众所周知,蜜蜂在生态环境保护以及为农作物传花授粉等方面都发挥了重要的作用[1]。近年来,由于蜂群崩溃失调症导致蜜蜂大量死亡,蜜蜂营养问题作为主要引发原因而引起广泛的关注,人们对利用益生菌来改善蜜蜂的营养状况产生了浓厚的兴趣;此外,营养胁迫会对蜜蜂的繁育、生长发育、采集以及对疾病和农药的抵抗能力等产生负面影响[2],因此,研究蜜蜂的合理营养需求对于提高蜜蜂的健康水平具有重要的意义。
研究表明,益生菌可通过调节肠道微生态环境,增强机体免疫力,提高饲料利用率,促进机体健康生长[3⇓⇓-6];特别是益生菌中的乳酸菌,有报道称在蜜蜂的食物中添加乳酸菌可以显著提高肠道菌群的丰度及改善结构,诱发抗菌肽基因上调,提高蜜蜂的免疫力[7];另有研究显示,持续使用含有乳酸菌的蔗糖溶液喷巢脾表面,可以提高工蜂采食量,提高蜂群的群势及封盖子量,从而提高蜂群的生产能力[8]。
由蜂房蜜蜂球菌等病原微生物引起的传染性疾病常发生于中华蜜蜂(Apis cerana cerana)蜂群,为了避免蜜蜂疾病导致的工蜂大量死亡及经济损失,养殖户一般采用在饲料中添加四环素、土霉素等抗生素的方法进行防治[9],但长期使用抗生素也会造成一系列的负面影响,研究证实,抗生素使用会造成蜜蜂肠道微生态平衡破坏、抗病性减弱、对其他病原的易感性增加以及病原菌耐药性增强等问题[10⇓-12]。
然而,利用乳酸菌和抗生素对经济昆虫的影响研究鲜有报道,尤其缺乏对免疫防御的第一道屏障——肠道方面的影响研究,不利于其在蜜蜂养殖中实际应用。因此,本试验通过在中华蜜蜂糖饲料中添加乳酸菌和抗生素,评价其对中华蜜蜂肠道消化酶活性、免疫基因表达及工蜂存活率等指标的影响,旨在初步探讨外源乳酸菌对中华蜜蜂的益生作用,以期为其在蜜蜂养殖中的应用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试蜜蜂
试验所用蜜蜂为于2022年10月取自重庆市畜牧科学院试验蜂场的本地中华蜜蜂,选择在自然条件下郎氏标准箱饲养配置有姐妹蜂王的试验蜂群3群,群势均为5足框(每群蜂中放5张巢脾),其中卵平均0.17脾、幼虫平均0.32脾、封盖子平均0.65脾、蜜粉平均1.8脾。
1.1.2 主要试剂
试验所用乳酸菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),购自苏州北纳创联生物技术有限公司,活菌数≥1×1011 CFU/g;所用抗生素为四环素,购自上海麦克林生化科技有限公司。蛋白质定量测定试剂盒、淀粉酶测定试剂盒、二糖酶测定试剂盒和胃蛋白酶测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,反转录试剂盒购自美国Thermo Scientific公司,荧光定量测定试剂盒购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司。
1.1.3 试验设计
本试验在重庆市畜牧科学院经济动物研究所实验室进行。中华蜜蜂的取样方法参考Liu等[13]的试验方法并加以改进,在试验开始前,将即将出房的封盖子脾放置于饲养盒(48.8 cm×10.0 cm×24.0 cm)中带回实验室,一起放置在黑暗的人工气候箱中过夜培养(温度34 ℃,相对湿度70%)[14],以获得24 h内出房的工蜂,记为0日龄。取0日龄的中华蜜蜂工蜂540只,随机分为3个组,每组3个重复,每个重复60只蜜蜂。3组中其中1组为对照组,饲喂50%(质量分数,下同)蔗糖溶液[14];另外2组为试验组,分别饲喂添加1×108 CFU/mL植物乳杆菌的50%蔗糖溶液[15](乳酸菌组)和添加450 μg/mL四环素(略低于养蜂生产上的使用浓度)的50%蔗糖溶液[16](抗生素组)。具体饲喂方法为:每个昆虫饲喂盒中提供1个直径为35 mm培养皿,各加入4 mL不同处理的蔗糖溶液,该饲喂量足够饲喂盒中的全部蜜蜂食用,每天定时更换蔗糖溶液,植物乳杆菌和四环素始终饲喂;另外,每个饲喂盒中补充适量灭菌花粉供其食用。对照组和试验组每个重复蜜蜂分别饲养在单独昆虫饲喂盒(26.0 cm×17.5 cm×12.5 cm)中,放入人工气候箱黑暗饲养(温度30 ℃,相对湿度60%)[14]。
