Chinese Journal of Animal Nutrition >

2024 , Vol. 36 >Issue 1: 514 - 527

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.047

RESEARCH PAPER

Effects of Compound Supplementation of Clostridium butyricum and Glucose Oxidase on Growth Performance, Slaughter Performance, Immune and Antioxidant Functions and Cecal Microflora of Growing Meat Rabbits

  • DANG Wenqing ,
  • HE Min ,
  • SHANGGUAN Mingjun ,
  • ZHAN Haijie ,
  • CAO Liang ,
  • LI Jun ,
  • REN Keliang ,
  • ZHANG Yuanqing , *
Expand
  • College of Animal Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China
* professor, E-mail:

Received date: 2023-07-23

  Online published: 2024-01-12

Fold

Abstract

This experiment was conducted to investigate the effects of compound supplementation of Clostridium butyricum and glucose oxidase on growth performance, slaughter performance, immune and antioxidant functions and cecal microflora of growing meat rabbits. A total of 250 weaned Ila commercial meat rabbits with similar body weight of 35-day-old were randomly divided into 5 groups with 50 replicates per group and 1 rabbit per replicate. The rabbits in the control group were fed a basal diet, those in the antibiotic group were fed the basal diet supplemented with 75 mg/kg aureomycin and 20 mg/kg enramycin, and the others in the experimental groups were fed the basal diet supplemented with 300 g/t Clostridium butyricum (experimental group 1), 200 g/t Clostridium butyricum+200 g/t glucose oxidase (experimental group 2) and 300 g/t Clostridium butyricum+200 g/t glucose oxidase (experimental group 3), respectively. The pre-trial period lasted for 7 days and the experimental period lasted for 35 days. The results showed as follows: 1) compared with the control group, the average daily gain (ADG) of meat rabbits in experimental groups 2 and 3 was significantly increased (P<0.05), and the ratio of feed to gain (F/G) was significantly decreased (P<0.05), meanwhile there was no significant difference between these two groups and the antibiotic group (P>0.05); the mortality in experimental group 2 was significantly lower than that in the control group (P<0.05), and the diarrhea frequency and mortality were not significantly different from those in the antibiotic group (P>0.05). Thus, it could be seen that the experimental group 2 had the best effect on replacing antibiotics. 2) There were no significant differences in slaughtering performance and immune organ indices among all groups (P>0.05). 3) Compared with the control group, the serum proinflammatory cytokine interleukin-1β (IL-1β) content of meat rabbits in experimental group 2 had a decreasing trend (P=0.085), and the serum interleukin-6 (IL-6) content was significantly decreased (P<0.05). 4) Compared with the control group, the liver glutathione peroxidase (GSH-Px) activity of meat rabbits in experimental group 2 was significantly increased (P<0.05). 5) Compared with the control group, the richness and evolutionary diversity of cecal microorganisms of meat rabbits in experimental group 2 had an increased trend (0.05<P<0.10). 6) Compared with the control group, the number of specific amplicon sequence variation (ASV) of cecal microorganisms of meat rabbits in experimental group 2 was increased by 42.79%. The marker species of significant difference between the two groups might be ASV_19729 (P<0.05), which belonged to Clostridium in Firmicutes. In conclusion, the compound supplementation of 200 g/t Clostridium butyricum and 200 g/t glucose oxidase in the diet for meat rabbits can improve their growth performance and survival rate, reduce the inflammatory response, enhance the antioxidant capacity in liver, improve the microbial community structure in cecum, and have a good effect on replacing antibiotics.

Key words： Clostridium butyricum; glucose oxidase; meat rabbits; growth performance; immune; antioxidant; intestinal microorganisms

Cite this article

DANG Wenqing , HE Min , SHANGGUAN Mingjun , ZHAN Haijie , CAO Liang , LI Jun , REN Keliang , ZHANG Yuanqing . Effects of Compound Supplementation of Clostridium butyricum and Glucose Oxidase on Growth Performance, Slaughter Performance, Immune and Antioxidant Functions and Cecal Microflora of Growing Meat Rabbits[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2024 , 36(1) : 514 -527 . DOI: 10.12418/CJAN2024.047

幼龄畜禽的腹泻问题一直是制约畜牧业发展的重要因素,这也是饲料端禁抗后科研工作者一直研究绿色、安全、高效且具有功能性替抗添加剂的主要原因。仔兔断奶后常因许多生理和环境应激导致肠道病原体的流行和传播,这损害动物福利和影响生长性能,继而给兔场带来巨大经济损失。从20世纪90年代开始,丁酸梭菌就被广泛用来防治动物的腹泻、肠炎等疾病,我国于2013年将其纳入饲料添加剂品种目录。丁酸梭菌是从正常人和动物肠道分离出的一种厌氧革兰氏阳性芽孢杆菌,在肠道中具有很强的抗逆、耐热和耐酸性,可发酵碳水化合物产生丁酸、乙酸等短链脂肪酸作为能源物质,并具有多种生物学功能,如提高畜禽的生长性能,降低肠道内pH、抑制有害菌的增殖、促进有益菌的繁殖、保护肠黏膜屏障及改善肠道形态结构,增强动物机体免疫力,抑制炎症反应,提高畜禽抗氧化能力[1]。葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶,能专一性地将β-D-葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢,通过改善饲料品质、降低胃肠道pH促进机体营养物质的消化、抑制肠道有害菌和降低应激损伤,提高畜禽生长性能、减少腹泻、提高成活率和抗氧化能力等[2]。葡萄糖氧化酶于1999年就被纳入我国允许使用的饲料添加剂品种目录。研究表明,饲粮添加108 CFU/kg丁酸梭菌可显著提高断奶獭兔的平均日增重(ADG)[3]和饲料转化率[4];饲粮添加500 U/kg葡萄糖氧化酶使1~21日龄麻黄肉鸡ADG显著提高[5];饲粮添加400 U/kg葡萄糖氧化酶则可降低爱拔益加肉鸡料重比(F/G)[6]。目前,虽然已有这2种替抗添加剂分别在仔猪、鸡和反刍动物养殖中的相关报道,但未见有两者联合应用于肉兔生产中的报道。鉴于丁酸梭菌和葡萄糖氧化酶均具有酸化剂的特性,能提高免疫和抗氧化功能,本研究在饲粮中复合添加丁酸梭菌和葡萄糖氧化酶,通过探讨酶菌联合使用在肉兔生产中的替抗效果,以及采用16S DNA测序技术分析盲肠微生物区系,为家兔替抗添加剂的研究和应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

