伊犁马原产于新疆,具有繁殖性能好和力速兼备等优点[1-2],在我国速步、速度赛中取得了优异成绩。中国进行的速歩赛主要以骑乘为主,比赛中常见的引用品种主要为法国速步马、奥尔洛夫马和美国速步马等[3]。伊犁马是中国速步赛马中表现较好的品种,但与世界著名速歩赛马品种相比其速步性能还有一定的差距,调教训练水平有待进一步提高,以提高速步性能。
Pohjanen等[4]于2007年首次对运动代谢组的多元模型进行了研究,发现其中有402种血清代谢物可用于预测运动前或运动后的状态。Berton等[5]通过代谢组学研究方法发现,单次抗阻训练后血清中乳酸、丙酮酸、琥珀酸和多种丁酸酯的浓度增加,氨基酸的浓度降低。Enea等[6]通过代谢组学方法研究发现,单次30 s功率自行车冲刺后30 min,尿液中乳酸、丙酮酸和琥珀酸的浓度升高,可作为运动前和运动后的判别指标。Jang等[7]评估急性运动对马骨骼肌代谢组影响的研究中,使用核磁共振波谱确定了35种代谢物,并显示了运动诱导对氨基酸和能量代谢相关物质的改变。Klein等[8]对8匹美国速步马进行12周的运动训练后,用活检针取其骨骼肌进行非靶向代谢组学分析,发现训练显著提高了马的最大有氧和跑步能力,并显著改变了骨骼肌代谢组。虽然代谢组学技术在运动领域的研究已经应用了十多年,但目前只有少数试验研究了训练状态、比赛经验等对马匹代谢组的影响,在训练阶段、运动方式和品种等方面代谢组学研究仍存在空白,而代谢组学筛选出的差异代谢物可以提供关于马匹训练时的机体状态,有助于在高强度调教训练间更好地管理马匹[9]。
本研究以速步型伊犁马为研究对象,采集伊犁马调教训练前后的血液样本,应用液相色谱-质谱(LC-MS)技术分析血浆代谢物,筛选出标志性的差异代谢物,以期为速步型伊犁马运动训练的监控以及训练计划的制定提供更多的理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验动物
本试验以新疆维吾尔自治区伊犁哈萨克自治州昭苏马场的6匹2岁速步型伊犁马公马为试验对象。
1.2 试验条件
所有马匹体尺相近、健康状态良好,处于同一环境条件下,试验间马匹分圈饲养,分别于07:00、12:30、16:00、19:30、24:00时进行青干草饲喂,并分别于07:30和20:30将准备好的精料饲喂给马匹,全天自由饮水,每天定期给马舍消毒和清理粪便。试验马匹统一开展为60 d的调教训练。试验跑道为昭苏县天马文化旅游园沙质跑道,宽28 m,周长2 000 m。具体调教训练方案见表1。
表1 专项速步型伊犁马调教训练方案Table 1 Special Yili horse-trot type breaking and training program |
| 阶段 Stages | 时间 Time/d | 训练方案 Training program |
|---|---|---|
第1阶段 Stage 1 | 1~7 | 调教圈训练1.5 h/d,完成马匹亲和训练与备鞍训练, 使马匹能够顺利佩戴“八字环” |
| 8~14 | 调教圈训练40 min/d:左右里怀各5 min后,佩戴“八字环”再进行左右里怀各15 min; 骑乘训练20 min/d:佩戴“八字环”,在调教圈内左右里怀骑乘各10 min | |
| 15~22 | 调教圈训练30 min/d:左右里怀各5 min后,佩戴“八字环”再进行左右里怀各10 min; 骑乘训练30 min/d:佩戴“八字环”,在固定场地内左右里怀骑乘各15 min。 | |
| 23~30 | 调教圈训练30 min/d:左右里怀各5 min后,佩戴“八字环”再进行左右里怀各10 min; 骑乘训练40 min/d:佩戴“八字环”,在固定场地内左右里怀骑乘各20 min | |
| 第2阶段 Stage 2 | 31~60 | 调教圈训练30 min/d:左右里怀各5 min后,佩戴“八字环”再进行左右里怀 各10 min;骑乘训练40 min/d:佩戴“八字环”,在跑道内 沿顺时针和逆时针方向各骑乘20 min |
1.3 血样采集
