCCCATATT		 NM_204993.1 222
禽β-防御素4 AvBD4 F:CCAGAGCCTCCTCTTTGGTG
R:GGTCCCGCGATATCCACATT		 NM_001001610.2 205
禽β-防御素7 AvBD7 F:GATTTCACATCCCAGCCGTG
R:ATGGCCTTCGACAGATCCCT		 NM_001001194.1 162
β-肌动蛋白
β-actin		 F:GAGAAATTGTGCGTGACATCA
R: CCTGAACCTCTCATTGCCA		 NM_205518.1 152
使用SuperReal PreMix(Probe)试剂盒(天根生化科技有限公司)通过实时定量聚合酶链反应扩增cDNA样品。实时荧光定量PCR反应条件为:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃延伸5 min,40个循环。PCR产物的特异性通过熔解曲线进行评估。在本试验中,β-肌动蛋白(β-actin)被用作为内参基因,对照组作为校准表达量,目标基因的mRNA相对表达量使用2-ΔΔCt方法计算。

1.3 统计分析

试验数据通过SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),Turkey检验用于多重比较,P<0.05表示差异显著,0.05<P<0.10表示差异有显著的趋势,并采用回归分析模型中曲线估计程序,对5-ALA添加水平与各检测指标进行线性和二次曲线分析。

2 结果

2.1 饲粮中添加5-ALA对肉鸡生长性能的影响

由表3可见,与对照组相比,饲粮中添加60 mg/kg 5-ALA能显著降低1~21日龄和22~42日龄肉鸡的F/G(P<0.05);且随饲粮中5-ALA添加水平的增加,F/G呈线性降低趋势(P<0.05)。随饲粮中5-ALA添加水平的增加,42日龄肉鸡BW和ADG呈线性增加趋势(P<0.05),但饲粮中添加5-ALA对1~21日龄和22~42日龄肉鸡ADFI无显著影响(P>0.05)。
表3 饲粮中添加5-ALA对肉鸡生长性能的影响

Table 3 Effects of dietary 5-aminolevulinic acid supplementation on growth performance of broilers

项目
Items		 5-ALA添加水平
5-ALA supplemental levels/(mg/kg)		 SEM P值P-value
处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic
0(对照Control) 15 30 45 60
1~21日龄1 to 21 days of age
21日龄体重
BW of 21 days of age/g		 901 912 922 908 927 4.35 0.32 0.13 0.32
平均日增重ADG/(g/d) 40.95 41.43 41.94 41.27 42.19 0.21 0.32 0.13 0.31
平均日采食量ADFI/(g/d) 51.26 51.94 52.65 51.94 51.62 0.29 0.67 0.67 0.36
料重比F/G 1.27b 1.27b 1.26b 1.26b 1.22a 0.01 <0.01 0.01 0.34
22~42日龄22 to 42 days of age
42日龄体重
BW of 42 days of age/g		 2 698 2 741 2 799 2 766 2 832 16.54 0.08 0.01 0.37
平均日增重ADG/(g/d) 86.14 87.97 89.63 89.44 90.70 0.71 0.30 0.03 0.34
平均日采食量ADFI/(g/d) 149.30 150.05 152.72 150.29 150.08 0.84 0.79 0.77 0.32
料重比F/G 1.73b 1.71ab 1.71ab 1.70ab 1.65a 0.01 0.03 <0.01 0.95

同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 饲粮中添加5-ALA对肉鸡血常规指标的影响

由表4可知,21日龄时,与对照组相比,饲粮添加30、45和60 mg/kg的5-ALA能显著提高肉鸡血液中HGB含量(P<0.05);且随饲粮中5-ALA添加水平的增加,血液HGB含量和RBC呈线性升高趋势(P<0.05);42日龄时,随饲粮中5-ALA添加水平的增加,血液HGB含量和RBC呈线性升高趋势(P<0.05)。饲粮中添加5-ALA对21和42日龄肉鸡血液WBC、LYM、MID和GRA无显著影响(P>0.05)。
表4 饲粮中添加5-ALA对肉鸡血常规指标的影响

Table 4 Effects of dietary 5-aminolevulinic acid supplementation on blood routine indices of broilers

