Chinese Journal of Animal Nutrition >

2024 , Vol. 36 >Issue 1: 478 - 489

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.043

RESEARCH PAPER

Effects of Dietary Enzymatic Fish Peptides on Growth, Metamorphosis, Liver Metabolism and Antioxidant Capacity of Bullfrog Tadpoles (Lithobates catesbeiana) Fed Low Fish Meal Diets

  • XU Wenjie ,
  • ZHU Bo ,
  • CAI Minglang ,
  • DAI Jihong ,
  • ZHONG Lei ,
  • SHAO Chuang ,
  • HU Yi , * ,
  • CHEN Kaijian , *
Expand
  • Fisheries College, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
* HU Yi, professor, E-mail: ;
CHEN Kaijian, associate professor, E-mail:

Received date: 2023-08-03

  Online published: 2024-01-12

Fold

Abstract

The aim of this study was to investigate the effects of a low fish meal diet supplemented with enzymatic fish peptides on growth, metamorphosis, liver metabolism and antioxidant capacity of bullfrog tadpole. A total of 4 800 tadpoles with an initial body weight of 0.04 g were randomly divided into 5 groups with 3 replicates per group and 320 tadpoles per replicate, and fed 5 different isoniazid and isolipid diets, respectively. A 15% fish meal diet (FM15 group) was set as the control, and two diets with different fish meal levels were set as 10% and 5%, respectively. In each diet, 2.5% and 5.0% enzymatic fish peptides were added, which were recorded as F10E2.5, F10E5, F5E2.5 and F5E5 groups, respectively. The experimental feeding lasted for 65 days. The results showed as follows: 1) compared with FM15 group, the addition of enzymatic fish peptides could increase the metamorphosis and survival rate of tadpoles, among which the metamorphosis of bullfrog tadpoles in the F10E5 group was significantly increased (P<0.05). 2) Compared with the FM15 group, the addition of enzymatic fish peptides except for F5E2.5 group increased intestinal lipase activity of bullfrog (P<0.05). 3) Compared with FM15 group, the addition of enzymatic fish small peptides could significantly increase the intestinal superoxide dismutase (SOD) activity of bullfrogs (P<0.05), in addition, the intestinal glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT) activities and glutathione (GSH) content in F10E5 group were significantly increased (P<0.05). 4) Compared with FM15 group, the addition of enzymatic fish peptides significantly increased the relative expression level of sulfotransferase (SULT) gene in the intestine of bullfrogs (P<0.05), and the F10E5 group significantly increased the relative expression level of CAT, SOD, and glutathione S-transferase (GST) genes (P<0.05). 5) Except for the F5E5 group, the addition of enzymatic fish peptides improved the vacuolisation of bullfrog hepatocytes.6) Compared with FM15 group, the addition of enzymatic fish peptides significantly increased the hepatic aspartate aminotransferase and acid phosphatase activities of bullfrogs (P<0.05), and the hepatic alanine aminotransferase activity of bullfrogs were significantly increased after adding 5.0% enzymatic fish peptides (P<0.05). In conclusion, dietary supplementation of 10% fish meal and 5.0% enzymatic fish peptides (F10E5) can improve metamorphosis rate, survival rate and antioxidant capacity of bullfrog tadpoles without affecting growth.

Key words： enzymatic fish peptides; bullfrog tadpoles; growth; metamorphosis; antioxidant

Cite this article

XU Wenjie , ZHU Bo , CAI Minglang , DAI Jihong , ZHONG Lei , SHAO Chuang , HU Yi , CHEN Kaijian . Effects of Dietary Enzymatic Fish Peptides on Growth, Metamorphosis, Liver Metabolism and Antioxidant Capacity of Bullfrog Tadpoles (Lithobates catesbeiana) Fed Low Fish Meal Diets[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2024 , 36(1) : 478 -489 . DOI: 10.12418/CJAN2024.043

