古时马在交通运输、传递信息、耕地农作、采矿行业等多种生产活动中被广泛应用。随着时代的发展,马业的功能与用途发生了巨大的转变,逐步向集文化教育、体育赛事、运动竞技、休闲娱乐为一体的现代化马业转型[1-2],赛马是其中最具影响力的产业,在美国、日本等发达国家,赛马已经成为推动社会发展的重要经济增长点[3]。近几年,国家开始对我国现代马产业的发展给予高度关注,并将马产业确定为畜牧业中的重要组成部分,同时还要求对马产业进行深入研究,并颁布全国马产业发展规划,支持马竞技体育产业发展。国内赛马在蓬勃发展,据统计,我国目前马术俱乐部超过2 000家,中国马业协会每年举办场地速度赛马大奖赛、锦标赛、冠军赛等运动马赛事活动百余场。
1 马运动生理及氧化应激损伤
在运动过程中,机体由于能量消耗过大,新陈代谢速率不断加快,导致机体内环境发生变化,产生运动性疲劳。应激是机体内神经、内分泌、免疫等多系统参与的整体反应。应激发生时机体内产生大量的有害激素和细胞因子,使机体代谢水平显著升高,同时也会影响到各种器官功能的改变,从而导致血液生理生化指标的相应变化。竞技马在运动过程中由细胞内的线粒体呼吸产生ATP为机体提供大量能量。在线粒体呼吸过程中,通过电子链传递产生氧自由基。马在运动过程中氧的消耗量可以增加30倍[7],正常生理条件下机体自由基的产生与清除处于动态平衡状态,但剧烈运动时骨骼肌快速收缩,运动强度增大,线粒体呼吸加剧,短时间内产生大量自由基,超过机体自身清除能力[8],导致体内的氧化还原系统失衡。
运动会引起马匹体内明显的短暂生理变化,包括血流量增加、体温升高、激素水平变化、热休克蛋白合成、氧化应激、白细胞介素和受体的产生以及与炎症过程相关的许多其他物质的产生[9],且马匹在剧烈运动后伴随心率加快、体温增高等现象[10]。Binda等[11]选取28匹成年夸特马进行绕桶比赛(barrel-racing test),运动后马匹平均心率最大达到(96.5±22.8)次/min,体温显著升高至(38.7±0.5) ℃,在运动后120 min基本恢复至初始水平。Mukai等[12]测量了23匹纯种马在1 200 m比赛之前、期间和之后的心率,以及比赛后10 min时的血液乳酸浓度,结果发现,马在运动后心率显著增加,比赛期间心率峰值(HRpeak)达到(213.6±1.7)次/min,血液乳酸浓度显著升高至(22.5±0.6) mmol/L,反映了马在比赛过程中对厌氧代谢途径的依赖。剧烈运动还可能导致血常规指标如红细胞、白细胞数目、淋巴细胞、血小板数目等发生变化。李连浩[13]对12匹蒙古马进行20 km高强度运动后采集血液样本进行血常规分析,发现红细胞、白细胞、淋巴细胞、血小板数目等在运动后均呈先升高后降低趋势,且在运动20 km时达到最高,在运动后4 h基本恢复至初始水平,该试验结果表明马由于剧烈运动导致体内发生炎症反应,氧化应激失衡。活性氧(ROS)参与多项细胞活动,包括细胞能量代谢、信号传导及基因表达的调控等,当氧自由基积累过多,可能会损害DNA、脂质和蛋白质,损伤线粒体功能,从而导致细胞凋亡以及肌纤维损伤,降低马的运动性能。添加具有抗氧化功能的营养物质如油脂、维生素、微量元素以及植物提取物等可提高马的抗氧化性能,缓解运动马的氧化应激。马运动氧化应激产生机制及营养缓解途径如图1所示。