丁酸梭菌和葡萄糖氧化酶均购自山西某生物工程股份有限公司。其中,丁酸梭菌活菌数≥1×109 CFU/g,水分含量≤12%;葡萄糖氧化酶活性≥2 000 U/g,水分含量≤12%。金霉素购自驻马店华中正大有限公司,恩拉霉素购自浙江海正药业股份有限公司。试验兔为35日龄断奶伊拉肉兔。

1.2 试验设计和肉兔饲养管理

试验选取健康的35日龄断奶伊拉商品肉兔250只,按照体重和性别随机分为5组,每组50个重复,每个重复1只兔。对照组饲喂基础饲粮,抗生素组饲喂在基础饲粮中添加有效含量为75 mg/kg金霉素和20 mg/kg恩拉霉素的饲粮,试验组分别饲喂在基础饲粮中添加300 g/t丁酸梭菌(试验1组)、200 g/t丁酸梭菌+200 g/t葡萄糖氧化酶(试验2组)和300 g/t丁酸梭菌+200 g/t葡萄糖氧化酶(试验3组)的饲粮。预试期7 d,正试期35 d。
试验在山西省农业科学院畜牧兽医研究所肉兔试验场进行,试验兔每日饲喂2次,自由饮水,机械通风,兔群免疫按常规程序进行。

1.3 基础饲粮

对饲粮中的原料测定常规营养成分含量后,参考《肉兔营养需要量》(NY/T 4049—2021)标准配制基础饲粮,基础饲粮为直径约5 mm的颗粒饲料。采用FOSS 2500近红外扫描仪光谱检测各营养成分含量,基础饲粮组成及营养水平见表1。
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)%

原料Ingredients 含量Content 营养水平Nutrient levels2) 含量Content
玉米Corn 18.00 消化能DE/(MJ/kg) 10.59
麸皮Wheat bran 15.80 干物质DM 90.60
豆粕Soybean meal 12.00 粗蛋白质CP 15.50
棉籽粕Cottonseed meal 2.00 粗灰分Ash 6.36
菜籽粕Rapeseed meal 3.00 粗脂肪EE 2.80
酵母培养物Yeast culture 2.00 中性洗涤纤维NDF 36.68
玉米胚芽粕Corn germ meal 7.00 酸性洗涤纤维ADF 22.62
苜蓿颗粒Alfalfa pellets 5.00 酸性洗涤木质素ADL 5.24
葵花壳Sunflower shell 31.00 钙Ca 1.11
次粉Wheat middling 2.00 总磷TP 0.48
磷酸氢钙CaHPO4 0.60 赖氨酸Lys 0.87
氯化钠NaCl 0.50 蛋氨酸+半胱氨酸Met+Cys 0.59
预混料Premix1) 1.10
合计Total 100.00

1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of the diet:VA 6 000 IU,VD3 950 IU,VE 40 mg,赖氨酸 Lys 2.0 g,蛋氨酸 Met 1.0 g,Cu (as copper sulfate) 10 mg,Fe (as ferrous sulfate) 50 mg,Mn (as manganese sulfate) 8.0 mg,Zn (as zinc sulfate) 50 mg。

2)消化能为计算值,其余为实测值;消化能为家兔对各原料的消化能估值之和,各原料的消化能参考已有数据和公式计算得出,计算公式为消化能=0.013×粗蛋白质+0.036×粗脂肪+0.017×非纤维碳水化合物+0.006×中性洗涤纤维[7]。DE was a calculated value, while the others were measured values; DE was the sum of the estimated digestible energy of all raw materials for rabbits, and DE of all raw materials was calculated by referring to existing data and formulas, and the calculation formula was DE=0.013×CP+0.036×EE+0.017×NFC+0.006×NDF[7].