鱼粉是一种优质的动物性蛋白质源,因适口性好、蛋白质含量高及氨基酸平衡,在水产饲料中被广泛使用。然而近来全球渔获量趋于稳定[1],这与我国水产养殖业的迅猛发展和日益增长的饲料需求不相适配,导致鱼粉的供求不平衡。因此,丰富新型蛋白质源在低鱼粉饲料中的应用有利于降低鱼粉依赖,提高养殖效益。
我国海产品加工企业现多从事低值海产品的加工,过程中产生的副产物加工难度大、利润低,很难调动企业生产加工积极性,加之保藏技术的限制,大量下脚料被遗弃,对环境造成了很大的影响[2]。然而海产品下脚料中含有丰富的蛋白质、维生素、软骨素等营养成分[3],若能充分利用,则有很大的经济与生态效益。发酵、酶解等措施可将饲料中的大分子物质转换为易被利用的小分子物质。其中,酶解是利用蛋白酶将蛋白质降解为更易消化吸收的小肽与游离氨基酸,这极大提高了低值蛋白质的利用率[4]。此外,酶解工艺还可消减抗营养因子[5],增加适口性[6]。酶解后的蛋白质源被证明可改善鱼类肌肉品质[7],增强免疫力和抗氧化能力[8],提高动物生长性能[9]。酶解鱼小肽是采用复合蛋白酶对海捕低值鱼或鳕鱼、三文鱼等加工下脚料进行酶解、分离、低温浓缩和低温干燥得到的一种蛋白质原料,其小肽、蛋白质及游离氨基酸含量高于鱼粉,具有替代鱼粉的潜力。酶解鱼小肽是对低值海产品的有效再利用,提高了水产品的附加价值。
牛蛙(Lithobates catesbeiana)原产于北美洲,属脊椎动物门、两栖纲、无尾目、蛙科、蛙属,其肉质细嫩、营养丰富、生长快且环境适应能力强,已被世界上多数国家引种养殖。以往的研究发现,饲料中蛋白质组成及其水平对蝌蚪生长、变态影响较大[10],其中动物蛋白质一般比植物蛋白质更能促进蝌蚪变态[11],但蝌蚪饲料中动物蛋白质开发研究较少。本试验拟探究酶解鱼小肽中丰富的小肽对蝌蚪消化吸收能力的影响,并了解酶解鱼小肽促进牛蛙蝌蚪生长变态的潜力,以促进牛蛙养殖业的发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

酶解鱼小肽理化指标见表1。牛蛙蝌蚪由喜农智慧农业科技发展有限公司提供。
表1 酶解鱼小肽理化指标

Table 1 Physicochemical indexes of enzymatic fish peptide%

项目Items 含量Content
粗蛋白质Crude protein ≥93
粗脂肪Crude fat ≤3
寡肽Oligopeptide ≥99
18种氨基酸18 amino acids ≥83
游离氨基酸Free amino acids ≥22

1.2 试验设计及饲料

试验挑选4 800尾初始体重为0.04 g左右的牛蛙蝌蚪,随机分成5组,每组3个重复,每个重复320尾,分别饲喂5种不同的等氮等脂饲料,其中以15%鱼粉饲料(FM15组)为对照,另设置2个不同鱼粉水平饲料,鱼粉水平分别为10%、5%,并在每个鱼粉水平饲料中分别添加2.5%和5.0%酶解鱼小肽,分别记为F10E2.5、F10E5、F5E2.5、F5E5组,试验投喂持续65 d。
饲料制备前,将原料粉碎后过60目筛,准确称取饲料原料按配比从小到大逐级均匀混合,然后再将豆油与饲料原料手动混匀,后放入搅拌机混匀,再于膨化制粒机中制粒,置于鼓风干燥器中烘干,最后粉碎得到熟化粉料,于-20 ℃冷藏保存待使用。试验饲料组成及营养水平见表2。
表2 试验饲料组成及营养水平(风干基础)