1.2 测定指标及方法
1.2.1 肠道消化酶活性的测定
于15日龄,每个重复取成蜂15只,用镊子将蜜蜂的肠道拉出,截取中肠,放置于1.5 mL离心管中。参照刘春蕾[17]的方法,加入生理盐水分别将其制成1%和10%(质量分数)的匀浆液。其中,1%的匀浆液使用蛋白质定量测定试剂盒测定中华蜜蜂中肠蛋白质浓度;10%的匀浆液分别使用淀粉酶测定试剂盒、二糖酶测定试剂盒及胃蛋白酶测定试剂盒测定中华蜜蜂中肠淀粉酶、蔗糖酶和蛋白酶活性。
1.2.2 肠道免疫基因相对表达量的测定
表1 免疫相关基因的RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used in RT-qPCR for immune-related genes |
| 基因 Genes | 引物序列 Primer sequences (5'—3') |
|---|---|
| β-肌动蛋白 β-actin | F:TTGTATGCCAACACTGTCCTTT R:TGGCGCGATGATCTTAATTT |
| Abaecin | F:CAGCATTCGCGTATGTACCA R:GACCAGGAAACGTTGGAAAC |
| 防御素-1 Defensin-1 | F:TGTCGGCCTTCTCTTCATGG R:TGACCTCCAGCTTTACCCAAA |
| 肽聚糖识别蛋白 PGRP | F:GAGGCTGGTACGACATTGGT R:TTATAACCAGGTGCGTGTGC |
| Toll | F:TAGAGTGGCGCATTGTCAAG R:ATCGCAATTTGTCCCAAAAC |
| Cactus-1 | F:CACAAGATCTGGAGCAACGA R:GCATTCTTGAAGGAGGAACG |
| Dorsal-1 | F:AGAGATGGAACGCAGGAAAC R:TGACAGGATATAGGACGAGGTAA |
1.2.3 工蜂存活率的测算
按照1.1.3中相同的分组及处理方法,每个组105只蜜蜂(每个组分3个昆虫饲喂盒饲养,每盒35只工蜂)。每天记录并取出昆虫饲喂盒中死亡的工蜂,更换蔗糖溶液,直至30日龄。
1.3 数据处理
试验数据采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),并采用Duncan氏法进行多重比较,试验结果以“平均值±标准差”形式表示,P<0.05为差异显著。采用生存分析的Kaplan-Meier曲线进行存活率分析,采用GraphPad Prism 8制图。
2 结果与分析
2.1 乳酸菌和抗生素对中华蜜蜂肠道消化酶活性的影响
由表2可知,饲喂15 d,乳酸菌组中华蜜蜂中肠淀粉酶活性显著高于对照组(P<0.05),抗生素组中肠淀粉酶和蛋白酶活性均显著低于对照组(P<0.05)。乳酸菌组、抗生素组和对照组之间中肠蔗糖酶活性无显著差异(P>0.05)。
表2 乳酸菌和抗生素对中华蜜蜂肠道消化酶活性的影响Table 2 Effects of lactic acid bacteria and antibiotics on intestinal digestive enzyme activity of Apis cerana ceranaU/mg prot |
| 项目Items | 淀粉酶Amylase | 蔗糖酶Sucrase | 蛋白酶Proteinase |
|---|---|---|---|
| 对照组Control group | 0.079±0.010b | 170.667±24.685a | 1.733±0.252b |
| 乳酸菌组Lactic acid bacteria group | 0.105±0.011c | 215.333±18.502a | 1.867±0.404b |
| 抗生素组Antibiotics group | 0.050±0.013a | 200.333±36.556a | 0.933±0.153a |