项目
Items		 5-ALA添加水平
5-ALA supplemental levels/(mg/kg)		 SEM P值P-value
处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic
0(对照Control) 15 30 45 60
21日龄21 days of age
血红蛋白含量
HGB content/(g/L)		 89.20a 94.60ab 103.80b 99.50b 104.00b 1.66 0.01 <0.01 0.09
红细胞数RBC/(×1012/L) 2.29 2.55 2.69 2.46 2.62 0.05 0.13 0.01 0.15
白细胞数WBC/(×109/L) 133.25 132.18 136.12 131.81 129.55 0.78 0.10 0.72 0.09
淋巴细胞数LYM/(×109/L) 56.07 57.61 55.40 58.68 58.40 0.59 0.12 0.54 0.22
中间细胞数MID/(×109/L) 17.92 17.98 18.33 18.14 17.80 0.10 0.46 0.69 0.20
粒细胞数GRA/(×109/L) 59.26 56.59 62.39 55.00 53.34 1.42 0.07 0.60 0.11
42日龄42 days of age
血红蛋白含量
HGB content/(g/L)		 109.20 114.60 117.83 120.00 121.50 2.17 0.45 <0.01 0.05
红细胞数RBC/(×1012/L) 2.75 3.02 2.96 3.13 3.18 0.06 0.20 0.03 0.04
白细胞数WBC/(×109/L) 145.74 149.56 147.67 150.50 153.04 0.93 0.12 0.06 0.41
淋巴细胞数LYM/(×109/L) 51.43 47.55 49.52 48.31 48.39 0.97 0.77 0.43 0.17
中间细胞数MID/(×109/L) 18.58 18.10 18.68 18.33 18.45 0.20 0.93 0.15 0.66
粒细胞数GRA/(×109/L) 75.72 83.91 79.47 83.86 86.20 2.05 0.53 0.98 0.88

2.3 饲粮中添加5-ALA对肉鸡血清免疫球蛋白及补体含量的影响

由表5可知,21日龄时,与对照组相比,饲粮中添加45 mg/kg的5-ALA能显著提高血清中IgM和IgG含量(P<0.05),但对血清IgA含量无显著影响(P>0.05)。42日龄时,与对照组相比,饲粮中添加30、45和60 mg/kg的5-ALA能显著提高血清IgA和IgG含量(P<0.05),添加30和45 mg/kg的5-ALA显著提高血清IgM含量(P<0.05)。与对照组相比,饲粮中添加30、45和60 mg/kg的5-ALA能显著提高21日龄肉鸡血清中C3含量(P<0.05),添加45和60 mg/kg的5-ALA能显著提高血清C4含量(P<0.05)。42日龄时,与对照组相比,饲粮中添加45 mg/kg的5-ALA能显著提高血清C3含量(P<0.05),且饲粮中添加5-ALA有提高42日龄肉鸡血清C4含量的趋势(0.05<P<0.10)。同时,随饲粮中5-ALA添加水平的增加,21日龄肉鸡血清中C3和C4含量呈线性升高趋势(P<0.05),42日龄肉鸡血清中IgA含量呈线性和二次升高趋势(P<0.05)。
表5 饲粮中添加5-ALA对肉鸡血清免疫球蛋白及补体含量的影响

Table 5 Effects of dietary 5-aminolevulinic acid supplementation on serum immunoglobulins and complement contents of broilersμg/mL

项目
Items		 5-ALA添加水平
5-ALA supplemental levels/(mg/kg)		 SEM P值P-value
处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic
0(对照Control) 15 30 45 60
21日龄21 days of age
免疫球蛋白A IgA 0.23 0.22 0.22 0.26 0.23 0.01 0.19 0.06 0.51
免疫球蛋白M IgM 0.26a 0.31ab 0.29ab 0.33b 0.30ab 0.01 0.01 0.27 0.20
免疫球蛋白G IgG 0.24a 0.24a 0.27ab 0.31b 0.27ab 0.01 0.01 0.13 0.45
补体3 C3 300.17a 373.76a 371.03b 488.56b 490.87b 18.39 <0.01 0.01 0.76
补体4 C4 102.41a 106.53a 140.85ab 150.34b 157.87b 7.05 0.02 0.01 0.20
42日龄42 days of age
免疫球蛋白A IgA 0.19a 0.22a 0.28bc 0.30c 0.26b 0.01 <0.01 0.02 0.02
免疫球蛋白M IgM 0.30a 0.29a 0.37b 0.36b 0.33ab 0.01 <0.01 0.31 0.20
免疫球蛋白G IgG 0.27a 0.24a 0.30b 0.32b 0.31b 0.01 <0.01 0.20 0.86
补体3 C3 388.82a 424.66a 422.57a 505.93b 427.72a 11.02 0.01 0.17 0.25
补体4 C4 110.15 140.84 121.81 149.75 140.05 5.37 0.08 0.16 0.87