Table 2 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis)%

项目
Items		 饲料Diets
FM15 F10E2.5 F10E5 F5E2.5 F5E5
原料Ingredients
鱼粉Fish meal 15.00 10.00 10.00 5.00 5.00
酶解鱼小肽Enzymatic fish peptide 2.50 5.00 2.50 5.00
鸡肉粉Chicken powder 20.00 20.00 20.00 20.00 20.00
豆粕Soybean meal 11.00 11.00 11.00 11.00 11.00
大豆浓缩蛋白Soy protein concentrate 18.00 19.57 16.00 24.71 21.14
米糠粕Rice bran 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00
面粉Flour 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00
豆油Soybean oil 1.50 1.82 1.82 2.15 2.14
微晶纤维素Microcrystalline cellulose 0.45 1.06 2.13 0.59 1.67
预混料Premix1) 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00
磷酸二氢钙Ca(H2PO4)2 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50
氯化胆碱Choline chloride 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
抗氧化剂Antioxidants 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02
防霉剂Mould inhibitor 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03
合计Total 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00
营养水平Nutrient levels2)
粗蛋白质Crude protein 43.51 43.15 43.64 42.81 43.47
粗脂肪Crude fat 6.11 6.17 6.17 6.24 6.22
总能Gross energy/(MJ/kg) 18.85 18.78 18.88 18.69 18.81

1)预混料为每千克饲料提供 The premix provided the following per kg of diets:KCl 400 mg,KI(1%)120 mg,CoCl2·6H2O(1%) 100 mg,CuSO4·5H2O 60 mg,FeSO4·H2O 800 mg,ZnSO4·H2O 800 mg,MnSO4·H2O 300 mg,Na2SeO3·5H2O(1%) 130 mg,MgSO4·H2O 4 000 mg,沸石粉 zeolite power 7 291.70 mg,VB1 24 mg,核黄素 riboflavin 24 mg,VB6 16 mg,VB12 0.10 mg,VK3 16 mg,肌醇 inositol 200 mg,泛酸 pantothenic acid 80 mg,烟酸 niacin acid 100 mg,叶酸 folic acid 10 mg,生物素 biotin 1.6 mg,VA 50 mg,VD 70 mg,VE 100 mg,VC 200 mg,乙氧基喹啉ethoxyquin 300 mg。

2)营养水平为实测值。Nutrient levels were measured values.

1.3 饲养管理

养殖试验在广西壮族自治区南宁市青秀区某牛蛙蝌蚪繁育厂进行。正式养殖开始前先将苗种放于网箱(0.8 m×0.8 m×0.8 m)中用基础饲料暂养2周。禁食24 h后挑选4 800尾健康的牛蛙蝌蚪,初始均重为0.04 g左右,消毒后将其分为5组,分别饲喂试验饲料。每组3个网箱,每个网箱放320尾牛蛙蝌蚪。每日投喂3次(07:00、12:00、17:00)。每日投喂牛蛙蝌蚪体重的3%~5%,并根据牛蛙蝌蚪的摄食情况每周相应调整。记录试验期间饲料投喂量。

1.4 样品采集

养殖试验结束后饥饿24 h,依次将网箱里的蝌蚪和牛蛙全部捞出,分别对未变态蝌蚪和已变态幼蛙计数并称重,记录饲料投喂量。
每个网箱取6尾已变态蝌蚪(幼蛙)麻醉,进行解剖,将解剖后的肝脏和肠组织分装于1.5 mL无酶管中,于-80 ℃保存,以待后续指标测定。取相同位置的肝脏组织固定于4%甲醛溶液中,用于制作组织苏木精-伊红(HE)染色切片。

1.5 指标测定

1.5.1 饲料营养成分测定

采用乙醚索氏提取法(GB 5009.6—2016)进行粗脂肪含量的测定;采用凯氏定氮法(GB 5009.5—2016),将消化后的样品通过K9860凯氏定氮仪进行粗蛋白质含量的测定;饲料的总能用GR-3500型氧弹式热量计(湖南长沙长兴高教仪器设备开发有限公司)测定。

1.5.2 生长性能指标测定

按下列公式计算生长性能指标:

存活率(SR,%)=100×(试验结束蝌蚪总存尾数/试验开始蝌蚪尾数);

变态率(MR,%)=100×(65 d已变态牛蛙蝌蚪尾数/试验开始蝌蚪尾数);