1.4 测定指标及方法

1.4.1 生长性能和健康状况

于试验开始时和结束后对所有试验兔进行空腹称重,记录初始体重(IBW)和终末体重(FBW),计算ADG。同时,在试验期记录每只试验兔的饲粮采食量,用于计算平均日采食量(ADFI)和F/G;每日记录兔群的腹泻和死亡情况,计算腹泻频率和死亡率,计算公式为:

腹泻频率(%)=100×∑(腹泻兔只数×腹泻天数)/(试验兔只数×试验天数);

死亡率(%)=100×死亡兔只数/试验兔只数。

1.4.2 屠宰性能和免疫器官指数

正试期结束后,每组各选取8只与该组平均体重相近的肉兔进行屠宰,并记录宰前活体重。采用颈静脉放血处死,经剥皮,去除前肢、后肢、头、气管、食管,移走肠道及内容物和泌尿生殖器官后,保留心脏、肝脏和肾脏及肾周脂肪进行称重,所得即半净膛胴体重。半净膛胴体去心脏、肾脏及肾周脂肪后称重为全净膛胴体重。屠宰性能指标计算公式如下:

半净膛率(%)=100×半净膛胴体重/宰前活体重;

全净膛率(%)=100×全净膛胴体重/宰前活体重。

此外,将每只屠宰的试验兔去除胸腺、脾脏及圆小囊的包围物后称重,计算胸腺指数、脾脏指数及圆小囊指数等免疫器官指数,计算公式为:

免疫器官指数(g/kg)=免疫器官重量/宰前活体重。

1.4.3 血清免疫指标

采集对照组和试验2组各8只试验兔血液各5 mL,静置30 min后,3 000 r/min离心15 min,收集血清于EP管中在-20 ℃下保存,用于测定血清免疫指标,包括血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、免疫球蛋白G(IgG)、白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-6(IL-6)含量。血清免疫指标均采用微板板法并使用上海酶联生物科技有限公司的试剂盒进行测定,其标准品线性回归与预期指标的决定系数(R2)≥0.99。

1.4.4 肝脏抗氧化指标

采集对照组和试验2组各8只试验兔各2 g左右肝脏组织放入冻存管后,立即放入液氮冷冻30 min,然后放入-80 ℃超低温冰箱保存,用于测定肝脏超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、总抗氧化力(T-AOC)以及丙二醛(MDA)含量这4种抗氧化指标。具体测定方法为:准确称取肝脏组织重量,按照重量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例加入9倍体积的生理盐水或者磷酸盐缓冲液(PBS),剪碎组织,冰水浴条件下制备匀浆,2 500~3 000 r/min离心10 min,取上清液即10%匀浆上清液进行肝脏SOD和GSH-Px活性以及MDA含量的测定;测定T-AOC的组织样本处理方式则按照重量(g)∶体积(mL)=1∶4的比例加入4倍体积的生理盐水或者PBS,冰水浴条件下机械匀浆,然后在4 ℃下以12 000 r/min离心5 min,取上清液进行测定。抗氧化指标均采用微孔板法并使用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定,且T-AOC的标准品线性回归与预期指标的R2≥0.99。

1.4.5 盲肠微生物区系

试验兔屠宰时,采集对照组和试验2组各8只试验兔盲肠内容物放入冻存管后,立即放入液氮冷冻30 min,然后放入-80 ℃超低温冰箱保存,用于盲肠微生物16S DNA测序。先采用Illumina Miseq平台对采集的盲肠微生物DNA片段16S rRNA的V3~V4区域进行高通量测序,再对所得原始测序序列进行去引物、质量过滤、去噪、拼接和去嵌合体等步骤,得到优化序列后去重产生扩增子序列变异(ASV),利用上海派森诺基因云平台进行物种多样性和菌群组成分析,差异物种采用MetagenomeSeq方法对样本进行两两比较后筛选得到,标志物采用随机森林(Random Forests)算法进行筛选。

1.5 数据统计分析

生长性能和屠宰性能试验数据使用SPSS 24.0软件进行单因素方差分析后,采用Duncan氏法进行多重比较;腹泻频率和死亡率数据采用卡方检验;血清免疫指标、抗氧化功能和盲肠微生物区系数据采用独立t检验,数据结果采用“平均值±标准误”表示(腹泻频率和死亡率除外),以P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著,0.05<P<0.10表示差异有显著趋势。

2 结果与分析

2.1 饲粮复合添加丁酸梭菌和葡萄糖氧化酶对生长肉兔生长性能和健康状况的影响

由表2可知,与对照组相比,试验2组和试验3组肉兔ADG显著提高(P<0.05),F/G显著降低(P<0.05),且这2个组与抗生素组相比均无显著差异(P>0.05);试验2组死亡率显著低于对照组(P<0.05),腹泻频率和死亡率与抗生素组无显著差异(P>0.05);试验2组和试验3组之间肉兔生长性能和健康状况无显著差异(P>0.05)。综合考虑饲粮成本和死亡情况,本研究中试验2组的替抗效果较好。
表2 饲粮复合添加丁酸梭菌和葡萄糖氧化酶对生长肉兔生长性能和健康状况的影响

Table 2 Effects of compound supplementation of Clostridium butyricum and glucose oxidase on growth performance and health status of growing meat rabbits

项目
Items		 对照组
Control
group		 抗生素组
Antibiotic
group		 试验1组
Experimental
group 1		 试验2组
Experimental
group 2		 试验3组
Experimental
group 3		 P值
P-value
初始体重IBW/g 1 157.22±15.75 1 158.06±15.85 1 157.36±14.35 1 150.28±14.66 1 156.25±17.19 0.986
终末体重FBW/g 2 210.19±34.16 2 362.73±37.17 2 248.97±32.14 2 319.40±30.15 2 349.42±26.98 0.117
平均日增重ADG/g 29.85±1.56c 35.58±0.68a 31.06±0.85bc 34.44±1.03a 33.07±0.75ab 0.017
平均日采食量ADFI/g 114.94±2.28 122.37±3.17 114.22±1.27 118.57±2.09 115.86±1.64 0.361
料重比F/G 3.86±0.13a 3.44±0.09b 3.78±0.15a 3.51±0.10b 3.53±0.07b 0.030
腹泻频率
Diarrhea frequency/%		 6.37 3.31 4.37 3.57 6.03 0.860
死亡率Mortality/% 20.21Aa 4.08Bc 19.35Aa 6.25ABbc 15.63ABab 0.001

同行数据肩标无字母或相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。表3~表7同。

In the same row, values with no letter or the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as Table 3 to Table 7.

