Chinese Journal of Animal Nutrition >

2024 , Vol. 36 >Issue 4: 2246 - 2261

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.195

RESEARCH PAPER

Effects of Tea Tree Oil on Growth Performance, Antioxidant Capacity, Immune Function and Intestinal Barrier Function of Weaned Piglets

  • TANG Xin , 1, 2 ,
  • LI Xiaobing 1 ,
  • TIAN Ying 1, 2 ,
  • LI Hongxi 1, 2 ,
  • LI Jiakai 1, 2 ,
  • CAO Chong , 1 ,
  • QIU Longxin , 1
Expand
  • 1 Fujian Provincial Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine and Biotechnology, College of Life Sciences, Longyan University, Longyan 364000, China
  • 2 College of Animal Science (College of Bee Science), Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
**CAO Chong, lecturer, E-mail: ;
QIU Longxin, professor, E-mail:

*Contributed equally

Received date: 2023-11-02

  Online published: 2024-04-15

Fold

Abstract

This study aimed to investigate the effects of tea tree oil (TTO) on the growth performance, antioxidant capacity, immune function and the intestinal barrier function of weaned piglets. One hundred and fifty weaned piglets at 21 days of age were selected and randomly divided into five groups, with three replicates in each group and 10 piglets in each replicate. Piglets in control group were fed a basal diet, while those in TTO groups were fed diets added 25, 50, 100 and 200 mg/kg TTO to the basal diet. The growth performance indexes, plasma antioxidant and immune indexes were measured after 28 days of feeding. And then the control group and 50 mg/kg TTO group were selected according to the results of growth performance and plasma antioxidant and immune indexes for the detection of intestinal mucosal antioxidant and immune indexes, hematoxylin-eosin (HE) stained sections to observe the intestinal tissue structure, and 16S rDNA sequencing to analyze the structure of intestinal flora. The results showed as follows: 1) the feed-to-gain ratio in all TTO groups were extremely significantly lower than those in the control group (P<0.01), and there was no significant difference among the TTO groups (P>0.05), but the lowest feed-to-gain ratio was found in the 50 mg/kg TTO group. 2) Plasma glutathione peroxidase (GSH-Px) content was extremely significantly increased (P<0.01) and malondialdehyde (MDA) content was extremely significantly decreased (P<0.01) in the 25, 50, 100 and 200 mg/kg TTO groups compared with the control group. 3) The plasma content of immunoglobulin G (IgG) in the 50, 100 and 200 mg/kg TTO groups was extremely significantly higher than that in the control group (P<0.01); the plasma content of immunoglobulin M (IgM) in the 25 and 200 mg/kg TTO groups was extremely significantly higher than that in the control group (P<0.01), and also the 100 mg/kg TTO group was significantly higher than the control group (P<0.05). 4) The ileal villi length/crypt depth ratio was extremely significantly elevated in the 50 mg/kg TTO group compared with the control group (P<0.01). 5) Compared with the control group, the content of reduced glutathione (GSH) in the mucosa of duodenum and ileum was extremely significantly increased (P<0.01), the content of GSH-Px in the mucosa of duodenum and jejunum was extremely significantly increased (P<0.01), the content of superoxide dismutase (SOD) in the mucosa of ileum was extremely significantly increased (P<0.01), and the content of malondialdehyde (MDA) in the mucosa of jejunum and ileum was extremely significantly decreased (P<0.01) in the 50 mg/kg TTO group. 6) The content of secretory immunoglobulin A (sIgA) in the duodenal and ileal mucosa in the 50 mg/kg TTO group was extremely significantly higher than that in the control group (P<0.01). 7) At the phylum level, the relative abundance of Firmicutes of the duodenum in the 50 mg/kg TTO group was significantly higher than that in the control group (P<0.05), and the relative abundance of Proteobacteria was significantly lower than that in the control group (P<0.05); at the genus level, the relative abundance of Clostridium of the duodenum and ileum in the 50 mg/kg TTO group was extremely significantly higher than that in the control group (P<0.01), and the relative abundance of Klebsiella of the duodenum, ileum and cecum was significantly lower than that in the control group (P<0.05). The 50 mg/kg TTO group showed extremely significant enhancement in amino acid metabolism, metabolism of cofactors and vitamins, and metabolism of terpenoids and polyketides compared with the control group (P<0.01). In conclusion, it can be seen that the addition of TTO to the diet can improve the growth performance of weaned piglets, enhance the antioxidant capacity and immune function of the body, strengthen the intestinal barrier function, and improve the health of piglets.