图1 马运动氧化应激产生机制及营养缓解途径T-AOC:总抗氧化能力 total antioxidant capacity;SOD:超氧化物歧化酶 superoxide dismutase;CAT:过氧化氢酶 catalase;GSH-Px:谷胱甘肽过氧化物酶 glutathione peroxidase;LPO:过氧化脂质 lipid peroxide;TBARS:硫代巴比妥酸反应物 thiobarbituric acid reactive substance;CK:肌酸激酶 creatine kinase;AST:天冬氨酸转氨酶 aspartate aminotransferase;MDA:丙二醛 malondialdehyde。 Fig.1 Mechanisms of oxidative stress generation in equine locomotion and pathways of nutritional mitigation |
2 马运动氧化应激影响因素
马在正常生理条件下氧化还原平衡保持在相对稳定的状态,当经过剧烈运动后,体内氧自由基产生过度,这种平衡就会被打破,从而导致氧化应激的发生。研究发现,有许多因素可以影响马运动后的氧化应激,如马的品种、年龄、环境以及运动强度等。这些因素引起的氧化应激可不同程度地影响马的健康、生产性能和生殖功能,甚至导致马匹死亡,严重损害动物福利。
2.1 品种
不同组织部位的肌肉其收缩速度和强度存在差异,肌纤维可分为慢速收缩型(Ⅰ型)、快速收缩型(Ⅱ型)2个类型,正由于肌纤维类型的不同,马匹分为速度马和耐力马2种,其中速度马有纯血马、奎特马、汗血宝马等,耐力马有蒙古马、阿拉伯马、焉耆马等。
英国纯血马是世界上跑得最快的马,速度可达20 m/s,1 000 m赛跑仅用53 s就可以跑完全程,创造和保持着5 000 m以内各种距离速力的世界纪录。在我国古代汗血宝马就有日行千里夜行八百的说法,1 000 m赛程仅需67 s即可完成。夸特马是美国的一个品种,擅长短距离冲刺,平均时速可以达到70.76 km。Teixeira等[14]对10匹健康、经过调教训练的夸特马进行绕桶比赛,夸特马在运动后平均心率最大达到(58.0±13.6)次/min,血清天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)活性分别达到(293.1±16.1) U/L、(354.0±110.0) U/L、(131.4±20.0) U/L,且血清AST和CK活性在运动后2 h仍高于运动前。Binda等[11]选取28匹经过训练的夸特马进行绕桶比赛,运动后马的平均心率最大达到(96.5±22.8)次/min,血清AST与CK活性在运动后显著升高且持续至运动后120 min仍高于初始水平。上述结果表明,速度马在高速运动后机体受到氧化应激损伤且持续时间较长。
蒙古马是是世界上最具耐力的马品种之一,在一般的马术比赛中,参赛的马种大多数为蒙古马,赛马的距离通常在30~100 km。1949年在新巴尔虎左旗举办了第1次蒙古马耐力赛,比赛从新巴尔虎左旗阿木古郎镇出发到乌尔逊河东岸再返回到阿木古郎镇,赛跑距离100 km。该比赛从05:00开始,冠军马08:00到达终点,证明了蒙古马具有良好的耐力和持久的运动性能[15]。李连浩[13]对12匹蒙古马进行20 km的高强度运动后采集血液样本,测定结果显示白细胞数目、CK活性呈先升高后降低变化趋势,在运动后2 h达到最高;甘油三酯(TG)、肌酐(Cr)含量均呈先升高后降低的变化,并分别在运动15、20 km时达到最高;总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性从运动前到运动20 km数值逐渐降低,运动后1~6 h逐渐升高;过氧化氢酶(CAT)活性在运动20 km时显著低于运动前,运动后逐渐升高并在运动后6 h时显著高于运动20 km时;丙二醛(MDA)含量在运动后逐渐升高,并在运动20 km时达到最高;以上抗氧化酶活性的变化表明马在剧烈运动后发生氧化应激,运动完成后逐渐恢复;采用透射电镜对肌纤维进行分析发现,运动后肌纤维氧化受损严重,肌节拉伸,边缘模糊不清,在运动后24 h基本恢复。Cottin等[16]对5匹健康接受过训练的阿拉伯马进行60 km耐力赛(小跑:13.0~15.5 km/h,慢跑和疾驰:18.7~25.2 km/h和33.5~36.0 km/h,然后加速至45 km/h,每3 min提升一次速度),运动后心率、呼吸频率、摄氧量和二氧化碳产量等均逐渐升高。