已变态均重(WOF,g)=(65 d已变态牛蛙蝌蚪总重/65 d已变态牛蛙蝌蚪尾数);

未变态均重(UAW,g)=(65 d存活未变态牛蛙蝌蚪总重/65 d存活未变态牛蛙蝌蚪尾数);

饲料系数(FCR)=总投饲量/(65 d总重-初总重)。

1.5.3 肠道消化酶活性及抗氧化指标的测定

称量1 g左右组织样本,按对应试剂盒的匀浆基质进行匀浆,匀浆后放入离心机中离心(3 000 r/min,10 min,4 ℃),取上清液。肠道胰蛋白酶(trypsin)、脂肪酶(LPS)、淀粉酶(AMS)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量和总抗氧化能力(T-AOC)均采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定。

1.5.4 肠道抗氧化相关基因表达水平的测定

每个网箱随机选取6只已变态幼蛙。在放置有冰袋的解剖盘上解剖,迅速采集肠道放置于1.5 mL无酶管中。封口膜封口后迅速转移至液氮中保存,之后再转存于-80 ℃冰箱直到下一步操作。RNA提取检测及cDNA的合成均参照实验室前期试验步骤进行,本研究中使用荧光定量PCR仪为BIO-RAD CFX96TM Real-Time System,根据MonAmpTM Fast SYBR® Green qPCR Mix试剂盒进行实时荧光定量PCR反应。反应体系如表3。反应程序:1)预变性(95 ℃,30 s);2)扩增(95 ℃,5 s;58 ℃,30 s;40个循环);3)终止反应。本试验以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参,每个待测样品设3个重复,使用2-△△Ct法测定目的基因相对表达量。基因引物序列见表4。
表3 实时荧光定量PCR反应体系

Table 3 RT-qPCR reaction system

试剂Reagents 使用量Volume
MonAmpTM SYBR® Green qPCR Mix 10.0 μL
cDNA溶液cDNA solution 10~200 ng
上游引物Forward primer 0.40 μL
下游引物Reverse primer 0.40 μL
无酶水Nuclease-free water 20 μL
表4 基因引物序列

Table 4 Primer sequence for genes

基因
Genes		 上游引物
Forward primer (5'—3')		 下游引物
Reverse primer (5'—3')		 GenBank登录号
GenBank accession No.
过氧化氢酶CAT GATGGGAACTGGGATCTGA-
CTGGAAA		 CTGAGAGTGGATGAATG-
ACGGGAACA		 GQ222411.1
超氧化物歧化酶SOD GCATTCTATCATTGGA-
CGCACAGCA		 CCCACCAGCATTGCC-
AGTTATCA		 BT081775.1
谷胱甘肽S-转移酶GST GTGTGGATTGGAAAG-
AAGAGGTGGTGA		 TCCTAGCAAGATGGCGG-
AGTATGG		 BT081728.1
磺基转移酶SULT GAAGACATGAAAGC-
GGACCTCAC		 GCTCATCCTTCAGAGCT-
AAGCCATA		 BT081442.1
β-肌动蛋白β-actin ATGATGCTCCTCG-
TGCTGTGT		 CCCCATTCCAACC-
ATGACA		 AB094353.1

1.5.5 肝脏组织结构的观察

将固定好的肝脏样品修剪、脱水、包埋、切片、染色、封片,最后置于显微镜下镜检,选择制备效果理想的切片进行电镜扫描并生成电子文件,使用配套软件KF-Viewer查看切片,在不同倍数下观察组织结构。同时在各组切片随机取6片区域对细胞数进行统计计数作图。

1.5.6 肝脏代谢相关指标测定

肝脏谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、酸性磷酸酶(ACP)活性和总胆汁酸(TBA)含量均采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定,操作步骤详见说明书。

1.6 数据统计

试验数据在进行正态性及方差齐质性检验后,采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析和LSD多重比较,数据以“平均值±标准误”表示。P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 饲料中添加酶解鱼小肽对牛蛙蝌蚪生长指标的影响