Key words： tea tree oil; weaned piglets; growth performance; antioxidant capacity; intestinal barrier

Cite this article

TANG Xin , LI Xiaobing , TIAN Ying , LI Hongxi , LI Jiakai , CAO Chong , QIU Longxin . Effects of Tea Tree Oil on Growth Performance, Antioxidant Capacity, Immune Function and Intestinal Barrier Function of Weaned Piglets[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2024 , 36(4) : 2246 -2261 . DOI: 10.12418/CJAN2024.195

随着我国生猪养殖业的不断发展,猪场普遍会对新生仔猪采取早期断奶来提高母猪的繁殖性能和仔猪的饲料利用率[1]。由于新生仔猪的免疫和消化系统发育并不完善,早期断奶应激容易引起仔猪腹泻、肠道菌群紊乱、免疫力低下、生长迟缓等,严重影响养猪业的经济效益[2]。在现今禁抗的大环境下,寻找绿色、安全、高效、无毒副作用的饲用抗生素替代产品对提高仔猪的生长性能和预防疾病具有重要的现实意义[3]。
茶树精油(tea tree oil,TTO)具有显著的抗炎[4]、抗氧化、抗菌[5]、抗病毒和提高免疫功能等作用[6-7],且无毒副作用,是理想的抗生素替代品。张玥等[8]研究发现,在饮水中加入250 mg/kg TTO可以提高北京鸭的生长性能、屠宰性能和鸭肉品质;周一凡等[9]证明,饲料中添加TTO可以提高克氏原螯虾的抗氧化能力与免疫能力,促进其生长;封飞飞[10]研究显示,TTO可以提高育肥猪的生长性能,改善猪肉品质。综上可知,TTO不仅具有免疫调节、抗氧化的效果,而且能促进畜禽的生长,改善其肉品质,是一种具有远大前景的可替代抗生素的天然饲料添加剂。因此,本试验在饲粮中添加不同水平的TTO,研究其对断奶仔猪生长性能、抗氧化能力、免疫功能以及肠道屏障功能的影响,以期为TTO作为饲料添加剂在生猪养殖上的开发与应用提供研究基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用TTO制剂为颗粒状饲料添加剂,其中TTO的含量为10%,试验设计中TTO的添加量均为TTO的实际添加量。

1.2 试验设计

选取体重相近的21日龄健康断奶仔猪150头,随机分为5组,每组3个重复,每个重复10头。对照组饲喂基础饲粮,4个TTO组分别在基础饲粮中添加25、50、100、200 mg/kg TTO。参照NRC(2012)营养标准并结合猪场实际情况配制满足断奶仔猪营养需要的基础饲粮,其组成及营养水平见表1。仔猪21~35日龄期间饲喂教槽料,后更换为保育料饲喂至试验结束。
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis)%

项目
Items		 含量 Content
教槽料
Creep diet		 保育料
Conservation
diet
原料 Ingredients
玉米 Corn 61.90
膨化玉米 Extruded corn 50.75
豆粕 Soybean meal 18.00
膨化大豆 Extruded soybean 22.00 10.00
小麦麸 Wheat bran 5.00
乳清粉 Dried whey 8.00
乳糖 Lactose 8.00
鱼粉 Fish meal 4.00 3.10
豆油 Soybean oil 1.50
氯化钠 NaCl 0.30
氯化胆碱 Choline chloride 0.10
氧化锌 ZnO 0.15
石粉 Limestone 0.70
磷酸氢钙 CaHPO4 1.50
L-赖氨酸 L-Lys 0.70
DL-蛋氨酸 DL-Met 0.30
预混料 Premix1) 2.00 2.00
合计 Total 100.00 100.00
营养水平 Nutrient levels2)
消化能 DE/(MJ/kg) 14.86 14.65
粗蛋白质 CP 20.65 19.54
粗纤维 CF 4.00 4.00
粗灰分 Ash 7.00 7.00
钙 Ca 0.81 0.71
总磷 TP 0.65 0.60
赖氨酸 Lys 1.40 1.40

1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of diets:VA 16 000 IU,VB1 4.4 mg,VB2 10 mg,VB6 6.3 mg,VB12 0.05 mg,VD3 3 000 IU,VE 90 IU,D-泛酸 D-pantothenic acid 35 mg,叶酸 folic acid 2.6 mg,烟酰胺 nicotinamide 80 mg,烟酸 nicotinic acid 60 mg,生物素 biotin 0.4 mg,Cu (as copper sulfate) 112.5 mg,Zn (as zinc oxide) 110 mg,Mn (as manganese sulfate) 63.5 mg,I (as potassium iodide) 0.66 mg,Se (as sodium selenite) 0.4 mg。

2)消化能为计算值,其余为实测值。DE was a calculated value, while the others were measured values.