综合以上研究结果表明,在剧烈运动中速度马倾向于更早发生氧化应激且持续时间较长,而耐力马由于耐力持久,易在短时间高强度运动时发生氧化应激且恢复所用时间较短。
2.2 年龄
年龄可以影响马匹对急性运动的反应以及各种系统对训练的适应性反应程度。例如,已有研究确定了年龄对马心血管运动反应的影响,发现年龄较大的马[(22±0.4)岁]的最大耗氧量比年轻的马[(5.3±0.8)岁]低24%[17-18];与年轻马[(6.8±0.4)岁]、青年马[(15.2±0.4)岁]相比,年龄较大的马[(27.0±0.2)岁]在较低速度下达到的最大心率和最大摄氧量较低,并且从运动测试中恢复的时间较长[19]。Williams等[20]的研究表明,年老马[(22±2)岁]与成年马[(12±2)岁]运动后在抗氧化状态和氧化应激方面没有明显区别,但就免疫功能来说,年老马在运动后免疫力下降,更容易感染疾病。Latham等[21]对马驹[(9.7±0.7)月龄]与老年马[(22±5)岁]运动训练12周后的肌纤维类型和大小、卫星细胞丰度和柠檬酸合成酶(CS)活性(线粒体体积密度)、细胞色素c氧化酶(CCO)活性(线粒体功能)进行对比,结果证明运动改善了年轻和老年马的线粒体功能,但相较于年轻马,老年马在运动后表现出更高程度的线粒体功能受损且对运动训练的适应程度较差。综上所述,相较于老龄马(20岁以上),青年马(10~15岁)更能适应高强度运动引起的氧化应激反应。
2.3 环境
运动中的氧化应激发生也受环境影响,如运动场地、温湿度以及供氧量等。马运动对于环境的适应性训练表明,相较于在沙道上训练,在草道上训练能显著提高伊犁马1 000 m速度赛成绩,提高运动前后血浆SOD、GSH-Px活性及T-AOC,并降低全血中乳酸的堆积[22]。
动物体内存在着一系列的生理调控机制,在一定的温度范围内,动物体内的各种生理功能和生产性能都保持稳定。温度、湿度的增加(30 ℃、80%相对湿度)会使动物体内的新陈代谢加快,使ROS过度积累,进而损害动物的身体健康,降低动物的生产性能等。Mills等[23]的试验结果表明,马在短时间高强度运动下,与对照组相比,温度(20~30 ℃)和湿度(40%~80%相对湿度)的增加导致血浆中脂质氢过氧化物和溶血物中氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量升高,运动诱导脂质氢过氧化物、次黄嘌呤和尿酸含量显著增加,这些变化表明马在运动后产生氧化应激,并且在高温和潮湿的环境中加剧了这种情况。Mukai等[24]在常压低氧(15.0%吸入氧气)和常氧(20.9%吸入氧气)条件下对8匹成年健康纯种马进行高强度训练(马先以4 m/s的速度小跑3 min,然后分别以1.7、4、6、8、10、12、13和14 m/s的速度慢跑,每次2 min,直到马无法继续在跑步机上运动),结果发现在运动后,低氧组的动脉血氧饱和度(SaO2)、混合动静脉血氧饱和度(SvO2)、动脉血氧浓度(CaO2)、混合动静脉血氧浓度(CvO2)、动脉血氧分压(PaO2)均低于常氧组;对于运动表现和有氧能力的影响,低氧组的最大耗氧量、心输出量以及心搏量均显著高于常氧组;这些结果表明,在常压低氧条件下的高强度训练比在常压常氧条件下的相同训练方案更大程度上提高了马的运动表现和有氧能力。