分别在调教训练前(第0天)和调教训练后(第60天)晨饲3 h后采集6匹速步马的血样,立即进行3 500 r/min离心15 min,取血浆于2 mL冻存管,液氮保存,用于血浆代谢组检测。
1.4 血浆代谢组检测
所有样本在室温条件下解冻,取100 μL解冻后的血浆样品转移至EP管中加入400 μL的80%甲醇水溶液,涡旋振荡,冰浴静置5 min,15 000×g、4 ℃离心15 min得上清;取一定量的上清加质谱级水稀释至甲醇含量为53%;15 000×g、4 ℃离心15 min,收集上清,在LC-MS上进行分析。以53%甲醇水溶液作为空白样本。液相色谱中流动相的梯度洗脱程序见表2。
表2 液相色谱中流动相的梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution procedure for mobile phases in liquid chromatography% |
| 时间 Time/min | A相 Phase A | B相 Phase B |
|---|---|---|
| 0 | 98 | 2 |
| 1.5 | 98 | 2 |
| 3.0 | 15 | 85 |
| 10.0 | 0 | 100 |
| 10.1 | 98 | 2 |
| 11.0 | 98 | 2 |
| 12.0 | 98 | 2 |
正离子模式下,A相为0.1%甲酸,B相为甲醇;负离子模式下,A相为5 mmol/L醋酸铵(pH 9.0),B相为甲醇。 | |
Under positive ion mode, phase A is 0.1% formic acid, and phase B is carbinol; under negative ion mode, phase A is 5 mmol/L ammonium acetate (pH 9.0), and phase B is carbinol. |
1.5 数据处理与分析
使用KEGG数据库、HMDB数据库和LIPID MAPS数据库对鉴定到的代谢物进行注释。多元统计分析部分,使用代谢组学数据处理软件metaX对数据进行转换后进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA),进而得到每个代谢物的变量投影重要度(VIP)值。计算代谢物在2组间的差异倍数(fold change,FC)。差异代谢物筛选的默认标准为VIP>1,P值<0.05且FC≥1.5或FC≤0.667。
2 结果与分析
2.1 PCA
由图1可知,在正离子模式下,主成分1(PC1)=33.78%、主成分2(PC2)=11.50%;在负离子模式下,PC1=26.72%、PC2=12.72%,各散点均可以紧密地聚集在一起,说明本试验质量控制很好,并且调教训练前后具有一定的离散趋势,可以进行区分,表明调教训练前后血浆代谢物发生了明显的变化。
图1 伊犁马调教训练前后血浆样本PCA图A:正离子模式下PCA图;B:负离子模式下PCA图。Q1表示调教训练前,Q3表示调教训练后。下图同。 Fig.1 PCA diagrams of plasma sample of Yili horses before and after breaking and training A: PCA diagram in positive ion mode; B: PCA diagram in negative ion mode. Q1 indicates before training, and Q3 indicates after training. The same as below. |
2.2 PLS-DA
为了更好地区分速步型伊犁马调教训练前后血浆代谢物的变化,在PCA的基础之上进一步进行PLS-DA。由图2可知,在正离子模式下,R2Y=1.00、Q2Y=0.77;在负离子模式下,R2Y=1.00、Q2Y=0.89。模型中R2Y均高于0.5,Q2Y介于0.6~1.0,表明模型解释率高,预测能力可以接受。对正、负离子模式数据PLS-DA模型进行置换检验。在正离子模式下,Q2截距为-0.68(Q2<0);在负离子模式下,Q2截距为-0.69(Q2<0)。以上模型Q2均小于1,表明PLS-DA模型未过度拟合,伊犁马在调教训练前后血浆代谢物存在差异。