1.3 饲养管理

各组预饲7 d基础饲粮后,开始按照试验设计在基础饲粮中添加TTO,记作正式试验第1天,正试期28 d。试验期间按照猪场常规饲养程序进行免疫和管理,仔猪自由采食和饮水,早、午、晚各投料1次,每次投喂量以料槽中略有剩余为准,详细记录仔猪每天的采食情况并记录圈舍早晚温度、相对湿度及仔猪健康状况、发病与死亡情况。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 饲粮营养成分

饲粮消化能参照NRC(2012)中各原料的消化能计算得出,粗蛋白质、粗纤维、粗灰分、钙、总磷、赖氨酸含量分别参照GB/T 6432—2018、GB/T 6434—2022、GB/T 6438—2007、GB/T 6436—2018、GB/T 6437—2018、GB/T 18246—2019中的方法测定。

1.4.2 生长性能

分别于正试期第1天和第28天对仔猪禁食不禁水称重,记录每组仔猪平均初始重和平均末重,计算出平均日增重(ADG),统计每日饲料消耗情况,计算平均日采食量(ADFI),根据ADG和ADFI计算料重比(F/G)。

1.4.3 血浆抗氧化和免疫指标

正试期第28天时,每组选取10头仔猪,前腔静脉采血5 mL置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管,静置15 min后3 000 r/min离心20 min后收集上清,-20 ℃冰箱保存,利用酶联免疫吸附检测(ELISA)试剂盒检测血浆中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)的含量。

1.4.4 肠道屏障功能指标

正试期第28天时,在对照组与50 mg/kg TTO组中随机选取6头体重相近的仔猪称重屠宰并对肠段、肠黏膜以及肠道内容物进行采集。

1.4.4.1 物理屏障功能指标

打开腹腔取出肠道,分离出十二指肠、空肠及回肠,各肠道分别剪取3~4 cm的肠段,4%多聚甲醛固定用于苏木精-伊红(HE)染色切片的制作。各肠段组织经过取材固定、脱水透明、石蜡包埋、切片、HE染色、脱水封片后,用显微镜镜检,图像采集分析,测定各肠段的绒毛长度(villus length)和隐窝深度(crypt depth),计算出绒毛长度与隐窝深度的比值,即绒毛隐窝比(V/C)。

1.4.4.2 化学屏障功能指标

采集所屠宰仔猪的十二指肠、空肠、回肠3个肠段的肠黏膜,加入适量生理盐水后冰水浴匀浆,充分混匀后3 000 r/min离心20 min,吸取上清液,用于检测十二指肠、空肠、回肠黏膜中还原型谷胱甘肽(GSH)、GSH-Px、超氧化物歧化酶(SOD)、MDA的含量。

1.4.4.3 免疫屏障功能指标

肠黏膜上清液的制备操作步骤同1.4.4.2。利用ELISA检测试剂盒检测十二指肠、空肠及回肠黏膜中分泌型免疫球蛋白A(sIgA)的含量。

1.4.4.4 微生物屏障功能指标

用2 mL冻存管收集所屠宰仔猪的十二指肠、空肠和回肠内容物,置于-80 ℃冰箱保存待测。采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法对肠道内容物基因组DNA进行提取,并使用引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')对V3~V4区域进行PCR扩增,构建文库,进而进行高通量测序。对下机数据进行质控,保留Clean data用于后期分析;通过FLASH软件进行序列拼接成Tags;将Tags按照97%序列相似性聚类生成操作分类单元(OTU)并与数据库比对、物种注释;基于OTU和注释结果进行样品物种组成分析,并对OTU代表序列进行分类学分析,在门和属分类水平上统计各样本的群落组成;使用PICRUSt法,通过比对KEGG数据库分析和预测菌群功能。

1.5 数据与统计分析

试验数据利用SPSS 27.0软件进行统计分析,其中生长性能、血浆抗氧化和免疫指标数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA),并用Duncan氏法进行组间的多重比较;肠道屏障功能指标数据进行独立样本t检验。结果均以“平均值±标准差”表示,以P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 TTO对断奶仔猪生长性能、血浆抗氧化和免疫指标的影响