后续该作者又对低氧方案进行了进一步研究,研究了中度缺氧(16%吸入氧气)、轻度缺氧(18%吸入氧气)以及常氧(21%吸入氧气)对同一运动训练方案后马的反应,结果表明中度低氧训练比正常低氧训练能取得更好的成绩并提高运动性能,并且低氧训练的效果在缺氧后的2周训练中保持不变[25]。综上可知,高温高湿(30 ℃、80%相对湿度)似乎对马运动机制有不利影响,适度低氧环境(16%吸入氧气)有利于抑制马运动后的氧化应激。
2.4 运动强度
长时间的剧烈运动会导致免疫功能各方面的暂时性抑制,诱发类似炎症的疾病[26],具体取决于运动的强度和持续时间。适当强度的运动训练可以抑制机体的活性需氧物种的形成,从而减少机体氧化反应水平。运动强度的增加可细化为运动速度的增加和运动距离的延长。据报道,参与高强度运动训练的马由于体内ROS产生过度,极易受到高水平氧化应激的影响[27];而进行适度运动的马似乎不容易出现体内ROS含量升高的情况[28-29]。Mills等[23]选取6匹健康的纯种马比较了长时间可变强度(步行10 min,3.7 m/s小跑10 min,10.7 m/s疾驰2 min,3.7 m/s小跑20 min,1.7 m/s步行10 min,然后9.2 m/s慢跑8 min)和短期高强度运动(1.7 m/s步行10 min,然后分别以6和8 m/s的速度慢跑1 min,之后每分钟速度增加1 m/s直到12 m/s或者直到马跟不上跑步机的速度)对氧化应激指标的影响,结果发现,与在较冷环境条件下进行长时间可变强度运动相比,短期高强度运动中脂质氢过氧化物和GSSG含量的最大值更高,表明产生了ROS和脂质膜过氧化。李连浩[13]研究了不同运动距离对氧化应激发生的影响,结果发现,当马运动5 km时,心率最大达到127.00次/min,血清中TG和Cr含量分别在运动15和20 km时最高。Williams等[30]的研究表明,马在80 km的运动后出现氧化应激。Hargreaves等[31]的研究同样表明马在80和160 km的运动后都出现氧化应激,且氧化应激程度随着距离的延长而增加。综上可知,马运动强度越大,氧化应激反应越明显。
3 马运动氧化应激损伤
3.1 血液生化指标变化
机体组织、器官等发生病理学改变时,相应血液生化指标也会随之改变,血液生化指标是有效判断机体代谢、评价动物健康状况、机体内环境平衡稳态的核心指标,也是疾病诊断及监控的重要评估手段。血液中相关酶的活性可以有效反映组织细胞损伤或者细胞膜通透性改变的程度,如SOD、GSH-Px活性的降低以及MDA含量升高可反映机体受氧化应激情况,LPO和TBARS分别是脂质氧化过程中的中间产物和终产物,其含量可反映脂质氧化程度,CK活性可反映运动过程中肌肉损伤程度等。何爱红等[32]对60匹2岁左右的蒙古马进行30.5 km耐力赛,以CK、骨骼肌型肌酸激酶(CK-MM)、LDH、白细胞介素-6(IL-6)等指标的变化情况评价肌肉损伤,结果表明,马在耐力运动后总体运动性能下降,血清中SOD和GSH-Px活性显著降低,MDA含量升高;血清中CK、CK-MM、LDH活性和IL-6含量均升高,表明马在经过长距离耐力赛后肌肉受损,发生了氧化应激。Williams等[30]研究表明,马经过21、56和80 km的长距离运动后,血清中LPO含量与运动前相比显著增加,且随着运动距离的延长而增加。Ott等[10]研究发现,当马进行了标准化中等强度运动后,血清中TBARS含量较于运动前有显著增高。