由表5可知,与FM15组相比,F10E2.5与F5E2.5组牛蛙蝌蚪存活率、变态率、已变态均重与未变态均重无显著差异(P>0.05)。与FM15组相比,F10E5与F5E5组牛蛙蝌蚪存活率、已变态均重、未变态均重、饲料系数无显著差异(P>0.05),此外F10E5组牛蛙蝌蚪变态率显著提高(P<0.05)。
表5 饲料中添加酶解鱼小肽对牛蛙蝌蚪生长指标的影响

Table 5 Effects of dietary enzymatic fish peptide on growth indices of bullfrog tadpoles

项目
Items		 组别Groups
FM15 F10E2.5 F10E5 F5E2.5 F5E5
初均重IAW/g 0.04±0.00 0.04±0.00 0.04±0.00 0.04±0.00 0.04±0.00
存活率SR/% 79.58±5.01 98.06±6.45 96.98±3.53 80.16±8.21 97.08±3.07
变态率MR/% 43.75±1.44a 48.44±4.69ab 53.28±0.63b 50.00±2.71ab 50.31±0.36ab
已变态均重WOF/g 2.91±0.01ab 2.58±0.09ab 2.72±0.25ab 3.03±0.21b 2.45±0.05a
未变态均重UAW/g 2.95±0.04 2.52±0.27 2.69±0.62 2.54±0.07 2.66±0.09
饲料系数FCR 1.13±0.06a 1.46±0.13b 1.15±0.04a 1.09±0.01a 1.11±0.02a

同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 饲料中添加酶解鱼小肽对牛蛙肠道消化酶活性的影响

由表6可知,与FM15组相比,F10E2.5与F5E2.5组牛蛙肠道AMS活性均无显著影响(P>0.05),同时F10E2.5组牛蛙肠道LPS活性显著提高(P<0.05)。与FM15组相比,F10E5与F5E5组牛蛙肠道LPS活性均显著提高(P<0.05),同时F10E5组牛蛙肠道AMS活性显著提高(P<0.05)。
表6 饲料中添加酶解鱼小肽对牛蛙肠道消化酶活性的影响

Table 6 Effects of dietary enzymatic fish peptide on activities of intestinal digestive enzymes of bullfrogs

项目
Items		 组别Groups
FM15 F10E2.5 F10E5 F5E2.5 F5E5
脂肪酶LPS/(U/g prot) 51.14±2.29a 58.33±3.45b 62.42±0.79b 56.30±0.95ab 60.34±1.64b
淀粉酶AMS/(U/mg prot) 0.14±0.01ab 0.18±0.01bc 0.20±0.03c 0.11±0.00a 0.19±0.02bc
胰蛋白酶Trypsin/(U/mg prot) 33.97±1.65 32.58±1.13 33.75±1.03 33.08±0.40 33.63±0.53

2.3 饲料中添加酶解鱼小肽对牛蛙肠道抗氧化指标的影响

由表7可知,在饲料中添加酶解鱼小肽总体提升了牛蛙肠道SOD、GSH-Px、CAT活性和GSH含量,但对MDA含量无显著影响(P>0.05)。与FM15相比,F10E2.5与F5E2.5组牛蛙肠道SOD活性显著提高(P<0.05),但对牛蛙肠道GSH-Px、CAT活性与GSH含量均无显著影响(P>0.05)。与FM15相比,F10E5与F5E5组牛蛙肠道SOD与CAT活性均显著提高(P<0.05),同时F10E5组牛蛙肠道GSH-Px活性与GSH含量显著上升(P<0.05)。
表7 饲料中添加酶解鱼小肽对牛蛙肠道抗氧化指标的影响

Table 7 Effects of dietary enzymatic fish peptides on intestinal antioxidant indexes of bullfrogs