2.4 饲粮中添加5-ALA对肉鸡血清细胞因子含量的影响

由表6可知,与对照组相比,饲粮中添加5-ALA能显著提高21日龄肉鸡血清中IFN-γ含量(P<0.05);且随饲粮中5-ALA添加水平的增加,血清IFN-γ含量呈二次升高的趋势(P<0.05)。另外,与对照组相比,5-ALA的添加具有降低21日龄肉鸡血清TNF-α含量的趋势(0.05<P<0.10)。但饲粮中添加5-ALA对血清IL-1β和IL-4含量无显著影响(P>0.05)。42日龄时,与对照组相比,5-ALA的添加同样具有降低肉鸡血清TNF-α含量的趋势(0.05<P<0.10),但饲粮中添加5-ALA对血清INF-γ、IL-1β、IL-4含量无显著影响(P>0.05)。
表6 饲粮中添加5-ALA对肉鸡血清细胞因子含量的影响

Table 6 Effects of dietary 5-aminolevulinic acid supplementation on serum cytokine contents of broilers

项目
Items		 5-ALA添加水平
5-ALA supplemental levels/(mg/kg)		 SEM P值P-value
处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic
0(对照Control) 15 30 45 60
21日龄21 days of age
干扰素-γ IFN-γ/(pg/mL) 39.47a 54.12b 51.95b 53.80b 52.93b 1.60 0.01 0.35 0.04
肿瘤坏死因子-α
TNF-α/(pg/mL)		 61.12 55.24 53.29 49.92 48.11 1.54 0.09 0.16 0.70
白细胞介素-1β
IL-1β/(pg/mL)		 234.57 239.15 244.23 236.43 247.65 37.36 0.99 0.95 0.85
白细胞介素-4 IL-4/(pg/mL) 103.14 89.21 99.12 102.60 109.52 16.84 0.33 0.52 0.13
42日龄42 days of age
干扰素-γ IFN-γ/(pg/mL) 47.66 46.18 51.75 46.91 51.82 2.14 0.17 0.91 0.58
肿瘤坏死因子-α
TNF-α/(pg/mL)		 59.97 55.93 52.13 49.38 42.99 2.14 0.10 0.63 0.75
白细胞介素-1β
IL-1β/(pg/mL)		 248.75 245.42 239.62 220.49 254.51 8.60 0.82 0.49 0.77
白细胞介素-4 IL-4/(pg/mL) 91.82 106.09 109.79 124.04 108.99 3.44 0.10 0.05 0.89

2.5 饲粮中添加5-ALA对肉鸡β-防御素和Cathelicidins抗菌肽基因表达的影响

如图1所示,与对照组相比,饲粮中添加5-ALA显著提高了21日龄肉鸡肝脏中鸡源Cathelicidins抗菌肽1(CATH1)、鸡源Cathelicidins抗菌肽2(CATH2)、鸡源Cathelicidins抗菌肽3(CATH3)、禽β-防御素1(AvBD1)、禽β-防御素4(AvBD4)和禽β-防御素7(AvBD7)的mRNA相对表达量(P<0.05)。
图1 饲粮中添加5-ALA对β-防御素和Cathelicidins抗菌肽基因表达的影响

数据柱标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。The data columns with different small letters mean significant difference (P<0.05).