White等[33]将30匹马分为接受训练和未接受训练2组进行120 min高强度比赛,运动结束后,接受训练的马的肌肉GSH-Px和SOD活性大于未接受训练的马,且血清CK活性较低,表明接受训练的马肌肉损伤较小;同时,接受训练的马血浆LPO和肌肉MDA含量在运动的第2阶段显示出比未接受训练的马降低的趋势;上述结果表明,运动训练可以减轻急性长时间运动后的肌肉损伤和改善抗氧化防御。White等[34]对未经训练的12匹纯种马进行短期高强度运动训练后评估血液和骨骼肌中的酶活性,在运动后血清CK活性和LPO含量显著升高,红细胞中GSH-Px活性立即降低。同样有研究显示,血清中GSH-Px、SOD活性升高与MDA含量降低,能够改善赛马后的恢复功能,减缓运动过程中的疲劳现象,提高马的运动成绩[35]。综上可知,剧烈运动使马发生氧化应激,可导致体温、心率明显增加,血液中抗氧化酶SOD、GSH-Px活性下降以及脂质过氧化物MDA含量以及LPO、TBARS含量和CK活性增加,降低运动性能。
3.2 线粒体功能受损
线粒体与动物的生长发育、代谢、疾病、衰老、死亡、生物进化等密切相关,既是能量供应和代谢的中心,又是许多外源毒性物质的首选靶点[36],故其在多种病理条件下容易发生不同程度的结构与功能损伤。当致病因素诱导导致自由基水平升高,会使抗氧化防御体系作用降低,机体内出现自由基代谢紊乱,氧化应激水平增强,线粒体功能受损。
细胞损伤时,线粒体的变化主要表现为数量、大小及其结构上的变化。线粒体呼吸链已经被广泛证明为ROS物种形成的重要源头,而内源性抗氧化剂以及相关酶,如果不能有效去除过多的过氧化物,就会引起线粒体的氧化应激破坏和功能障碍,进而导致细胞凋亡和各种疾病。研究发现,ROS在启动和调节细胞凋亡的过程中扮演着重要的角色,ROS的积累可以导致线粒体膨大[37]。Owen等[38]采用高分辨率呼吸测量(HRR)法[39]分析了氧化磷酸化和电子转移能力,结果表明,马匹经过12周运动训练后,线粒体体积密度(CS活性)、功能(CCO活性)、抗氧化和电子转移能力从第1周到第12周均显著增加,说明马通过训练可以缓解运动后产生的氧化应激,提高运动性能。Henry等[40]选取6匹纯种马经过每周6 d(前3 d在高速跑步机锻炼,20 min/d;后3 d步行,30 min/d)的锻炼计划后,用高分辨率呼吸测量法测定线粒体呼吸能力,结果显示,在对线粒体体积密度没有影响的情况下,运动后三羧酸(TCA)循环酶利用NADH和琥珀酸脱氢酶增强电子转移能力减弱。以上结果表明,马在剧烈运动后耗氧量增加,电子转移能力下降,线粒体功能受损。
3.3 肌肉损伤
马匹经过长时间高强度竞技运动,会造成肌纤维结构受损,产生肌肉疾病,降低马的运动性能。对177名驯马师的调查中收集了2 345匹标准赛马数据,结果发现由于肌肉骨骼问题导致马运动性能下降的发生率(10%)高于不明原因导致马运动性能下降的发生率(6%)[41]。马在高强度运动过程中,机体内会产生大量的内源性自由基,从而导致体内抗氧化酶系统功能失调,清除自由基的能力大大减弱,致使体内自由基堆积过多产生过度氧化,进而影响机体正常的肌肉运动以及在运动结束后机体的功能快速复原。肌肉损伤程度可以通过肌纤维形态、血液中CK、AST活性以及肌肉相关疾病等进行反映。