项目
Items		 组别Groups
FM15 F10E2.5 F10E5 F5E2.5 F5E5
超氧化物歧化酶
SOD/(U/mg prot)		 120.67
±2.82a		 151.85
±3.44b		 185.67
±6.19d		 144.12
±2.00b		 168.97
±5.22c
谷胱甘肽过氧化物酶
GSH-Px/(U/mg prot)		 223.21
±30.07a		 322.40
±21.68ab		 373.66
±49.19b		 296.22
±29.82ab		 343.93
±50.85ab
丙二醛
MDA/(nmol/mg prot)		 3.16
±0.05		 3.04
±0.10		 2.96
±0.09		 3.10
±0.13		 3.01
±0.05
谷胱甘肽
GSH/(μmol/g prot)		 1 365.73
±51.37a		 1 338.98
±102.60a		 1 777.63
±87.51b		 1 286.91
±39.56a		 1 569.93
±157.03ab
过氧化物酶
CAT/(U/mg prot)		 4.90
±0.30a		 5.31
±0.48a		 7.06
±0.30b		 5.92
±0.43ab		 6.99
±0.40b

2.4 饲料中添加酶解鱼小肽对牛蛙肠道抗氧化相关基因表达的影响

由表8可知,与FM15组相比,F10E2.5与F5E2.5组牛蛙肠道SULT基因相对表达量均显著上调(P<0.05),但CAT基因相对表达量均无显著差异(P>0.05),同时F5E2.5组牛蛙肠道SOD与GST基因相对表达量均显著上调(P<0.05)。与FM15组相比,F10E5与F5E5组牛蛙肠道SULT基因相对表达量显著上调(P<0.05),同时F10E5组牛蛙肠道CAT、SOD与GST基因相对表达量显著上调(P<0.05)。
表8 饲料中添加酶解鱼小肽对牛蛙肠道抗氧化相关基因表达的影响

Table 8 Effects of dietary enzymatic fish peptides on antioxidant-related genes in intestine of bullfrog

项目
Items		 组别Groups
FM15 F10E2.5 F10E5 F5E2.5 F5E5
过氧化氢酶CAT 1.05±0.06a 1.24±0.06a 1.86±0.16b 1.28±0.08a 1.18±0.07a
超氧化物歧化酶SOD 1.03±0.04a 1.21±0.14a 2.62±0.06c 1.59±0.06b 1.19±0.06a
谷胱甘肽S-转移酶GST 1.05±0.06a 1.31±0.15ab 2.10±0.04c 1.47±0.08b 1.20±0.09ab
磺基转移酶SULT 1.00±0.05a 1.42±0.02b 1.93±0.14c 1.46±0.05b 1.48±0.03b

2.5 饲料中添加酶解鱼小肽对牛蛙肝脏组织结构的影响

由图1可知,除F5E5组外,不同添加水平的酶解鱼小肽均能改善牛蛙肝细胞空泡化,使牛蛙肝细胞形态结构正常,胞核结构清晰,肝细胞无明显病理变化。F10E5组较之其余各组肝血窦丰富。由图2可知,在肝细胞数上,F5E2.5组显著低于除F10E2.5组外的其余3组(P<0.05)。
图1 饲粮中添加酶解鱼小肽对牛蛙肝脏组织结构的影响(HE染色)

a:中央静脉 central veins;b:肝细胞 hepatocyte;c:肝血窦 hepatic sinusoid;d:细胞空泡化 cellular vacuolation。

FM15、F10E2.5、 F10E5、 F5E2.5、F5E5为组别。

Fig.1 Effects of dietary enzymatic fish peptides on liver histological structure of bullfrog (HE staining)

FM15, F10E2.5, F10E5, F5E2.5, and F5E5 were the groups.

图2 各组牛蛙蝌蚪肝脏组织细胞数

图中相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Fig.2 Number of liver tissue cells in bullfrog tadpoles in each group

The same letter in the figure indicates that the difference is not significant (P>0.05), while different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05).

