随着养殖业规模化与集约化的发展,高精料饲喂已成为提高饲养肉牛生长性能的主要手段,但同时也会引发肉牛瘤胃酸中毒。莫能菌素是一种能够改变瘤胃发酵模式、预防瘤胃酸中毒的有效抗生素类饲料添加剂,但随着饲料行业2020年施行禁抗以来,莫能菌素等抗生素在饲料中的使用受到极大限制。因此,寻找安全、绿色、无残留的抗生素替代品成为畜牧行业研究与应用的热点。
抗菌肽是一类结构复杂、分子质量2~7 ku、含有20~60个氨基酸的多肽,目前发现的抗菌肽有7 000多种[1]。动物源抗菌肽因其来源于动物基因组,因此具有良好的生物安全性,适宜于作为饲料添加剂。研究表明,抗菌肽的抗菌机制是由带正电荷的抗菌肽与带负电荷的细菌相互结合,利用自身的α-螺旋结构插入细菌细胞膜,进而使得细菌细胞内容物流出;因此,动物源性抗菌肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有杀灭作用[2]。同时,关于抗菌肽调控瘤胃发酵模式的研究中发现,部分抗菌肽具有提高瘤胃丙酸含量、降低酸中毒风险的作用[3-4]。不同的抗菌肽具有不同的抗菌活性,从而会影响抗菌肽的瘤胃发酵调控功能,因此筛选适宜于瘤胃发酵调控的抗菌肽是替代莫能菌素等抗生素的关键。莫能菌素等离子载体类抗生素主要对瘤胃内革兰氏阳性菌起抑制作用,进而抑制乙酸和丁酸的生成,提高瘤胃丙酸含量[5]。因此,选用对革兰氏阳性菌有较强抑制作用的抗菌肽才可发挥替代莫能菌素的作用。
本研究选用一种对瘤胃细菌有抑制作用的动物源性抗菌肽,添加到饲喂高精料的荷斯坦奶公牛饲粮中,探究不同添加量的动物源性抗菌肽对荷斯坦奶公牛生长性能、瘤胃发酵指标、粪便评分、血清生化和免疫指标的影响,以期为动物源性抗菌肽替代莫能菌素发挥瘤胃发酵调控作用、确定动物源性抗菌肽在荷斯坦奶公牛饲粮中的适宜添加量提供数据支撑。
1 材料与方法
1.1 试验地点及材料
试验地点位于南宁市广西沃坤养殖有限公司江南区基地,所用试验动物及粗、精饲料均由广西沃坤养殖有限公司提供。动物源性抗菌肽由广东某公司提供,该产品来源于健康猪肠道上皮细胞,克隆于地衣芽孢杆菌中进行表达产生,核心成分为一种具有α-螺旋结构并参与肠黏膜天然免疫的生物活性物质。
1.2 试验设计和饲养管理
试验采用单因素试验设计,选择24头体型相近、体重为(255.35±22.43) kg的荷斯坦奶公牛,随机分为3组,每组8个重复,每个重复1头牛。对照组饲喂基础饲粮,试验组分别在基础饲粮的基础上添加500(A组)和800 g/t(B组)的动物源性抗菌肽。试验期65 d,其中预试期5 d,正试期60 d。参考《肉牛饲养标准》(NY/T 815—2004)配制基础饲粮,基础饲粮组成及营养水平见表1。试验牛每头单栏饲养,组间进行间隔,早、晚(08:00、16:00)各饲喂1次,全天自由饮水。
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)% |
| 原料 Ingredients | 含量 Content | 营养水平 Nutrient levels2) | 含量 Content | |
|---|---|---|---|---|
| 青贮玉米秸秆 Silage corn straw | 50.00 | 粗蛋白质 CP | 15.34 | |
| 玉米 Corn | 10.00 | 粗脂肪 EE | 10.38 | |
| 木薯粉 Tapioca flour | 15.00 | 粗灰分 Ash | 24.28 | |
| 玉米皮 Corn bran | 10.00 | 中性洗涤纤维 NDF | 42.37 | |
| 豆粕 Soybean meal | 8.00 | 酸性洗涤纤维 ADF | 23.34 | |
| 白酒糟 Distiller’s grains | 5.00 | 总能 GE/(MJ/kg) | 17.15 | |
| 食盐 NaCl | 0.15 | 钙 Ca | 0.63 | |
| 小苏打 NaHCO3 | 0.10 | 磷 P | 0.58 | |
| 预混料 Premix1) | 1.75 | |||
| 合计 Total | 100.00 |
1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of the diet:Fe (FeSO4·7H2O) 0.2 g,Cu (CuSO4·5H2O) 0.08 g,Mn (MnSO4·H2O) 0.15 g,Zn (ZnSO4·H2O) 0.15 g,Se (Na2SeO3) 0.55 mg,I (KI) 1.5 mg,Co (CoCl2·6H2O) 2.5 mg,VA 5 000 IU,VD3 3 000 IU,VE 50 IU。 2)营养水平均为实测值。Nutrient levels were measured values. |