以蒙古马为例,在高强度的比赛中会发生轻度运动性肌肉疲劳,进而影响到运动反应能力和康复状态[42]。李连浩[13]在试验中对蒙古马进行了短期高强度运动,通过透射电镜观察肌纤维变化发现,运动后肌纤维受损严重,边缘模糊,肌节不清,运动后24 h有明显恢复。AST主要分布在心脏、肝脏及骨骼肌的胞质和线粒体中,参与了多种氨基酸的生物合成,其活性是判断细胞是否损伤的一项敏感参数。CK活性是反映肌肉功能状态、生理状态及病理状况的重要指标,任何导致肌肉损伤和干扰肌肉能量生产或使用的情况都可能导致CK活性增加。Williams等[43]对12匹阿拉伯马进行55 km耐力运动测试(EET),结果发现,运动后细胞凋亡率显著增加,CK和AST活性均增加,表明马在耐力赛后发生了肌肉损伤。类似的研究,Williams等[44]对46匹耐力马进行80 km的运动训练,运动后血浆中CK和AST活性升高,血浆中LPO活性和红细胞、白细胞中总谷胱甘肽(GSH-T)含量显著增加,红、白细胞中GSH-Px活性显著降低;White等[4]对44匹纯种马以最大速度进行(1 000±200) m赛跑,运动后血浆中CK活性和TBARS含量显著增加,表明运动后马的肌肉有一定程度的损伤。
剧烈运动过后,如马匹身体不适或操作不当,可能伴有肌肉痉挛、抽筋、肌肉挛缩(由肌节直接缩短引起)等情况。运动肌肉功能的轻微紊乱会影响力量输出、协调性、耐力和运动时的工作欲望。适度运动可能导致轻微肌肉损伤,但当运动强度超过承受限度,可能产生肌肉疾病。有相关调查表明,肌肉骨骼疾病发生的可能性是运动性能下降的1.7倍[置信区间(CI)=1.2~2.3,P<0.001][41]。劳损性肌病,如1型多糖贮积肌病(PSSM1)、夸特马的2型多糖贮积肌病(PSSM2)、恶性高热、阿拉伯马的复发性劳损性横纹肌溶解(RER)和肌纤维性肌病(MFM),其特征是横纹肌溶解和血清CK活性升高[45]。急性横纹肌溶解的表现很容易被识别,并且可以通过评估血清CK和AST活性的变化来诊断。Williams等[43]对12匹马进行55 km耐力赛,其中1匹马在完成赛程后由于后躯肌肉僵硬,被诊断出患有运动性横纹肌溶解症,该马匹在55 km时血清CK活性达到7 717 U/L,AST活性在恢复18 h后最高,达到849 U/L。
4 缓解马运动氧化应激的营养策略
生物体内有酶类和非酶类2种抗氧化系统,酶类系统包括SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶,非酶类系统包括维生素C、维生素E、α-硫辛酸、类胡萝卜素、谷胱甘肽(GSH)、褪黑素以及微量元素铜(Cu)、锌(Zn)、硒(Se)等。在动物生产中,当机体发生氧化应激时,可以通过添加抗氧化物质,如油脂、维生素、微量元素和植物提取物等,调节动物机体的氧化还原平衡。
4.1 油脂
Klein等[46]给进行了12周轻度运动的马匹补充共轭亚油酸(CLA),与对照组(补充豆油)相比,血清CCO活性(线粒体功能的标志)升高;血清中SOD、GSH-Px活性在运动后显著升高,血清CK活性(肌肉损伤的标志)从第1周到第12周呈现先显著下降后显著增加的趋势,表明补充CLA可能导致线粒体适应,并防止轻度运动马的骨骼肌肌纤维损伤。过氧化物酶体增殖物激活受体共激活因子-1α(PGC-1α)通常被称为线粒体生物发生的“主调节因子”,是启动线粒体扩张的主要蛋白[47]。据报道,补充CLA增强了体外和体内PGC-1α蛋白的表达[48-49]。此外,CLA通过激活核呼吸因子1(Nrf1)和线粒体转录因子A(Tfam)放大线粒体DNA的转录和翻译[48⇓-50]。Mélo等[51]给训练和保养期马补充富含n-3、n-6多不饱和脂肪酸的混合物,结果表明,连续8周补充富含n-3、n-6多不饱和脂肪酸的混合物可提高保养期马血液中SOD活性,提高训练马血液中GSH-Px、SOD活性和尿酸含量。Sembratowicz等[52]用亚麻籽油(FO)替代大豆油(SO)饲喂马,马体内血浆葡萄糖、低密度脂蛋白胆固醇、TG含量以及总胆固醇/高密度脂蛋白比值显著降低,同时MDA含量也显著降低;此外,亚麻籽油还促进了血液中红细胞、淋巴细胞数目和溶菌酶活性升高,证明饲粮中添加亚麻籽油有助于改善马的血液学参数,增强抗氧化防御机制。