2.6 饲料中添加酶解鱼小肽对牛蛙肝脏代谢相关指标的影响

由表9可知,与FM15组相比,F10E2.5与F5E2.5组牛蛙肝脏AST、ACP活性均显著提高(P<0.05),但对ALT活性无显著影响(P>0.05),同时F5E2.5组牛蛙肝脏TBA含量显著上升(P<0.05)。与FM15组相比,F10E5与F5E5组牛蛙肝脏AST、ALT与ACP活性均显著提高(P<0.05),但TBA含量无显著差异(P>0.05)。
表9 饲料中添加酶解鱼小肽对牛蛙肝脏代谢相关指标的影响

Table 9 Effects of dietary enzymatic fish peptide on liver metabolism-related indexes of bullfrogs

项目
Items		 组别Groups
FM15 F10E2.5 F10E5 F5E2.5 F5E5
谷草转氨酶AST/(U/g prot) 13.75±0.48a 14.69±0.12b 21.82±2.08b 16.09±1.07b 17.38±1.18b
谷丙转氨酶ALT/(U/g prot) 17.13±0.39a 21.19±0.57ab 25.10±3.05b 18.14±0.83a 24.90±2.04b
酸性磷酸酶
ACP/(金氏单位/g prot)		 154.10±1.44a 186.66±7.28b 271.76±6.47c 174.90±2.54b 267.97±2.95c
胆汁酸TBA/(μmol/g prot) 10.90±0.87a 12.62±1.08ab 11.84±0.41a 14.64±0.31b 11.06±0.16a

3 讨论

3.1 饲料中添加酶解鱼小肽对牛蛙蝌蚪变态与生长指标的影响

蛋白质是机体生长发育必需的营养素,酶解鱼小肽比鱼粉拥有更多的小肽与游离氨基酸,限度保留了海洋鱼类中的营养成分和活性。饲料中适宜的游离氨基酸与小肽可促进机体生长,减少机体疾病发生。周露阳等[12]发现黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)饲料中8.5%添加量的酶解鱼溶浆和8.2%添加量的酶解鱼浆可以替代28%的鱼粉。Tang等[13]研究发现,在饲料中添加5%、10%、15%的鱼蛋白水解物提升了大黄鱼(Larimichthys crocea)的增重率和免疫酶活性。然而与这些结果相反的是,在本试验中,添加酶解鱼小肽后,已变态均重除F5E2.5组均低于FM15组,未变态均重均低于FM15组,这可能是由于养殖过程中保持各组投喂量一致,而添加酶解鱼小肽组存活率高于FM15组,同时变态完成的蛙不摄食粉料,导致了平均每只蝌蚪摄食率降低,因此已变态均重和未变态均重均有所下降。即便如此,在单位摄食量降低的情况下,添加酶解鱼小肽仍能提高牛蛙蝌蚪的变态率。这可能是因为与大分子蛋白质相比,小肽能使机体对营养的利用、沉积效率更高[14]。同时,小肽作为肠道的吸收底物,还被发现能提升氨基肽酶和二肽酶的活性[15],促进机体对营养素的转运利用,从而促进牛蛙蝌蚪的变态。然而酶解鱼小肽在蝌蚪摄食减少的前提下仍能高效促进蝌蚪变态的有效成分及原因还需要被进一步研究。

3.2 饲料中添加酶解鱼小肽对牛蛙蝌蚪肠道消化酶活性的影响

消化酶是动物胃肠道内消化利用饲料营养物质的酶,其活性反映动物吸收利用营养效率,与机体的生长发育息息相关[16]。本试验中,F10E5组肠道淀粉酶活性最高,呈先上升后下降再上升的趋势,与钟国防等[17]研究结果趋势相似,这可能是添加饲料中富含的寡肽能促进葡萄糖的转运[18],从而提升AMS的活性。张改改等[19]研究发现,用酶解豆粕替代鱼粉时,肠道LPS活性呈先上升后下降趋势,且显著高于鱼粉组。在本试验中,肠道LPS活性虽然呈先上升后下降再上升趋势,但添加酶解鱼小肽后肠道LPS活性显著高于FM15组。这与张改改等[19]研究结果相似,这可能是小肽可以作为底物诱导消化酶分泌,有效刺激肠道绒毛的刷缘酶的活动,加速绒毛的生长,提高LPS的活性[15],从而提高消化和吸收的能力,促进鱼的生长。本试验中各组胰蛋白酶活性无显著差异,这与敬庭森等[20]研究结果一致。这可能是小肽可以直接被机体吸收,而无需经过蛋白酶的水解[21],因此胰蛋白酶适应性降低。