1.3 测定指标及方法
1.3.1 饲粮营养成分
每周采集荷斯坦奶公牛饲粮200 g,风干保存,所有风干样品混合后粉碎过40目筛用于营养成分测定。其中,粗蛋白质(CP)含量采用Vap50s Gerhardt全自动凯氏定氮仪(GB/T 6432—2018)进行测定,粗脂肪(EE)含量采用索氏提取法(GB/T 6433—2006)进行测定,粗灰分(Ash)含量按国标法(GB/T 6438—2007)进行测定,钙(Ca)含量根据国标法(GB/T 6436—2018)进行测定,磷(P)含量根据国标法(GB/T 6437—2002)进行测定,总能(GE)参照《饲料分析及饲料质量检测技术》[6]中的方法进行测定,中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量参照Van Soest等[7]的方法进行测定。
1.3.2 生长性能
试验正式开始及结束的最后1天晨饲前对所有试验牛逐个空腹称重,记录称重数据用于计算初始体重(IBW)、终末体重(FBW)、平均日增重(ADG);在正试期内,对试验牛每日的投料量及残留量进行准确称重记录,用于计算干物质采食量(DMI)、料重比(F/G)。
1.3.3 瘤胃发酵指标
瘤胃液采集:在试验最后1 d晨饲前,用胃管从试验牛口腔采取瘤胃液,弃掉刚开始采集到的瘤胃液,另抽取50 mL,经过纱布的4层过滤后,将其分装到10 mL的冻存管中,并放置于液氮中暂存,之后-80 ℃保存,用于后续测定。
1.3.4 粪便评分
在正试期内,每隔1 d的10:00,按照奶牛粪便评分标准[11]对试验牛粪便进行主观评分并记录。
1.3.5 血清生化和免疫指标
在试验最后1 d,每组随机选取6头试验牛,于晨饲前用一次性采血针与真空采血管采取尾静脉血液10 mL,在3 500 r/min、10 min条件下离心分离血清。将分离好的血清置于2 mL离心管中于-20 ℃暂存,送至广西国际壮医医院,用于总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、尿素氮(UN)、肌酐(CREA)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)等血清生化指标和免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)等血清免疫指标的测定。
1.4 数据分析
所有试验数据用Excel 2021进行初步整理,采用SPSS 20.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA),差异性结果用LSD法进行多重比较。P<0.05表示差异显著,0.05≤P<0.10表示有变化趋势,数据采用平均值和均值标准误(SEM)表示。
2 结果
2.1 动物源性抗菌肽对荷斯坦奶公牛生长性能的影响
由表2可知,各组之间荷斯坦奶公牛的FBW和DMI无显著差异(P>0.05)。B组的ADG显著高于对照组(P<0.05),F/G显著低于对照组(P<0.05)。A组的ADG和F/G与对照组无显著差异(P>0.05)。
表2 动物源性抗菌肽对荷斯坦奶公牛生长性能的影响Table 2 Effects of animal-derived antimicrobial peptides on growth performance of Holstein dairy bulls |
| 项目 Items | 组别 Groups | SEM | P值 P-value | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 对照 Control | A | B | |||
| 初始体重 IBW/kg | 260.35 | 258.15 | 258.43 | 9.73 | 0.997 |
| 终末体重 FBW/kg | 302.76 | 308.21 | 311.5 | 9.91 | 0.942 |
| 平均日增重 ADG/(kg/d) | 0.74b | 0.86ab | 0.92a | 0.12 | 0.044 |