CATH1:鸡源Cathelicidins抗菌肽1 antibacterial peptide 1 chicken source Cathelicidins;CATH2:鸡源Cathelicidins抗菌肽2 antibacterial peptide 2 chicken source Cathelicidins;CATH3:鸡源Cathelicidins抗菌肽3 antibacterial peptide 3 chicken source Cathelicidins;AvBD1:禽β-防御素1 Avian β-defensin 1;AvBD4:禽β-防御素4 Avian β-defensin 4;AvBD7:禽β-防御素7 Avian β-defensin 7。

Fig.1 Effects of 5-aminolevulinic acid supplementation on expression of beta-defensin and Cathelicidins antibacterial peptide genes of broilers

2.6 饲粮中添加5-ALA对肉鸡肠道形态的影响

由表7可知,随饲粮中5-ALA添加水平的增加,42日龄肉鸡十二指肠绒毛高度呈线性升高趋势(P<0.05);与对照组相比,饲粮中添加30和60 mg/kg的5-ALA能显著提高回肠V/C(P<0.05),对空肠肠道形态无显著影响(P>0.05)。
表7 饲粮重添加5-ALA对42日龄肉鸡肠道形态的影响

Table 7 Effects of 5-aminolevulinic acid supplementation on intestinal morphology of 42-day-old broilers

项目
Items		 5-ALA添加水平
5-ALA supplemental levels/(mg/kg)		 SEM P值P-value
处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic
0(对照Control) 15 30 45 60
十二指肠Duodenum
绒毛高度Villous height/μm 1 668.65 1 604.84 1 812.08 1 859.38 1 940.28 42.37 0.08 0.01 0.80
隐窝深度Crypt depth/μm 271.87 231.71 241.13 266.58 248.79 8.25 0.50 0.70 0.17
绒毛高度/隐窝深度V/C 6.69 7.27 8.01 7.54 8.14 0.29 0.54 0.12 0.15
空肠Jejunum
绒毛高度Villous height/μm 1 467.25 1 501.68 1 644.46 1 519.74 1 647.59 45.86 0.64 0.64 0.83
隐窝深度Crypt depth/μm 216.78 195.01 209.03 225.78 225.41 7.85 0.74 0.95 0.52
绒毛高度/隐窝深度V/C 7.42 8.58 8.40 7.30 8.10 0.32 0.70 0.59 0.52
回肠Ileum
绒毛高度Villous height/μm 1 146.91 1 326.52 1 194.75 1 252.30 1 382.37 36.78 0.31 0.23 0.50
隐窝深度Crypt depth/μm 226.25 219.80 179.63 215.21 212.50 8.18 0.55 0.71 0.70
绒毛高度/隐窝深度V/C 5.36a 6.46ab 6.80b 6.31ab 6.73b 0.17 0.04 0.04 0.10

3 讨论

3.1 饲粮中添加5-ALA对肉鸡生长性能的影响

近年来5-ALA因其具有促生长作用而备受关注。但目前关于饲粮中添加5-ALA对肉鸡生长性能影响的报道结果并不一致。有研究报道,在饲粮中分别添加0、5、10和15 mg/kg的5-ALA对肉鸡ADG、FI和F/G没有显著影响[7]。Wang等[8]也认为肉鸡的生长性能不受饲粮5-ALA添加量(5和10 mg/kg)的影响。然而,Sato等[6]研究发现,饲粮中添加10 mg/kg的5-ALA提高了21和50日龄肉鸡体重。本试验结果也发现,饲粮中添加低水平(15~45 mg/kg)的5-ALA对肉鸡生长性能无显著改善作用,但添加60 mg/kg的5-ALA降低了肉鸡F/G。相似的研究结果在仔猪中也有报道。Hossain等[9]研究发现,当断奶仔猪饲喂500或1 000 mg/kg的5-ALA饲粮时能提高BW和ADG及降低F/G,而在饲粮添加低剂量(5~15 mg/kg)的5-ALA对断奶仔猪的生长性能没有显著影响[5]。综合目前已有的研究报道,发现饲粮添加低水平(0~45 mg/kg)的5-ALA对肉鸡生长性能的改善效果有限,而适当提高5-ALA添加水平(60 mg/kg)有利于提高肉鸡生长性能。由于本试验5-ALA添加至60 mg/kg仍未观察到肉鸡生长性能的拐点,所以5-ALA的最佳添加水平及其耐受性还需要进一步的研究。饲粮中添加5-ALA提高肉鸡F/G的原因可能与5-ALA提高饲粮中粗蛋白质的利用率有关。Hossain等[9]研究发现,断奶仔猪饲粮中添加5-ALA(500或1 000 mg/kg)能提高仔猪对干物质和粗蛋白质的消化率,并表明这可能与5-ALA能促进血红素形成,并参与细胞色素酶与氧代谢和能量代谢,进而提高机体对营养物质的利用率有关。