4.2 维生素
维生素是人体及动物体内可自行合成或从食品中获取的微量有机物,其中一些维生素因其较强的抗氧化活性而被广泛应用于人体及动物体内。维生素C和维生素E是主要的非酶抗氧化剂。维生素E作为一种抗氧化剂,具有很强的捕获自由基的能力,其通过保护组织脂质损伤来预防组织氧化。Nemec等[53]对40匹马进行了14 d补充维生素E[1.8 IU/(kg·d)]、辅酶Q10(CoQ10,800 mg/d)以及两者的组合,对研究了上述添加物对未进行运动训练的马在急性中度运动(10 min步行、5 min慢速小跑、10 min快速小跑和15 min疾驰后进行15~20 min步行)中氧化应激参数的影响,结果表明,补充安慰剂(2.6 mL/d石蜡油)和CoQ10的马运动后血浆MDA含量显著增加,且补充安慰剂的马血浆MDA含量在运动后24 h仍显著升高,而添加维生素E或维生素E+CoQ10的马在运动后血浆GSH-Px活性均显著升高。这些结果表明维生素E单独或与CoQ10联合使用均可防止未经训练的马在急性中度运动中的脂质过氧化。Fagan等[54]将18匹马分为3组,分别补充1 000 IU/d合成醋酸生育酚(SYN-L组)、4 000 IU/d合成醋酸生育酚(SYN-H组)和4 000 IU/d胶束RRR生育酚(为天然维生素E,NAT-H组),经过7 d的适应期后,马匹进行为期6周的高强度运动,与SYN-L组或SYN-H组相比,运动后NAT-H组马的血浆MDA含量较低,标准运动测试后2 h的血清AST活性显著降低。上述结果表明,天然维生素E对提高血清α-生育酚浓度和潜在地减少运动马氧化应激和肌肉损伤具有有益作用。Mularczyk等[55]从患代谢综合征(EMS)的马中分离出脂肪衍生的脂肪基质干细胞(ASC),测试虾青素是否可以保护ASC免受细胞凋亡、线粒体功能障碍和氧化应激,结果表明,虾青素处理通过改变促凋亡途径的标准化半胱天冬酶活性,显著降低了细胞凋亡;此外,虾青素通过调控相关主因子SOD1、SOD2、泛素蛋白连接酶(PARKIN)、PTEN诱导假定激酶1(PINK1)和线粒体融合蛋白1(MFN1)的表达,缓解了代谢综合征引起的氧化应激和线粒体动力学衰竭;虾青素通过刺激与氧化磷酸化(OXPHOS)机制相关的标记物恢复线粒体氧化磷酸化。综上可知,虾青素能抑制氧化应激,从而改善患有代谢综合征的马ASC的整体代谢状态。维生素C、维生素E和类胡萝卜素等抗氧化剂可以减少导致炎症和组织损伤的自由基的产生,对于降低氧化应激具有有益的作用。在饮食中添加抗氧化剂有助于预防疾病,有益于马匹的健康和维护,并可能提供治疗靶点[56]。
4.3 微量元素
微量元素参与抗氧化酶的活性构成,通过改变抗氧化酶的活性改变机体的抗氧化能力。硒主要以硒蛋白形式参与生命活动。当硒缺乏时,含硒抗氧化酶活性降低,动物易发生氧化应激反应。常见的抗氧化酶如GSH-Px、甲状腺素脱碘酶(Dios)和硫氧还蛋白还原酶(TrxR)等都属于硒蛋白家族[57]。硒作为抗氧化剂对马的影响是基于硒对GSH-Px的影响,它有助于马将脂质过氧化物还原为无毒脂质醇[58]。马匹经过运动训练后发现,与肌肉GSH-Px活性相比,血液GSH-Px活性不受训练的影响,但与在训练中接受0.1 mg/kg DM硒的马相比,接受0.3 mg/kg DM硒的马的全血GSH-Px活性更高,表明摄入一定量的硒可以缓解马匹运动过程中的氧化应激[33]。White等[34]给12匹经过短期高强度运动的马分别补充0.1和0.3 mg/kg DM硒后测定其基因表达和抗氧化酶活性变化,当马在静息状态下进行评估时,与NRC(2007)推荐的0.1 mg/kg DM硒相比,向成年马补充0.3 mg/kg DM硒没有显著优势,但在运动状态下骨骼肌中SOD2和TrxR1的表达水平以及红细胞和骨骼肌中GSH-Px活性因高水平硒的补充而得到改善,表明补充硒能够改善马在高强度运动后产生的氧化应激。综上所述,添加微量元素硒可以显著地、特异性地抑制马力竭运动后引起的氧化应激。