图2 伊犁马调教训练前后血浆样本PLS-DA得分散点图及排序验证图A:正离子模式下PLS-DA得分散点图;B:正离子模式下PLS-DA排序验证图;C:负离子模式下PLS-DA得分散点图;D:负离子模式下PLS-DA排序验证图。R2Y表示模型的解释率,Q2Y表示模型的预测能力。 Fig.2 Score plots and sequencing verification diagrams of PLS-DA of plasma sample of Yili A: PLS-DA dispersion diagram in positive ion mode; B: PLS-DA sequencing verification diagram in positive ion mode; C: PLS-DA dispersion diagram in negative ion mode; D: PLS-DA sequencing verification diagram in negative ion mode. R2Y represents the explanatory power of the model, Q2Y represents the predictive power of the model. |
2.3 不同训练阶段速步型伊犁马血浆差异代谢物筛选
表3 伊犁马调教训练前后血浆差异代谢物(正离子模式下)Table 3 Plasma differential metabolites of Yili horses before and after breaking and training (under positive ion mode) |
| 代谢物 Metabolites | 保留时间 RT/min | 变量投影 重要度 VIP | P值 P-value | 差异倍数 FC | 调教训练后的变化 Changes after breaking and training | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 原亮氨酸 Prolylleucine | 1.414 | 1.728 | <0.001 | 0.409 | 上调 | |
| 腺苷酸 Adenosine 5'-monophosphate | 1.592 | 1.386 | 0.001 | 6.317 | 下调 | |
| 癸二酸 Sebacic acid | 5.958 | 1.617 | 0.001 | 0.634 | 上调 | |
| 雄酮 Androsterone | 8.109 | 1.650 | 0.003 | 5.566 | 下调 | |
| 尿囊酸 Allantoic acid | 1.398 | 1.400 | 0.009 | 0.570 | 上调 | |
| 过氧化氢酶 Ethyl paraben | 5.514 | 1.445 | 0.009 | 0.285 | 上调 | |
| 苯丙酮酸 Phenylpyruvic acid | 5.471 | 1.497 | 0.016 | 0.218 | 上调 | |
| D-高半胱氨酸 D-homocysteine | 1.386 | 1.325 | 0.030 | 1.501 | 下调 | |
| 异亮氨酸 Isoleucine | 2.878 | 1.013 | 0.038 | 0.695 | 上调 | |
| 大黄素 Emodin | 5.806 | 1.486 | 0.005 | 0.632 | 上调 | |
| 漆黄素 Fisetin | 5.328 | 1.809 | 0.005 | 0.566 | 上调 | |
| 左旋甲状腺素 L-thyroxine | 6.492 | 1.197 | 0.003 | 0.654 | 上调 | |
表4 伊犁马调教训练前后血浆差异代谢物(负离子模式下)Table 4 Plasma differential metabolites of Yili horses before and after breaking and training (under negative ion mode) |