3.2 饲粮中添加5-ALA对肉鸡血常规指标的影响

5-ALA作为血红素的合成前体物质,而外源性5-ALA的添加对血红素的合成具有调节作用,另外5-ALA还能促进铁在动物体内的吸收、改善机体内铁状态,进而影响动物HGB形成和RBC[1]。本研究发现,饲粮中添加30、45和60 mg/kg的5-ALA提高了21日龄肉鸡的血液HGB含量,且饲粮添加5-ALA对42日龄肉鸡的血液HGB含量和RBC在均值上有一定的提高作用。多项研究表明,在畜禽饲粮中添加5-ALA能提高动物机体造血机能,提高血液中RBC和HBG含量。任鋆等[10]研究发现,饲粮添加10 mg/kg的5-ALA有提高28日龄肉鸡HBG含量的趋势。Wang等[8]研究结果表明,饲粮中添加5和10 mg/kg的5-ALA提高了35日龄肉鸡血液中RBC,但是对HBG含量没有显著影响。由此可知,不同5-ALA添加水平在不同试验中及肉鸡不同生长阶段的效果是不一致。这可能与动物机体内血红素的合成存在反馈调节机制有关,而HGB含量的形成受到血红素的调节[11]。机体内免疫细胞数量的变化与是否受到致病菌的侵袭及炎症的发生有很大的关联性。本研究发现,饲粮中添加5-ALA对血液中的WBC、LYM、MID、GRA、PLA均无显著影响。同样,Chen等[7]和Wang等[12]研究报道,饲粮中分别添加5和10 mg/kg对肉鸡血液中WBC和LYM无显著影响,而当泌乳母猪受到脂多糖刺激时,饲粮中补充5-ALA能够提高WBC。此外,Sato等[6]报道,当肉鸡受到脂多糖刺激时,饲喂5-ALA的肉鸡其血液中巨噬细胞数量显著高于对照组。这表明5-ALA在动物不同生理状态下对免疫细胞的影响不一致,这种差异的原因还有待进一步研究。

3.3 饲粮中添加5-ALA对肉鸡血清免疫球蛋白和补体含量的影响

血清免疫球蛋白是家禽免疫系统中一类重要的免疫活性物质。家禽主要产生IgG、IgM和IgA 3种免疫球蛋白。目前常用免疫球蛋白的含量反映机体的体液免疫功能。任鋆等[10]研究报道,饲粮中添加10 mg/kg的5-ALA对肉鸡血清IgA、IgM和IgG含量无显著影响,但也有研究表明,饲粮中添加5-ALA提高了断奶仔猪血液中的IgG含量[4]。本研究发现,饲粮中添加45 mg/kg ALA能提高21日龄肉鸡血清中IgM和IgG的含量,添加45 mg/kg的5-ALA提高了42日龄肉鸡血清中IgA、IgM和IgG含量,这种差异可能是不同添加水平原因导致的。本研究表明,饲粮中添加适量的5-ALA有利于提高肉鸡的体液免疫功能。补体是特异性免疫的主要组成成分,可协助抗体和吞噬细胞杀灭病原微生物和加强细胞免疫功能,是体内重要的免疫效应分子;其参与了宿主早期抗感染及机体抗微生物防御反应等[13]。目前还没有研究报道5-ALA对肉鸡血清补体含量的影响。本研究发现,饲粮中添加45和60 mg/kg的5-ALA能提高21日龄肉鸡血清中C3和C4含量,添加5-ALA有提高42日龄肉鸡血清中C3和C4含量的趋势,说明添加5-ALA能促进肉鸡特异性免疫功能。