| 干物质采食量 DMI/(kg/d) | 5.3 | 5.5 | 5.2 | 0.93 | 0.224 |
| 料重比 F/G | 7.16a | 6.43ab | 5.85b | 0.24 | 0.021 |
同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。 | |
In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below. |
2.2 动物源性抗菌肽对荷斯坦奶公牛瘤胃瘤胃发酵指标及粪便评分的影响
由表3可知,各组之间荷斯坦奶公牛的瘤胃丙酸、丁酸和NH3-N含量无显著差异(P>0.05)。与对照组相比,A、B组的瘤胃总挥发性脂肪酸(TVFA)含量有降低趋势(P=0.080)。A、B组的瘤胃pH显著高于对照组(P<0.05),瘤胃乙酸含量及乙丙比(A/P)显著低于对照组(P<0.05)。B组的瘤胃MCP含量显著高于对照组(P<0.05),A组的瘤胃MCP含量与对照组无显著差异(P>0.05)。A、B组的粪便评分显著高于对照组(P<0.05)。
表3 动物源性抗菌肽对荷斯坦奶公牛瘤胃发酵指标及粪便评分的影响Table 3 Effects of animal-derived antimicrobial peptides on rumen fermentation indexes and fecal score of Holstein dairy bulls |
| 项目 Items | 组别 Groups | SEM | P值 P-value | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 对照 Control | A | B | |||
| pH | 6.44b | 6.69a | 6.89a | 0.06 | 0.020 |
| 总挥发性脂肪酸 TVFA/(mmol/L) | 80.05 | 69.84 | 70.72 | 2.10 | 0.080 |
| 乙酸 Acetate/(mmol/L) | 53.83a | 44.80b | 42.88b | 1.84 | 0.023 |
| 丙酸 Propionate/(mmol/L) | 14.07 | 15.69 | 16.20 | 0.75 | 0.510 |
| 丁酸 Butyrate/(mmol/L) | 12.15 | 11.64 | 9.36 | 0.59 | 0.114 |
| 乙丙比 A/P | 3.86a | 2.93b | 2.83b | 0.23 | 0.048 |
| 氨态氮 NH3-N/(mg/L) | 291.29 | 269.91 | 238.43 | 12.57 | 0.213 |
| 微生物蛋白 MCP/(mg/dL) | 1.23b | 1.59ab | 2.08a | 0.14 | 0.041 |
| 粪便评分 Fecal score | 2.59b | 2.84a | 2.87a | 0.32 | 0.038 |
2.3 动物源性抗菌肽对荷斯坦奶公牛血清生化和免疫指标的影响
由表4可知,各组之间荷斯坦奶公牛的血清TP、ALB、GLOB、UN、CREA、TC、TG、GLU、IgA、IgG含量和ALT、AST、ALP活性及ALB/GLOB、AST/ALT无显著差异(P>0.05)。A、B组的血清LDH活性显著低于对照组(P<0.05)。B组的血清IgM含量显著高于对照组(P<0.05),A组的血清IgM含量与对照组无显著差异(P>0.05)。
表4 动物源性抗菌肽对荷斯坦奶公牛血清生化和免疫指标影响Table 4 Effects of animal-derived antimicrobial peptides on serum biochemical and immune indexes of Holstein dairy bulls |
| 项目 Items | 组别 Groups | SEM | P值 P-value | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 对照 Control | A | B | |||
| 总蛋白 TP/(g/L) | 69.96 | 70.26 | 71.50 | 1.32 | 0.895 |
| 白蛋白 ALB/(g/L) | 27.38 | 27.72 | 26.32 | 0.56 | 0.607 |
| 球蛋白 GLOB/(g/L) | 42.58 | 42.54 | 45.18 | 1.42 | 0.718 |