2.2 饲粮复合添加丁酸梭菌和葡萄糖氧化酶对生长肉兔屠宰性能和免疫器官指数的影响

由表3可知,与对照组和抗生素组相比,试验组肉兔半净膛率、全净膛率和各免疫器官指数均无显著差异(P>0.05);各试验组间屠宰性能和免疫器官指数也均无显著差异(P>0.05),但试验2组各指标的值较高。
表3 饲粮复合添加丁酸梭菌和葡萄糖氧化酶对生长肉兔屠宰性能和免疫器官指数的影响

Table 3 Effects of compound supplementation of Clostridium butyricum and glucose oxidase on slaughter performance and immune organ indices of growing meat rabbits

项目
Items		 对照组
Control
group		 抗生素组
Antibiotic
group		 试验1组
Experimental
group 1		 试验2组
Experimental
group 2		 试验3组
Experimental
group 3		 P值
P-value
全净膛率
Semi-eviscerated rate/%		 47.45±0.89 49.08±0.50 47.67±1.08 48.96±0.64 48.70±0.56 0.472
半净膛率
Eviscerated rate/%		 50.82±0.89 52.38±0.43 51.76±0.81 52.56±0.58 52.21±0.56 0.443
脾脏指数
Spleen index/(g/kg)		 0.58±0.06 0.72±0.10 0.62±0.08 0.71±0.08 0.62±0.04 0.589
胸腺指数
Thymus index/(g/kg)		 1.79±0.14 2.36±0.20 1.83±0.25 2.27±0.28 1.90±0.29 0.511
圆小囊指数
Sacculus index/(g/kg)		 0.74±0.04 0.92±0.04 0.80±0.06 0.90±0.05 0.84±0.06 0.216

2.3 饲粮复合添加丁酸梭菌和葡萄糖氧化酶对生长肉兔血清免疫指标的影响

由表4可知,与对照组相比,试验2组肉兔血清促炎细胞因子IL-1β含量有降低趋势(P=0.085),血清IL-6含量显著降低(P<0.05),这说明饲粮添加200 g/t丁酸梭菌+200 g/t葡萄糖氧化酶(试验2组)抑制了机体炎症反应的发生;此外,试验2组血清免疫球蛋白IgG和抗炎因子IL-4含量与对照组相比无显著差异(P>0.05)。
表4 饲粮复合添加丁酸梭菌和葡萄糖氧化酶对生长肉兔血清免疫指标的影响

Table 4 Effects of compound supplementation of Clostridium butyricum and glucose oxidase on serum immune indices of growing meat rabbits

项目
Items		 对照组
Control group		 试验2组
Experimental group 2		 P值
P-value
肿瘤坏死因子-α TNF-α/(pg/mL) 148.09±2.67 148.29±2.66 0.960
白细胞介素-1β IL-1β/(pg/mL) 825.69±13.34 785.27±18.40 0.085
白细胞介素-6 IL-6/(pg/mL) 59.15±1.02a 55.81±1.15b 0.040
免疫球蛋白G IgG/(mg/mL) 10.38±0.12 10.39±0.19 0.960
白细胞介素-4 IL-4/(pg/mL) 27.66±0.66 28.93±0.88 0.257

2.4 饲粮复合添加丁酸梭菌和葡萄糖氧化酶对生长肉兔肝脏抗氧化指标的影响

由表5可知,与对照组相比,试验2组肉兔肝脏GSH-Px活性显著提高(P<0.05),肝脏SOD活性和T-AOC有所提高,但差异不显著(P>0.05),肝脏MDA含量无显著差异(P>0.05)。这说明饲粮添加200 g/t丁酸梭菌+200 g/t葡萄糖氧化酶显著促进了肝脏中谷胱甘肽(GSH)参与的脂质过氧化反应。
表5 饲粮复合添加丁酸梭菌和葡萄糖氧化酶对生长肉兔肝脏抗氧化指标的影响

Table 5 Effects of compound supplementation of Clostridium butyricum and glucose oxidase on liver antioxidant indices of growing meat rabbits

项目
Items		 对照组
Control group		 试验2组
Experimental group 2		 P值
P-value
超氧化物歧化酶SOD/(U/mg prot) 136.10±3.88 149.89±7.00 0.107
丙二醛MDA/(nmol/mg prot) 0.48±0.05 0.48±0.06 0.994
谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px/(U/mg prot) 125.34±5.48b 158.27±12.36a 0.036
总抗氧化能力T-AOC/(nmol/mg prot) 0.155±0.005 0.159±0.005 0.613