| 代谢物 Metabolites | 保留时间 RT/min | 变量投影 重要度 VIP | P值 P-value | 差异倍数 FC | 调教训练后的变化 Changes after breaking and training |
|---|---|---|---|---|---|
| 壬二酸 Azelaic acid | 5.080 | 2.125 | <0.001 | 0.195 | 上调 |
| 麦角硫因 Ergothioneine | 1.389 | 2.027 | 0.001 | 2.240 | 下调 |
| 对羟甲基苯甲酸 4-(hydroxymethyl)benzoic acid | 6.050 | 1.371 | 0.001 | 2.067 | 下调 |
| N-乙酰-DL-色氨酸 N-acetyl-DL-tryptophan | 5.563 | 1.173 | 0.002 | 2.161 | 下调 |
| 顺乌头酸 Cis-aconitic acid | 2.732 | 1.664 | 0.002 | 0.278 | 上调 |
| 2-羟基马尿酸 2-hydroxyhippuric acid | 5.090 | 1.636 | 0.003 | 0.500 | 上调 |
| 核糖 Ribose | 1.402 | 1.392 | 0.005 | 2.998 | 下调 |
| 马尿酸 Hippuric acid | 5.361 | 2.034 | 0.005 | 0.497 | 上调 |
| 衣康酸 Itaconic acid | 2.745 | 1.579 | 0.006 | 0.338 | 上调 |
| N-乙酰-L-组氨酸 N-acetyl-L-histidine | 1.289 | 1.344 | 0.016 | 1.570 | 下调 |
| 对羟基苯甲醇 4-hydroxybenzyl alcohol | 5.728 | 1.383 | 0.021 | 1.503 | 下调 |
| 核黄素磷酸钠 Riboflavin-5-phosphate sodium | 5.768 | 1.638 | 0.028 | 0.248 | 上调 |
| 可可碱 Theobromine | 5.355 | 1.746 | 0.004 | 0.447 | 上调 |
2.4 代谢通路分析
对伊犁马在调教训练后血浆中差异代谢物进行KEGG通路富集分析,结果见图3。伊犁马在调教训练后血浆中差异代谢物富集到的代谢途径有核黄素代谢(riboflavin metabolism)、肾素分泌(renin secretion)、苯丙氨酸代谢(phenylalanine metabolism)、咖啡因代谢(caffeine metabolism)、腺苷酸活化蛋白激酶信号通路(AMPK signaling pathway)、柠檬酸循环(citrate cycle)和组氨酸代谢(histidine metabolism)等。
3 讨论
3.1 速步型伊犁马的糖代谢
腺苷酸(AMP)可由三磷酸腺苷(ATP)失去1个焦磷酸基团得到,它们的比例在一般生理状况下处于一种比较稳定的状态[10]。本研究发现,调教训练前伊犁马血浆中腺苷酸(AMP)浓度显著高于调教训练后,这可能表明了伊犁马调教训练前的血浆AMP/ATP显著高于调教训练后,即调教训练后伊犁马血浆中ATP浓度高于调教训练前。有研究表明,16周高强度间歇(HIIT)运动可以提高增龄大鼠血浆中ATP浓度,从而提高增龄大鼠最大摄氧量(VO2max)和有氧运动能力[11]。这与本研究结果相似,说明调教训练增强了伊犁马的供能能力。TCA循环是三大能源物质彻底氧化的最终代谢途径,也是大多数活细胞中的主要代谢途径[12]。顺乌头酸是三羧酸(TCA)循环的重要中间产物,可以反映有氧代谢的活跃程度。有研究发现,经过运动后,TCA循环中间产物主要在血液和尿液中增加,在血液中,TCA循环中间产物的浓度会显著增加[13]。本研究发现,调教训练后伊犁马血浆中顺乌头酸的浓度显著高于调教训练前,这可能是由于调教训练加快了伊犁马有氧代谢的活跃程度,从而增加了TCA循环的中间产物顺乌头酸的浓度。