同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05),相同字母表示差异不显著(P>0.05)。 | |
In the same column, values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). |
2.2 乳酸菌和抗生素对中华蜜蜂肠道免疫基因相对表达量的影响
如图1所示,饲喂15 d,乳酸菌组中华蜜蜂中肠Abaecin和Toll基因的相对表达量显著高于对照组(P<0.05);乳酸菌组中肠Cactus-1基因的相对表达量显著低于对照组(P<0.05);乳酸菌组中肠Defensin-1、PGRP和Dorsal-1基因的相对表达量与对照组相比无显著差异(P>0.05)。饲喂15 d,抗生素组中华蜜蜂中肠Defensin-1、PGRP和Cactus-1基因的相对表达量显著低于对照组(P<0.05),抗生素组中肠Abaecin、Toll和Dorsal-1基因的相对表达量与对照组相比无显著差异(P>0.05);抗生素组中肠Abaecin、Defensin-1、PGRP和Toll基因的相对表达量显著低于乳酸菌组(P<0.05),抗生素组中肠Cactus-1和Dorsal-1基因的相对表达量与乳酸菌组相比无显著差异(P>0.05)。
图1 乳酸菌和抗生素对中华蜜蜂肠道免疫基因相对表达量的影响数据柱标注不同字母表示差异显著(P<0.05),相同字母表示差异不显著(P>0.05)。 Fig.1 Effects of lactic acid bacteria and antibiotics on relative expression levels of intestinal immune genes of Apis cerana cerana Value columns with different letters mean significant difference (P<0.05), while with the same letters mean no significant difference (P>0.05). |
2.3 乳酸菌和抗生素对中华蜜蜂工蜂存活率的影响
如图2所示,在室内饲养环境下,乳酸菌和抗生素均显著影响了中华蜜蜂工蜂存活率(P<0.05)。与对照组相比,饲喂乳酸菌可以使工蜂的平均生存时间显著延长2.75 d(P<0.05),饲喂抗生素导致工蜂的平均生存时间显著缩短2.39 d(P<0.05)。
3 讨论
3.1 乳酸菌对蜜蜂肠道消化酶活性、免疫基因表达及工蜂存活率的影响
蜜蜂肠道中的消化酶系统在食物消化、营养吸收和能量转化过程中起着很重要的作用,其与蜜蜂的生命活动密切相关。本研究中,饲喂添加乳酸菌饲料后的中华蜜蜂中肠淀粉酶的活性显著提高,可能是由于乳酸菌在生长代谢过程中产生了淀粉酶等消化酶;此外,消化酶催化分解获得的小分子物质对于乳酸菌的生长也可起到正反馈作用,形成良性循环[20]。因此,消化酶活性升高可提高饲料利用率,促进昆虫生长发育,因而对蜜蜂的存活率起到促进作用。
蜜蜂肠道作为免疫防御的第一道屏障发挥着举足轻重的作用。昆虫对外源性物质的免疫应答通过Toll、免疫缺陷(IMD)、Janus激酶(JAK)/信号传导与转录激活子(STAT)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)等相互关联的信号通路诱导抗菌肽的表达[21]。Toll、Cactus-1和Dorsal-1属于Toll信号通路的关键基因,Toll参与体液免疫,诱导单磷酸腺苷(AMP)表达[22];Dorsal-1是Toll信号通路中存在的编码核因子-κB(NF-κB)转录因子基因之一,与AMP启动子原件结合,从而诱导AMP表达[23];Cactus-1是编码合成抗菌肽的抑制因子。本研究中,乳酸菌能显著提高中华蜜蜂中肠Toll的相对表达量,并使中肠Cactus-1相对表达量显著降低,推测乳酸菌对Toll信号通路的激活均起积极作用。Abaecin类抗菌肽是蜜蜂体内重要的抗菌肽,具有较强的抗菌活性[24]。本试验结果表明,乳酸菌可以显著提高中华蜜蜂中肠Abaecin的相对表达量,这与雷清芝等[15]、Lv等[25]在研究益生菌对蜜蜂的影响中表现出相似的结果。综上可知,乳酸菌可以有效地调控机体的免疫反应,通过激活免疫相关的信号通路,诱导抗菌肽效应分子基因的表达,提高蜜蜂的免疫力,从而提高蜜蜂的存活率。该结果为进一步阐明乳酸菌对蜜蜂生存的影响提供了重要的依据。