4.4 植物提取物
李连浩[13]试验发现,添加高浓度桑叶黄酮可以通过Nrf2信号通路调控下游抗氧化酶基因表达,进而促进抗氧化酶生成,提高蒙古马机体抗氧化性能,缓解蒙古马运动氧化应激导致的肌纤维损伤。曹迪[59]研究表明,向运动马饲粮中添加桑叶黄酮后,其通过Nrf2-ARE信号通路介导骨骼肌卫星细胞中的抗氧化基因SOD1、SOD2、GSH-Px1、GSH-Px3和TrxR1表达,进而提高抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性,降低MDA的含量,并通过提高细胞线粒体呼吸能力,最终缓解运动马骨骼肌卫星细胞的氧化损伤。在饲粮中添加氨基酸也可以缓解运动后的氧化应激。Bourebaba等[60]研究了从C. glomerata(一种丝状淡水绿色大型藻类)中提取得到的甲醇藻类提取物在马脂肪衍生的ASC上的离体抗氧化和抗炎潜力,结果显示,用过氧化氢(H2O2)处理ASC 1 h,使用显微镜评估细胞形态发现,活细胞数量显著减少,应激细胞形状出现不规则收缩,细胞表面以质膜的火山口状变形为主,使细胞具有多孔外观,细胞连接被缩回;用1%和5%的甲醇藻类提取物对ASC进行预处理,可以有效减少过氧化氢的毒性作用,具有明显更高的细胞汇合度,细胞显示出清晰的边缘。综上可知,甲醇藻类提取物可降低氧化应激,提高马脂肪来源的ASC的活力。Streltsova等[61]将9匹健康且未经训练的标准种母马分为3组,分别给予2 L水(W组)、橙皮提取物(O组)和红茶提取物(T组)对马进行增量运动测试(马在高速跑步机上以4 m/s的速度跑2 min,然后速度增加到6 m/s,后续每60 s增加1 m/s,直到马达到疲劳状态),测定橙皮提取物和红茶提取物对马运动性能和炎症细胞因子的影响,结果显示,橙皮提取物显著缩短了马运动后的耗氧量恢复时间[W组:(112±7) s;O组:(86±6) s;T组:(120±11) s];与W组和T组相比,O组的马血浆总蛋白含量有显著变化;与W组相比,T组和O组的马血细胞中γ-干扰素(IFN-γ)mRNA表达水平均较低,而IL-6 mRNA表达水平各组间无显著变化。以上这些结果表明,橙皮提取物和红茶提取物可能调节了细胞因子对剧烈运动的反应,橙皮提取物减少了马运动后的恢复时间,并可能潜在地提高了马进行后续高强度运动的能力。
5 小结
马在剧烈运动过程中由于所需能量增多,线粒体呼吸加快产生过量的氧自由基使机体发生氧化应激,严重影响马匹机体健康和运动性能,损害动物福利。马在运动过程中的氧化应激受品种、年龄、环境以及运动强度等因素的影响,适度的低氧训练有助于缓解马的氧化应激,且随着年龄的增加以及运动强度的增大,氧化应激表现更剧烈或倾向于更早发生。饲粮中添加抗氧化剂如油脂、维生素、微量元素、植物提取物等可以帮助缓解氧化应激对马匹造成的损害,其中亚麻籽油、共轭亚油酸、维生素C、维生素E、硒、橙皮提取物、红茶提取物、桑叶黄铜等缓解氧化应激具有明显效果。目前我国对于马的运动和氧化应激研究较少,后续工作应着重于科学训练与补充抗氧化剂相结合,并针对抗氧化剂具体用量和方法及其调控机理进行深入研究,为缓解马运动氧化应激提供理论依据,促进我国马产业竞技赛事标准化和规范化发展。