3.4 饲粮中添加5-ALA对肉鸡血清细胞因子含量的影响

IFN-γ具有很强的免疫调节作用,在动物机体内起双向调节作用。一方面,IFN-γ可激活巨噬细胞和自然杀伤细胞并增强其杀伤和吞噬能力,有助于机体抵御病毒感染,从而增强机体免疫功能;另一方面,IFN-γ能恢复抑制性T细胞的功能,减少免疫复合物的局部沉积,从而抑制I型超敏反应的发生[14]。本研究发现,饲粮中添加5-ALA提高21日龄肉鸡血清中IFN-γ含量。这表明饲粮中添加5-ALA可以提高肉鸡的免疫能力。TNF-α细胞因子是一种主要的促炎症细胞因子,调节宿主对感染、炎症和创伤的反应,其高表达可引起组织损伤与细胞凋亡,其参与单核巨噬细胞的活化及自分泌的调节作用,促进单核巨噬细胞及其他细胞产生细胞因子IL-1β、IL-6以及TNF-α[15]。Sugiyama等[16]研究发现,小鼠巨噬细胞在给予脂多糖刺激时,5-ALA添加组与5-ALA未添加组相比,TNF-α表达量更低。本试验结果表明,在正常生理状态下,饲粮中添加5-ALA也有降低血清中TNF-α含量的趋势。这表明饲粮中添加5-ALA能抑制促炎症因子的分泌,这对缓解动物机体急性炎症是有利的。IL-1β属于IL-1中的一种类型,主要是由单核细胞、巨噬细胞产生的促炎细胞因子。IL-1β的大量产生常伴随着不同疾病的发生,如炎症、疼痛和自身免疫疾病等[17]。IL-4由活化T细胞产生,能促进B细胞增殖、抗体表达、促进肥大细胞增殖、抑制Thl细胞、增强巨噬细胞等[18]。本研究发现,饲粮中添加5-ALA对血清IL-1β和IL-4含量没有显著影响,这可能与肉鸡处于正常生理状态下没有受到外界压力的刺激有关。

3.5 饲粮中添加5-ALA对肉鸡肝脏β-防御素和Cathelicidins抗菌肽基因表达的影响

雏鸡刚孵化时免疫系统尚未完全发育,但先天免疫系统已经进化出一系列机制来应对早期的病原体攻击。AvBDs和CATHs是抗菌肽的2个主要亚类,在先天性和适应性免疫反应中都具有重要作用[19-20]。CATH1、CATH2和CATH3属于CATHs家族,AvBD1、AvBD4和AvBD4属于禽类β-防御素家族。目前在家禽上还没有相关研究报道5-ALA对肉鸡CATHs和禽类β-防御素的影响。本研究发现,与对照组相比,饲粮中添加5-ALA能显著提高肝脏CATH1、CATH2、CATH3、AvBD1、AvBD4和AvBD4的mRNA相对表达量,而CATH1、CATH2、CATH3均具有广谱的抗菌活性,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门菌、肺炎球菌及一些耐药菌株等均具有良好的抗菌作用,5-ALA作为一种饲料添加剂可以有效地刺激抗菌肽表达从而提高肉鸡的免疫保护作用;另外,5-ALA通过刺激抗菌肽表达可以避开CATHs抗菌肽直接饲喂面临的体内易降解和合成成本高等缺点,因此,5-ALA作为抗菌活性和免疫调节活性饲料添加剂具有巨大的潜力。

3.6 饲粮中添加5-ALA对42日龄肉鸡肠道形态的影响

肠道作为动物主要的营养物质吸收场所,也是机体抵御外界病原微生物的第1道防线。因此,良好的肠道形态结构及其功能的完整性对保持家禽健康及维持正常生产性能具有重要意义。肠道绒毛高度、隐窝深度及V/C是反映肠道结构完整性的重要指标,当内、外源性细菌、病毒侵入时,肠道屏障保护动物机体免受损伤。本研究发现,饲粮中添加适量的5-ALA能提高回肠V/C。这可能与5-ALA能改变了肠道微生物群的细菌群落组成,减少了一些病原体的定植,增加了一些益生菌的相对丰度有关[5,21]。以上结果表明,饲粮中添加适量5-ALA可改善42日龄肉鸡肠道形态和屏障功能。

4 结论

饲粮中添加适量水平的5-ALA能提高肉鸡HGB、免疫球蛋白合成能力,促进肉鸡β-防御素和Cathelicidins抗菌肽基因表达,降低血清促炎细胞因子的含量,进而提高肉鸡免疫功能,改善肠道形态结构,提高肉鸡的生长性能。在本试验条件下,肉鸡饲粮中5-ALA推荐添加水平为45~60 mg/kg。

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