3.3 饲料中添加酶解鱼小肽对牛蛙蝌蚪肠道抗氧化指标的影响

MDA是细胞内多不饱和脂肪酸过氧化作用的最终产物之一,通常被认为是氧化应激的生物标志物[22]。本试验中,肠道MDA含量呈下降趋势,组织的脂质过氧化程度减弱,这与星斑川鲽(Platichthys stellatus)幼鱼[23]的研究结果一致。这可能是由于酶解鱼小肽中存在疏水氨基酸,这些氨基酸的丰度有利于更高的乳化能力,能抑制脂质过氧化[24]。机体内有特殊的酶,如SOD、CAT和GSH-Px等,它们相互协作,清除自由基,缓解机体抗氧化损伤,是细胞酶防御系统的重要组成部分[25-26]。张瑾莉等[27]研究发现,饲料中添加栝蒌籽蛋白酶解物后,过氧化氢(H2O2)氧化损伤HepG2细胞的总GSH含量有效提高,在本试验中,除F5E2.5组外其余添加酶解鱼小肽组的肠道GSH含量均高于FM15组。这或与酶解鱼小肽含有丰富的半胱氨酸有关,其主要代谢用途是谷胱甘肽的合成[28]。易婉婷[29]研究发现,饲料中添加2%和3%的小肽时乌鳢(Channa argus)肝脏总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性显著提升。在本试验中,饲料中添加2.5%和5.0%的酶解鱼小肽,肠道SOD、GSH-Px和CAT活性均升高,此外,CAT、GST、SOD、SULT基因相对表达量也均升高,这与肠道CAT和SOD活性结果基本一致,均在F10E5组达到最高值。这可能是小肽中的某些基团与自由基相结合,还原自由基[30],进而显著提升蝌蚪的抗氧化能力。

3.4 饲料中添加酶解鱼小肽对牛蛙蝌蚪肝脏结构与代谢的影响

结合肝脏HE染色结果发现,添加酶解鱼小肽可以缓解肝脏空泡化。有研究表明,空泡可能是由于细胞器结构损坏导致肝细胞失去糖原物质或者是正在溶解的脂滴构成[31]。胆汁酸是由胆固醇在肝脏中合成的两性分子,是胆汁的主要成分[32]。肝脏内胆汁酸的大量增加会导致肝细胞坏死,胆汁酸不是通过直接细胞毒作用致肝脏坏死,胆汁酸可能通过引发肝细胞炎症反应引发胆汁淤积性肝脏损伤[33]。本试验中,各组肝脏TBA含量未大量增加,佐证了肝脏组织没有产生明显病理变化。
AST与ALT在肝脏中活性较高,它们活性的大小与氨基酸代谢与肝脏组织健康状态有关[34]。王玲[35]研究发现,添加不同水平与不同种类的生物活性肽后,凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肝胰腺ACP活性与18%鱼粉组无显著差异。本试验中,添加酶解鱼小肽后肝脏ACP活性高于FM15组,这可能是因为酶解产生的生物学活性肽增强了巨噬细胞的增殖及吞噬能力,也有可能是酶解后杀死一部分病原微生物[36],增强了机体的免疫能力,进而提高牛蛙蝌蚪的存活率。本试验中,添加酶解鱼小肽组肝脏ALT活性均高于FM组,与张宇[37]研究结果相似,这可能是由于饲料中游离氨基酸含量增加,AST与ALT活性随之升高,转氨作用相应加强[38],此外,F5E2.5组肝脏ALT活性较其他酶解鱼小肽组显著降低,这可能是因为大豆浓缩蛋白氨基酸含量远低于鱼粉与酶解鱼小肽,F5E2.5组氨基酸含量最少,转氨作用减弱。

4 结论

补充酶解鱼小肽能有效降低饲料鱼粉添加量,在不影响生长的情况下,饲料中添加10%鱼粉与5.0%酶解鱼小肽(F10E5)能提高牛蛙蝌蚪变态率、存活率及抗氧化能力。

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