3.2 抗生素对蜜蜂肠道消化酶活性、免疫基因表达及工蜂存活率的影响
有研究显示,抗生素添加能对小菜蛾(Plutella xylostella)的生长发育产生显著影响,导致小菜蛾发育历期延长、幼虫死亡率升高、预蛹畸形率提高和成虫寿命降低[26-27]。叶佳琴等[28]的研究结果表明,抗生素对西花蓟马(Frankliniella occidentalis)的死亡率有显著的影响,随着浓度的提高和处理时间的延长,其死亡率显著升高。本研究证实,抗生素的使用也引起蜜蜂存活率的降低,推测一方面可能是由于抗生素的使用影响昆虫肠道菌群的组成和结构,导致肠道共生菌的减少从而影响其存活;另一方面,根据本研究结果推测,抗生素的使用通过降低消化酶的活性从而降低了对营养物质的吸收利用,导致蜜蜂的存活率降低。
在蜜蜂对外界外源物质的免疫应答中,识别是免疫应答的第一步,其主要受到PGRP等免疫相关基因的调控,本试验中抗生素组中华蜜蜂中肠PGRP相对表达量表达量显著下调,说明抗生素会降低蜜蜂肠道对病菌的识别敏感度。抗生素对蜜蜂体内重要的抗菌肽Defensin-1的表达也有抑制作用。值得注意的是,饲喂抗生素后,抗菌肽合成的抑制因子Cactus-1相对表达量显著也下调,说明抗生素在一定程度上又促进了抗菌肽的合成。因此,抗生素对蜜蜂机体的免疫反应的影响有待进一步研究。
3.3 乳酸菌在蜜蜂饲料中的应用前景
乳酸菌可以增强蜜蜂的免疫力,前人的大多研究关于乳酸菌对免疫相关基因的影响大多集中在抗菌肽方面,较少详细分析对蜜蜂免疫信号通路的影响。Toll信号通路是在进化上保守的信号通路,在昆虫发育和免疫方面均起重要作用[31]。在本研究中,笔者专注于乳酸菌对Toll信号通路中免疫相关基因的影响,因此,本研究为详细阐释乳酸菌对蜜蜂的免疫作用机制奠定了理论基础。
乳酸菌对蜜蜂的益生能力逐渐在蜜蜂营养研究领域得到证实和认可,包括维持肠道微生物动态平衡,促进营养物质代谢,提高免疫力等[32]。然而,人们对乳酸菌的功能大多处于探索阶段,因为乳酸菌应用于蜂群是具有菌属特异性的,并不是所有的乳酸菌都会对蜜蜂产生益生作用。Janashia等[33]将5种不同的乳酸菌掺入食物中饲喂给蜜蜂幼虫,只有Bifidobacterium asteroides 26p和Fructobacillus pseudoficulneus 57这2种菌能通过上调蜜蜂抗菌肽的表达来激活免疫系统。值得引起注意的是,有些乳酸菌菌株还会对蜜蜂机体造成损伤,据相关报道,在蜜蜂饲料中加入鼠李糖乳杆菌后,对蜜蜂的免疫系统产生破坏作用,提高了蜜蜂的死亡率[34]。因此,在将乳酸菌蜜蜂养殖中应用时要慎重选择菌种,本研究为将植物乳杆菌应用于蜜蜂养殖中提供了理论参考依据。然而,另有研究表明,在意大利蜜蜂(Apis mellifera)的糖饲料中添加高剂量的益生菌会降低其存活率[35],这说明益生菌的使用是具有剂量依赖性的,且本试验是在实验室条件下进行的,因此,本研究中植物乳杆菌对蜜蜂的有害剂量及在蜂群中的使用有待进一步验证。
乳酸菌目前已在动物养殖领域广泛应用,而乳酸菌作为饲料添加剂在蜜蜂饲料中应用仍蕴含着巨大的潜力。然而,更多研究关注来自蜜蜂自身的益生菌,虽然有报道称内源性益生菌要优于外源性益生菌,但是仍需要进一步研究验证,本研究结果补充了外源乳酸菌对蜜蜂的影响作用,为今后乳酸菌在蜜蜂营养领域的研究奠定了良好的基础,为乳酸菌在蜜蜂饲料中的利用提供了理论依据。
4 结论
饲喂乳酸菌可提高中华蜜蜂肠道消化酶活性,增强肠道免疫功能,提高工蜂存活率;饲喂抗生素可降低中华蜜蜂肠道消化酶活性,降低工蜂存活率。