2.5 饲粮复合添加丁酸梭菌和葡萄糖氧化酶对生长肉兔盲肠微生物区系的影响

2.5.1 生长肉兔盲肠微生物在门和属水平上菌群组成分析

由表6可知,对照组和试验2组肉兔盲肠微生物在各个菌门上的相对丰度均无显著差异(P>0.05)。作为优势菌群,试验2组盲肠厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度高于对照组,盲肠拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度则低于对照组。
表6 生长肉兔盲肠微生物在门水平上菌群组成(前10)

Table 6 Microflora composition of cecal microorganisms at phylum level of growing meat rabbits (top 10) %

项目
Items		 对照组
Control group		 试验2组
Experimental group 2		 P值
P-value
厚壁菌门Firmicutes 70.33±1.46 71.61±3.54 0.744
拟杆菌门Bacteroidetes 13.80±2.45 8.80±1.40 0.106
变形菌门Proteobacteria 1.16±0.24 1.76±0.69 0.433
软壁菌门Tenericutes 2.48±0.62 1.62±0.19 0.211
疣微菌门Verrucomicrobia 1.00±0.20 1.60±0.47 0.286
放线菌门Actinobacteria 0.39±0.07 0.66±0.12 0.086
TM7 0.38±0.09 0.29±0.08 0.510
互养菌门Synergistetes 0.16±0.11 0.09±0.03 0.534
蓝藻菌门Cyanobacteria 0.08±0.01 0.05±0.02 0.267
梭杆菌门Fusobacteria 0.004±0.001 0.005±0.001 0.679
其他Others 10.20±0.92 13.51±2.27 0.207
由表7可知,对照组和试验2组肉兔盲肠微生物在各个菌属上的相对丰度均无显著差异(P>0.05)。在相对丰度大于1%的菌属中,瘤胃球菌属(Ruminococcus)和颤螺菌属(Oscillospira)均为肉兔盲肠的优势菌属,且试验2组盲肠这2种菌属的相对丰度均略低于对照组。
表7 生长肉兔盲肠微生物在属水平上菌群组成(前10)

Table 7 Microflora composition of cecal microorganisms at genus level of growing meat rabbits (top 10) %

项目
Items		 对照组
Control group		 试验2组
Experimental group 2		 P值
P-value
瘤胃球菌属Ruminococcus 6.04±0.52 6.00±0.72 0.961
颤螺菌属Oscillospira 4.72±0.55 4.62±0.43 0.891
粪球菌属Coprococcus 1.42±0.32 1.27±0.11 0.648
阿克曼氏菌属Akkermansia 1.00±0.20 1.60±0.47 0.274
梭菌科的梭菌属Clostridiaceae_Clostridium 0.85±0.09 0.75±0.16 0.610
拟杆菌属Bacteroides 0.41±0.18 1.19±0.50 0.174
罕见小球菌属Subdoligranulum 0.43±0.07 0.56±0.13 0.416
志贺氏菌属Shigella 0.29±0.17 0.78±0.69 0.512
毛螺菌科的梭菌属Lachnospiraceae_Clostridium 0.31±0.09 0.27±0.04 0.757
布劳特氏菌属Blautia 0.22±0.03 0.21±0.03 0.856
其他Others 84.31±1.32 82.75±1.26 0.414

2.5.2 生长肉兔盲肠微生物多样性分析

如图1所示,各个样本随着测序深度的加大,曲线越来越平缓,表明测序结果已足够反映当前样本所包含的多样性,继续增加测序深度已无法检测到大量的尚未发现的新的ASV。
图1 生长肉兔盲肠微生物稀疏曲线

T0表示对照组样本,T2表示试验2组样本。

Fig.1 Sparse curves of cecal microorganisms of growing meat rabbits

T0 represented samples in the control group, and T2 represented samples in experimental group 2.

由表8可知,各个样本的测序深度(Goods覆盖度)均达到了99.1%以上。对照组和试验2组肉兔盲肠微生物alpha多样性各指数间虽无显著差异(P>0.05),但与对照组相比,试验2组Chao1指数和观测到的物种数(Observed_species)均有提高趋势(0.05<P<0.10),表明试验2组盲肠微生物群落的丰富度有提高趋势;试验2组Shannon指数和Simpson指数均有所提高,表明试验2组盲肠微生物群落的多样性有所提高;试验2组Faith_pd指数有提高趋势(P=0.055),表明试验2组盲肠微生物群落的进化多样性有提高趋势;试验2组Pielou_e指数有所提高,表明试验2组盲肠微生物群落的均匀度有所提高。综合来看,与对照组相比,试验2组肉兔盲肠微生物群落丰富度和进化多样性有提高的趋势。
表8 生长肉兔盲肠微生物alpha多样性

Table 8 Alpha diversity of cecal microorganisms of growing meat rabbits

项目
Items		 Chao1
指数
Chao1 index		 Faith_pd
指数
Faith_pd
index		 Goods覆盖度
Goods_
coverage		 观测到的
物种数
Observed_
species/个		 Pielou_e
指数
Pielou_e
index		 Shannon
指数
Shannon
index		 Simpson
指数
Simpson
index
对照组
Control group		 1 668.36
±151.27		 101.53
±5.90		 0.994
±0.001		 1 499.62
±118.19		 0.79
±0.02		 8.35
±0.15		 0.988
±0.003
试验2组
Experimental group 2		 2 104.09
±138.34		 119.97
±4.53		 0.991
±0.001		 1 817.00
±102.49		 0.80
±0.01		 8.63
±0.12		 0.991
±0.002
P值P-value 0.059 0.055 0.055 0.070 0.834 0.185 0.397