| 白蛋白/球蛋白 ALB/GLOB | 0.66 | 0.66 | 0.62 | 0.03 | 0.813 |
| 谷丙转氨酶 ALT/(U/L) | 20.60 | 19.80 | 21.00 | 0.83 | 0.854 |
| 谷草转氨酶 AST/(U/L) | 87.40 | 67.40 | 63.60 | 6.17 | 0.253 |
| 谷草转氨酶/谷丙转氨酶 AST/ALT | 4.17 | 3.47 | 3.10 | 0.27 | 0.274 |
| 碱性磷酸酶 ALP/(U/L) | 176.60 | 162.80 | 164.60 | 12.00 | 0.893 |
| 乳酸脱氢酶 LDH/(U/L) | 993.00a | 840.80b | 698.20b | 56.62 | 0.043 |
| 尿素氮 UN/(mmol/L) | 2.84 | 2.52 | 2.60 | 0.12 | 0.593 |
| 肌酐 CREA/(μmol/L) | 57.60 | 50.20 | 52.00 | 2.34 | 0.449 |
| 总胆固醇 TC/(mmol/L) | 2.93 | 2.65 | 2.77 | 0.38 | 0.399 |
| 甘油三酯 TG/(mmol/L) | 0.37 | 0.43 | 0.37 | 0.02 | 0.429 |
| 葡萄糖 GLU/(mmol/L) | 5.25 | 5.52 | 4.57 | 0.27 | 0.357 |
| 免疫球蛋白G IgG/(mg/mL) | 0.12 | 0.14 | 0.14 | 0.01 | 0.139 |
| 免疫球蛋白A IgA/(mg/mL) | 0.14 | 0.13 | 0.12 | 0.01 | 0.121 |
| 免疫球蛋白M IgM/(mg/mL) | 1.10b | 1.30ab | 1.60a | 0.09 | 0.032 |
3 讨论
3.1 动物源性抗菌肽对荷斯坦奶公牛生长性能的影响
本试验结果显示,饲粮中添加动物源性抗菌肽能够提高荷斯坦奶公牛的ADG,降低F/G,表明动物源性抗菌肽作为饲料添加剂应用于荷斯坦奶公牛,可以使其更大限度地利用饲料中的营养物质。抗菌肽不但可以杀灭有害菌,提高有益菌群的相对丰度,而且还能够提升肠道绒毛高度,减少隐窝深度,扩大与饲料接触的表面积,使得机体可以从饲粮中获得更多的营养物质来促进生长[12]。李世易[13]在蜜蜂肽对育肥湖羊生长性能的研究中发现,不同添加量的蜜蜂肽对育肥湖羊ADG、平均日采食量(ADFI)及饲料效率均具有积极影响,能够提高育肥湖羊生长性能;苗建军等[14]研究发现,在育肥牦牛的饲粮中添加2.25%的小肽能够显著增加其ADG和ADFI,降低F/G。本研究中,B组的ADG较对照组提高了24.3%,F/G降低了18.3%,均具有显著性差异,这与前人研究结果一致;A组的ADG和F/G与对照组相比虽无显著性差异,但在数值上均优于对照组。造成本研究结果的原因,一方面是本试验所用动物源性抗菌肽具有α-螺旋结构,能够更好地插入到细菌细胞膜发挥杀菌作用,减少有害菌,营造更健康的胃肠道环境;另一方面动物源性抗菌肽因其来自动物体内,与其他源性抗菌肽相比,针对性及胃肠道的适应性都更强,并且可以耐受胃蛋白酶和胰蛋白酶等酶类的水解,在动物胃肠道内能够更稳定的发挥作用。
3.2 动物源性抗菌肽对荷斯坦奶公牛瘤胃发酵指标及粪便评分的影响
3.2.1 动物源性抗菌肽对荷斯坦奶公牛瘤胃发酵指标的影响
反刍动物瘤胃内的微生物将饲料中的碳水化合物等营养成分分解,产生乙酸、丙酸和丁酸等VFA供机体利用[18]。当生成乙酸时,乙酸在各种酶的催化作用下会进一步生成甲烷排出体外而浪费资源[19]。丙酸是机体内唯一能净生成葡萄糖的物质,因此丙酸含量高时,代表向机体提供更多的有效能,促进生长。莫能菌素应用于反刍动物饲喂中,最重要的作用就是调节瘤胃内乙酸、丙酸含量,调控丙酸发酵模式的形成[20]。而瘤胃发酵模式常以A/P来作为标志,当A/P<3,即为丙酸发酵模式,而A/P>3为乙酸发酵模式[21]。本试验结果显示,A、B组乙酸含量及A/P显著低于对照组,且瘤胃发酵模式为丙酸发酵模式(A/P<3),这与刘靖康[22]、高爽[23]在羔羊和山羊饲粮中添加抗菌肽的研究结果一致,也与Martinez等[24]在肉牛饲粮中添加莫能菌素的研究结果一致。但与Hino等[25]研究中使用抗菌肽来调节瘤胃发酵模式的方式不同,本试验通过显著减少乙酸含量来实现丙酸发酵模式的调控。