3.2 速步型伊犁马的氨基酸代谢
支链氨基酸是人类和许多动物的必需营养素。异亮氨酸作为支链氨基酸之一,在整个人体的生理功能(例如生长、免疫力、蛋白质代谢、脂肪酸代谢和葡萄糖转运)中至关重要。异亮氨酸可以改善免疫系统,包括免疫器官和反应性物质等[14]。本研究发现,调教训练后伊犁马血浆中异亮氨酸的浓度显著高于调教训练前,这可能表示调教训练提高了伊犁马的免疫能力。苯丙酮酸对动物机体的生长发育具有重要的调节作用[15]。有研究发现,给小鼠饲粮添加苯丙酮酸能显著提高小鼠爪握力,增加其运动耐力和爆发力[16]。本研究发现,调教训练后伊犁马血浆中苯丙酮酸的浓度显著高于调教训练前,说明调教训练增加了伊犁马的耐力和爆发力。麦角硫因是稀有氨基酸的一种,具有优良的抗炎性及抗氧化性[17]。有学者发现,给小鼠饲粮中添加麦角硫因可以显著地改善小鼠的体力消耗时间,提高了它的有氧运动能力,更好的管理运动引起的肌肉损伤和恢复[18]。另有学者发现,补喂麦角硫因会缓解马的应激反应,对其训练产生积极作用[19]。本研究发现,调教训练前伊犁马血浆中麦角硫因的浓度显著高于调教训练后,这可能是由于调教训练后期伊犁马已基本适应,因调教训练受到的应激减少,伊犁马机体无需分泌更多的麦角硫因来缓解应激,具体机制还需进一步研究。
3.3 速步型伊犁马的脂质代谢
机体内血睾酮浓度与运动能力密切相关,雄酮是睾酮代谢物之一,以葡糖醛酸抱合体的形式排出[20]。有研究表明,19名U18(即18周岁以下)男子运动员在经过为期12周的最大力量和单次爆发力训练后尿中雄酮浓度显著下降[21]。董成[22]的研究也发现,运动员在单次爆发力训练周时其血清睾酮浓度达到最低。本研究结果与其相似,调教训练后伊犁马血浆中雄酮的浓度显著低于调教训练前,这表明调教训练增加了伊犁马的运动爆发能力。左旋甲状腺素可以通过转变为游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)进而促进人体代谢[23]。有研究表明,服用左旋甲状腺素不会对身体成分、能量消耗和呼吸商产生积极影响,但它可以提高力量、活动能力和耐力表现[24]。本研究发现,调教训练后伊犁马血浆中左旋甲状腺素的浓度显著高于调教训练前,说明调教训练提高了伊犁马的运动能力和耐力表现。
3.4 速步型伊犁马的其他物质代谢
当机体能量极度匮乏时,马尿酸可以抑制骨骼肌对葡萄糖的使用,并促进能量物质优先供应机体最重要的生命活动,激发身体的保护性抑制机制[25]。有研究发现,马匹运动后血浆中马尿酸的浓度会显著上升[26]。在本研究中,调教训练后伊犁马血浆中马尿酸的浓度显著高于调教训练前,这可能说明,随着调教训练的进行,伊犁马体内的马尿酸浓度也随之增加,将能源物质优先供应给大脑、神经等重要活动。可可碱是可可中浓度最高的甲基黄嘌呤[27]。有研究表明,当可可碱的剂量为600 mg/kg时,可提高受试者3 km跑步机的跑步速度[28]。本研究发现,调教训练后伊犁马血浆中可可碱的浓度显著高于调教训练前,说明调教训练提高了伊犁马的运动速度。漆黄素是一种具有多种生物活性的天然类黄酮物质,具有很强的抗氧化活性和抗炎能力[29]。有学者发现,给帕金森病模型小鼠灌胃漆黄素不仅可以显著提高小鼠的运动总距离、运动速度,降低爬杆总时间、缩短转头时间,还增加了小鼠的抗氧化能力[30]。Carbonare等[31]也发现,漆黄素可防止炎症引起的骨质流失,从而对成骨有着积极作用。本研究发现,调教训练后伊犁马血浆中漆黄素的浓度显著高于调教训练前,说明调教训练增强了伊犁马的抗炎、抗氧化能力和骨骼的发育。
4 结论
本试验通过对调教训练前后速步型伊犁马血浆代谢物进行分析发现,调教训练使血浆中的原亮氨酸、癸二酸、尿囊酸、顺乌头酸、核黄素磷酸钠等16种物质的浓度显著升高,腺苷酸、雄酮、麦角硫因和对羟基苯甲醇等10种物质的浓度显著降低;调教训练增强了速步型伊犁马的有氧运动能力和耐力,降低了应激反应,涉及的代谢通路有核黄素代谢、肾素分泌、苯丙氨酸代谢、咖啡因代谢、AMPK信号通路、柠檬酸循环和组氨酸代谢等。