2.5.3 生长肉兔盲肠微生物差异性分析

如图2所示,正交偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)图中2点在坐标轴上的投影距离越近,表明这2个样本间的物种丰度组成在相应维度上越相似。试验2组和对照组样本间有重叠区域,对照组样本在第1主成分(PC1)上投影的点大部分都落到了试验2组样本在PC1上的投影区域,第2主成分(PC2)方向上结果同样类似。因此,2组样本的物种具有一定相似性。但由表9可知,各组间进行Adonis检验来分析组间样本分布差异的显著性,得到P=0.066,说明2组间样本差异有显著的趋势。
图2 生长肉兔盲肠微生物OPLS-DA图

Fig.2 OPLS-DA diagram of cecal microorganisms of growing meat rabbits

表9 生长肉兔盲肠微生物Adonis检验

Table 9 Adonis test of cecal microorganisms of growing meat rabbits

项目
Item		 样本大小
Sample size/个		 置换次数
Permutations/次		 伪F值
Pseudo-F value		 P值
P-value		 q值
q-value
对照组vs.试验2组
Control group vs. experimental group 2		 12 999 1.121 884 0.066 0.066

2.5.4 生长肉兔盲肠微生物差异物种与差异标志物筛选

如图3所示,对照组和试验2组肉兔盲肠微生物检测到ASV数共有2 250个,其中对照组和试验2组分别特有3 900和5 569个ASV,试验2组特有ASV数比对照组提高了42.79%。
图3 生长肉兔盲肠微生物ASV数量

Fig.3 ASV number of cecal microorganisms of growing meat rabbits

以试验2组作为参照,使用MetagenomeSeq方法对2组肉兔盲肠微生物样本进行比较,筛选组间具有显著差异(P<0.05)的ASV,再尝试找出这些差异ASV在不同分类水平上是否具有富集的趋势。由表10可知,共筛选出9个组间具有显著差异的ASV,其中5个属于厚壁菌门的梭菌属,2个属于厚壁菌门的毛螺菌属,1个属于厚壁菌门瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)的罕见小球菌属(Subdoligranulum),1个属于未鉴别细菌(unidentified_Bacteria)。
表10 MetagenomeSeq方法筛选的具有组间显著差异的ASV

Table 10 ASV with significant difference between control group and experimental group 2 screened by MetagnomeSeq method

ASV编号
ASV No.		 log10
差异倍数
log10FC		 P值
P-value		 校正P值
Adjusted
P-value		 门
Phylum		 科
Family		 属
Genus
ASV_7147 2.467 2.22×10-6 0.003 981 Firmicutes Unclassified_
Clostridiales		 Unclassified_
Clostridiales
ASV_51101 3.773 1.70×10-7 0.000 723 Firmicutes Unidentified_
Clostridiales		 Unidentified_
Clostridiales
ASV_39996 2.671 7.26×10-7 0.001 851 Firmicutes Lachnospiraceae Unclassified_
Lachnospiraceae
ASV_43340 2.879 1.24×10-5 0.013 120 Firmicutes Unclassified_
Clostridiales		 Unclassified_
Clostridiales
ASV_19729 2.893 4.97×10-14 6.34×10-10 Firmicutes Unidentified_
Clostridiales		 Unidentified_
Clostridiales
ASV_16549 1.638 2.70×10-8 0.000 172 Firmicutes Lachnospiraceae Unidentified_
Lachnospiraceae
ASV_37317 1.236 2.39×10-6 0.003 981 Unidentified_
Bacteria		 Unidentified_
Bacteria		 Unidentified_
Bacteria
ASV_16904 1.830 3.84×10-7 0.001 224 Firmicutes Unidentified_
Clostridiales		 Unidentified_
Clostridiales
ASV_59990 1.699 2.81×10-6 0.003 981 Firmicutes Ruminococcaceae Subdoligranulum

Firmicutes:厚壁菌门;Unidentified_Bacteria:未鉴别细菌;Unclassified_Clostridiales:未分类梭菌目;Unidentified_Clostridiales:未鉴别梭菌目;Lachnospiraceae:毛螺菌科;Ruminococcaceae:瘤胃球菌科;Unclassified_Lachnospiraceae:未分类毛螺菌科;Subdoligranulum:罕见小球菌属。

使用随机森林算法进行标志物种的筛选时,按照物种对分类器模型重要性的大小进行排序得到前10的标志ASV,如图4所示。与MetagenomeSeq方法分析相比较后,发现ASV_19729可能是对照组与试验2组间的标志物种,且属于厚壁菌门的梭菌属。
图4 随机森林算法筛选的具有显著差异前10的标志ASV

Fig.4 Top 10 marker ASV with significant differences screened by random forest algorithm