造成本研究结果的原因,可能是本试验所用动物源性抗菌肽携带正电荷,而瘤胃细菌携带负电荷,并且革兰氏阳性菌等电点的pH(2~3)小于革兰氏阴性菌等电点的pH(4~5),革兰氏阳性菌会携带更多的负电荷,因此动物源性抗菌肽与革兰氏阳性菌静电吸引作用更强,表现较强杀灭作用。而乙酸产生菌为革兰氏阳性菌,因此乙酸含量减少,A/P降低。这说明动物源性抗菌肽可以替代莫能菌素等离子载体类抗生素,应用于荷斯坦奶公牛的饲粮中改变瘤胃发酵模式,使其变为丙酸发酵模式,故而能给反刍动物提供更多的有效能,这也可能是本研究中B组荷斯坦奶公牛的生长性能显著高于对照组的原因。A、B组奶公牛的瘤胃TVFA含量与对照组相比,下降超过10%,有降低趋势,表明饲粮中添加动物源性抗菌肽会降低瘤胃TVFA含量,而瘤胃TVFA含量与瘤胃pH呈负相关,这也可能是本试验A、B组瘤胃pH显著高于对照组的原因。
NH3-N和MCP含量变化反映反刍动物瘤胃微生物对氮源的利用情况[22]。本试验中,各组之间瘤胃NH3-N含量虽无显著差异,但在数值上A、B组瘤胃NH3-N含量与对照组相比分别降低了7%和18%;B组瘤胃MCP蛋白含量显著高于对照组。这与高俊玲等[26]在绵羊基础饲粮中添加抗菌肽有降低瘤胃NH3-N含量趋势、Liu等[27]添加抗菌肽显著降低瘤胃NH3-N含量、高爽[23]应用复合抗菌肽显著增加瘤胃MCP含量等的研究结果一致。造成该结果的原因,一方面可能是动物源性抗菌肽提高瘤胃菌群活跃度,利用NH3-N为氮源生成了更多的MCP;另一方面动物源性抗菌肽在瘤胃内发挥作用促进蛋白酶等的分泌,加速对饲粮中蛋白质的分解,产生更多的氨,合成更多的MCP。但该结果与陈园[28]在奶牛饲粮中添加莫能菌素提高瘤胃NH3-N含量、降低MCP含量的结果相反,具体原因还需进一步探究。
3.2.2 动物源性抗菌肽对荷斯坦奶公牛粪便评分的影响
通过对粪便颜色、结构、质地等方面的评分,可以反映瘤胃内的发酵状况以及饲粮在牛体内的消化情况[29]。不仅如此,腹泻作为反刍动物发生亚急性瘤胃酸中毒(SARA)的常见症状之一,对粪便进行评分也可作为SARA的初步判定[30-31]。当粪便pH较低,颜色偏黄,含水量多呈粥样甚至水样,内含气泡,并含有未消化的超过1 cm的颗粒纤维物质,即可初步判定为SARA[32]。本研究结果显示,A、B组粪便评分均显著高于对照组。虽然3组试验牛粪便评分均在2.5~3.0分之间,未达到腹泻状态,但添加动物源性抗菌肽组的粪便评分更接近于3分的最理想状态。这说明动物源性抗菌肽应用于荷斯坦奶公牛的饲粮中能够更好地促进饲粮消化,同时对瘤胃酸中毒具有一定的抑制性。
3.3 动物源性抗菌肽对荷斯坦奶公牛血清生化和免疫指标的影响
3.3.1 动物源性抗菌肽对荷斯坦奶公牛血清生化指标的影响
血清生化指标能够综合反映动物机体健康状况及营养代谢水平。其中LDH在生物体内的糖酵解途径中扮演着关键的角色,它的主要功能是促使乳酸和丙酮酸的氧化还原反应发生。在无氧条件下,LDH能够催化丙酮酸转变为乳酸[33]。LDH活性的高低反映动物机体的健康状况,当心脏、肝脏等出现损伤时,LDH会从损伤的心肌细胞、肝脏细胞中释放出来,造成LDH活性升高[34]。本研究中,A、B组的血清LDH活性均显著低于对照组,表明动物源性抗菌肽应用于奶公牛饲粮中可能会对心肌产生积极影响,进而推测动物源性抗菌肽对动物机体的心脏等内脏器官的健康程度起到正向作用。本试验结果显示,在TP、UN、ALT、AST、ALP、TG、GLU等血清生化指标方面,试验组和对照组无显著差异,表明饲粮中添加动物源性抗菌肽对荷斯坦奶公牛健康状况无不良影响,可以作为饲料添加剂应用于荷斯坦奶公牛等后备牛的生产中。
3.3.2 动物源性抗菌肽对荷斯坦奶公牛血清免疫指标的影响
4 结论
① 饲粮中添加800 g/t的动物源性抗菌肽能够显著提高荷斯坦奶公牛的ADG,显著降低F/G。
② 饲粮中添加500和800 g/t的动物源性抗菌肽能够显著提高荷斯坦奶公牛的瘤胃pH,显著降低瘤胃乙酸含量及A/P,显著提高粪便评分;饲粮中添加800 g/t的动物源性抗菌肽能够显著提高瘤胃MCP含量。
③ 饲粮中添加500和800 g/t的动物源性抗菌肽能够显著降低荷斯坦奶公牛的血清LDH含量,饲粮中添加800 g/t的动物源性抗菌肽能够显著提高血清IgM含量。
④ 综合本试验结果,动物源性抗菌肽应用于奶公牛生产中,能够提高荷斯坦奶公牛的生长性能,调控瘤胃发酵模式为丙酸发酵,对瘤胃酸中毒具有一定的预防作用,并且800 g/t的添加量作用效果更好。