3 讨论

3.1 饲粮复合添加丁酸梭菌和葡萄糖氧化酶对生长肉兔生长性能和健康状况的影响

生长性能是评价畜禽生长好坏的重要指标。研究表明,饲粮添加3×108 CFU/kg丁酸梭菌可显著提高高邮鸭60日龄体重和饲料转化率[8];饲粮添加500 U/kg葡萄糖氧化酶使1~21日龄麻黄肉鸡的ADG显著提高[5],饲粮添加400 U/kg葡萄糖氧化酶还可降低爱拔益加肉鸡F/G[6]。在家兔生产中,饲粮添加108 CFU/kg丁酸梭菌可显著提高断奶獭兔ADG[3]和67日龄伊拉肉兔饲料转化率[4]。本研究中,试验1组在肉兔饲粮中单独添加了3×108 CFU/kg丁酸梭菌并未使其生长性能发生显著变化,这同饲粮中添加4×109 CFU/kg丁酸梭菌未显著影响80日龄新西兰白兔生长性能的研究结果[9]相同。在预防腹泻和降低死亡率方面,饲粮添加108 CFU/kg丁酸梭菌有降低肉兔腹泻率和提高肉兔成活率的趋势[10],饲粮添加15~60 U/kg葡萄糖氧化酶能使肉兔腹泻频率随着添加水平的提高而呈现降低的趋势[11],饲粮单独添加4×109 CFU/kg丁酸梭菌或与丝兰提取物复合添加时对肉兔腹泻频率无显著影响[9]。本研究中,与对照组相比,试验组肉兔腹泻频率也未发生显著变化,这与以上研究结果一致。丁酸梭菌和葡萄糖氧化酶复合添加对畜禽生长性能的影响未见报道,但有0.1%葡萄糖氧化酶与1.5×105 CFU乳酸菌复合添加可显著提高肉鸡在1~21日龄的ADG,显著降低F/G,且其效果显著优于单独添加[12];150 U/kg葡萄糖氧化酶与2.5×108 CFU/kg粪肠球菌存在协同作用,使肉鸡生长性能最接近抗生素组水平[13]。本研究中,试验2组和试验3组肉兔饲粮中将200 g/t葡萄糖氧化酶(400 U/kg)与200 g/t丁酸梭菌(2×108 CFU/kg)或300 g/t丁酸梭菌(3×108 CFU/kg)复合添加后显著提高了肉兔的ADG,降低了F/G,使生长性能得到改善,且比单独添加丁酸梭菌的效果要好。此外,试验3组肉兔的生长性能和健康情况与试验2组和抗生素组无显著差异,但死亡率有所提高,这可能与丁酸梭菌添加水平增加有关,因为丁酸梭菌添加水平过高会导致其在肠道内大量繁殖,易引起肠道菌群混乱[14],本研究中试验3组的肉兔死亡时盲肠内容物多呈水样,亦与之相符。

3.2 饲粮复合添加丁酸梭菌和葡萄糖氧化酶对生长肉兔屠宰性能的影响

研究表明,饲粮添加108 CFU/kg丁酸梭菌对肉兔屠宰性能和内脏器官发育指标均无显著影响[10]。饲粮添加15~60 U/kg葡萄糖氧化酶提高了獭兔在75日龄时的屠宰体重,屠宰率虽均达到50%以上,但组间无显著差异[11]。饲粮添加500 U/kg葡萄糖氧化酶使63日龄麻黄肉鸡的屠宰性能有所升高[5]。本研究中,试验组肉兔的屠宰性能虽与对照组无显著差异,但其值有所升高且屠宰率在51.76%,这与各组肉兔末体重间无显著差异相符,也与上述文献报道相一致。此外,在白羽肉鸡饲粮中分别添加200 g/t丁酸梭菌或200 g/t葡萄糖氧化酶其免疫器官指数无显著差异[15],本研究中各组肉兔的免疫器官指数无显著差异与之相符。但也有报道认为,饲粮添加1×108 CFU/kg丁酸梭菌能显著提高断奶獭兔圆小囊和蚓突指数[16],可能与试验仔獭兔平均体重比本研究肉兔较小以及该试验期只有28 d较短有关,具体原因还有待进一步分析。

3.3 饲粮复合添加丁酸梭菌和葡萄糖氧化酶对生长肉兔血清免疫指标的影响

血清免疫细胞因子和免疫球蛋白在机体的免疫调节中起重要作用,免疫细胞因子对免疫细胞间的相互作用、细胞的增殖分化和效应功能有重要的调节作用,免疫球蛋白是用来衡量动物体液免疫状态的关键参数。IL-1β、IL-6和TNF-α作为促炎反应中的关键细胞因子,对机体清除病原体具有重要作用。研究表明,葡萄糖氧化酶可显著降低大肠杆菌攻毒肉鸭14和28日龄空肠IL-1β、IL-6含量以及28日龄空肠TNF-α含量[17]。丁酸梭菌能够显著降低断奶仔猪血清促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量[18],也能够显著降低肉兔回肠黏膜中TNF-α含量[10]。本研究中,与对照组相比,试验2组肉兔血清中促炎细胞因子IL-6含量显著降低,血清IL-1β含量具有降低的趋势,这说明2种添加剂对肉兔的炎症反应有抑制作用。此外,IL-4是由有活性的T细胞分泌的抗炎细胞因子,在机体内具有促进巨噬细胞、B细胞递呈抗原和杀伤肿瘤细胞的能力,从而增进免疫系统对抗原的应答反应[19];而IgG是由脾脏和淋巴结中的浆细胞合成和分泌的血清中含量最高的免疫球蛋白,约占免疫球蛋白总量的75%,是抗细菌、抗病毒和抗感染过程中抗体的主要组成部分。本研究中,与对照组相比,试验2组肉兔血清中IL-4和IgG含量均有所升高,说明该组对提高机体免疫力有一定效果,这可能与血清IL-1β含量显著降低有关,因为IL-1β能有益地刺激包括IL-4和白细胞介素-10(IL-10)在内的抗炎细胞因子的表达,从而加强肠道屏障的完整性[20]。

3.4 饲粮复合添加丁酸梭菌和葡萄糖氧化酶对生长肉兔肝脏抗氧化指标的影响

丁酸梭菌可提高畜禽抗氧化能力,通过相关抗氧化信号通路调节抗氧化酶的基因表达或活性及清除自由基而发挥抗氧化作用,并通过抑制致病菌的生长而降低炎症的发生以及缓解其引起的氧化应激。丁酸梭菌和葡萄糖氧化酶在机体内发酵碳水化合物产生的丁酸和氢气等代谢产物,具有缓解机体氧化应激和清除自由基的作用[21]。研究表明,饲粮添加2×108 CFU/kg丁酸梭菌对断奶仔猪血清和肝脏中MDA含量、GSH-Px和SOD活性以及T-AOC均无显著影响[22];饲粮添加2.5×108 CFU/kg丁酸梭菌对21日龄樱桃谷肉鸭肝脏中MDA含量和T-AOC无显著影响[23];饲粮添加500 U/kg葡萄糖氧化酶可显著降低麻黄肉鸡血清MDA含量,饲粮添加1 000 U/kg葡萄糖氧化酶可显著提高血清SOD活性[5];饲粮复合添加150 U/kg葡萄糖氧化酶和2.5×108 CFU/kg粪肠球菌可显著提高肉鸡血清GSH-Px活性[13];饲粮添加100 U/kg葡萄糖氧化酶使仔猪血清GSH-Px和SOD活性及T-AOC均有提高,但差异不显著[19];而饲粮添加500 U/kg葡萄糖氧化酶可使断奶仔猪血清GSH-Px活性显著升高[24];饲粮添加0.2%和0.4%葡萄糖氧化酶能够显著提高冬季幼兔血清GSH-Px活性[25]。由此可知,畜禽饲粮中单独添加葡萄糖氧化酶或丁酸梭菌时可提高机体的抗氧化能力。本研究中,与对照组相比,试验2组肉兔肝脏中MDA含量、T-AOC和SOD活性均无显著变化,但肝脏GSH-Px活性显著提高,这与文献报道结果相符,原因除以上外,还可能与葡萄糖氧化酶分解产生的过氧化氢增多后导致该酶活性显著增强有关。

3.5 饲粮复合添加丁酸梭菌和葡萄糖氧化酶对生长肉兔盲肠微生物区系的影响

丁酸梭菌和葡萄糖氧化酶均能通过促进肠道中有益菌繁殖、抑制有害菌增殖来调节肠道菌群而促进肠道健康[8,17,22]。饲粮添加1.5×105 CFU/kg丁酸梭菌可增加肉鸡肠道内容物中微生物种类及有益菌属数量,提高物种丰度,促进肠道功能发挥[26];采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)方法研究獭兔盲肠道微生物表明,饲粮添加2×108 CFU/kg丁酸梭菌对其Shannon指数、丰富度及均匀度均无显著影响[16]。饲粮添加200 U/kg葡萄糖氧化酶对大肠杆菌攻毒肉鸭回肠菌群alpha多样性指数无显著影响,但使其特有操作分类单元(OTU)数目增加,并降低了拟杆菌门的相对丰度,提高了链球菌属作为优势菌的相对丰度[17];饲粮添加300 U/kg葡萄糖氧化酶对蛋鸡盲肠微生物OTU数目以及多样性指数也无显著影响,且以厚壁菌门、拟杆菌门和显著增加的拟杆菌属、未分类的拟杆菌目为优势菌[27];类似地,50 U/kg葡萄糖氧化酶和1.5×108 CFU/kg乳酸菌制剂使42 d肉鸡盲肠微生物丰度和多样性均有所增加,但与对照组差异不显著;盲肠微生物以厚壁菌门和乳酸杆菌属、梭菌属为主;且改善肠道菌群结构以二者联合使用效果更优[28]。本研究中,与对照组相比,试验2组肉兔盲肠中微生物群落丰富度和进化多样性有提高的趋势,特有ASV数提高了42.79%,这与文献报道的结果相符;但盲肠微生物中作为优势菌的厚壁菌门和瘤胃球菌属的相对丰度变化不大,这与文献有一定差异,可能与物种及各物种肠道菌群存在特异性有关。研究表明,丁酸梭菌在肠道内可内生芽孢,从而提高梭菌属、瘤胃球菌属和乳杆菌属的相对丰度[29]。兔盲肠中的厚壁菌门含有多种纤维素分解细菌;瘤胃球菌属在分解前肠未被消化的纤维和丁酸的生产中有着重要作用[30],这对碳水化合物代谢非常重要。本研究中,试验2组饲粮中添加了丁酸梭菌,其代谢产物有丁酸,所以瘤胃菌是该组的优势菌;该组梭菌属相对丰度虽与对照组无显著差异,但ASV_19729对应的梭菌属的相对丰度显著提高,具体原因还需进一步进行验证。

4 结论

饲粮复合添加200 g/t丁酸梭菌和200 g/t葡萄糖氧化酶可通过降低机体炎症反应、提高肝脏抗氧化能力和改善盲肠微生物群落结构来提高断奶伊拉肉兔生长性能和成活率,其替代抗生素效果较好。

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DOI

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