由表2可知,各TTO组料重比均极显著低于对照组(P<0.01),其中以50 mg/kg TTO组最低,各TTO组间无显著差异(P>0.05),这表明在基础饲粮中添加TTO能够提高断奶仔猪的生长性能。进一步对断奶仔猪血浆抗氧化和免疫指标进行检测,结果显示,各TTO组血浆中GSH-Px的含量极显著高于对照组(P<0.01),但各TTO组间无显著差异(P>0.05);各TTO组血浆中MDA的含量极显著低于对照组(P<0.01),且100和200 mg/kg TTO组显著低于25和50 mg/kg TTO组(P<0.05),25与50 mg/kg TTO组间无显著差异(P>0.05),100与200 mg/kg TTO组间无显著差异(P>0.05);50、100、200 mg/kg TTO组血浆中IgG的含量极显著高于对照组(P<0.01),100和200 mg/kg TTO组极显著高于25和50 mg/kg TTO组(P<0.01),25与50 mg/kg TTO组间无显著差异(P>0.05),100与200 mg/kg TTO组间无显著差异(P>0.05);25、200 mg/kg TTO组血浆中IgM的含量极显著高于对照组(P<0.01),100 mg/kg TTO组显著高于对照组(P<0.05),这3个TTO组间无显著差异(P>0.05)。以上结果表明,饲粮中添加TTO可以提高断奶仔猪的抗氧化能力,减少过氧化物的产生,且具有一定免疫调节作用。目前研究表明,作为饲料添加剂,TTO的添加范围在50~150 mg/kg时对断奶仔猪的生长性能、抗氧化能力及肠道屏障功能有提高作用[11-12],根据本试验中生长性能与血浆抗氧化和免疫指标结果,结合TTO在实际生产中的添加成本,后续试验选择50 mg/kg TTO组作为试验组与对照组进行比较和评价。
表2 TTO对断奶仔猪生长性能的影响

Table 2 Effects of TTO on growth performance of weaned piglets

项目
Items		 对照组
Control group		 TTO组 TTO groups P值
P-value
25 mg/kg 50 mg/kg 100 mg/kg 200 mg/kg
平均日增重
ADG/g		 582.292
±57.234		 562.500
±38.672		 601.058
±76.845		 611.310
±11.619		 587.880
±35.005		 0.782
平均日采食量
ADFI/g		 1 370.127
±136.131		 1 241.488
±106.317		 1 278.613
±174.691		 1 348.869
±52.960		 1 250.429
±80.563		 0.590
料重比
F/G		 2.353
±0.046Bb		 2.206
±0.039Aa		 2.126
±0.021Aa		 2.206
±0.053Aa		 2.127
±0.051Aa		 <0.001

同行数据肩标无字母或相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。表3同。

In the same row, values with no letter or the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01). The same as Table 3.

表3 TTO对断奶仔猪血浆抗氧化和免疫指标的影响

Table 3 Effects of TTO on plasma antioxidant and immune indices of weaned piglets

项目
Items		 对照组
Control group		 TTO组 TTO groups P值
P-value
25 mg/kg 50 mg/kg 100 mg/kg 200 mg/kg
谷胱甘肽过氧化物酶
GSH-Px/(ng/mL)		 56.84±8.10Aa 66.42±8.65Bb 70.69±9.64Bb 70.90±11.20Bb 73.11±11.17Bb <0.001
丙二醛
MDA/(nmol/mL)		 6.03±1.08Cc 4.61±1.34Bb 4.40±1.22ABb 3.48±1.14Aa 3.60±1.37ABa <0.001
免疫球蛋白G
IgG/(mg/mL)		 14.65±2.34Aa 16.04±2.68ABab 17.44±2.71Bb 20.07±2.05Cc 20.54±2.08Cc <0.001
免疫球蛋白M
IgM/(mg/mL)		 14.36±2.47Aa 16.86±1.34Cc 15.03±1.89ABab 15.87±1.77ABCbc 16.55±2.20BCc <0.001

2.2 TTO对断奶仔猪肠道屏障功能的影响

2.2.1 TTO对断奶仔猪肠道物理和化学屏障功能的影响

由于仔猪断奶带来的应激加之初次接触固体饲料,极易造成肠黏膜结构的损伤和分泌功能的减弱。通过对肠绒毛结构进行观察发现,在50 mg/kg TTO的作用下,断奶仔猪回肠的绒毛隐窝比极显著高于对照组(P<0.01),十二指肠、空肠的绒毛隐窝比虽高于对照组,但差异不显著(P>0.05)(表4);肠黏膜抗氧化指标结果(表5)显示,与对照组相比,50 mg/kg TTO组十二指肠、回肠黏膜中GSH的含量极显著升高(P<0.01),十二指肠、空肠黏膜中GSH-Px的含量极显著升高(P<0.01),回肠黏膜中SOD的含量极显著升高(P<0.01),空肠及回肠黏膜中MDA的含量极显著降低(P<0.01)。以上结果表明TTO不仅对断奶仔猪肠绒毛结构具有改善效果,还可以提高肠道黏膜的抗氧化能力,进而增强肠道屏障功能。
表4 TTO对断奶仔猪肠道绒毛隐窝比的影响

Table 4 Effects of TTO on intestinal villi length/crypt depth ratio of weaned piglets

项目
Items		 对照组
Control group		 50 mg/kg TTO组
50 mg/kg TTO group		 P值
P-value
十二指肠 Duodenum 1.64±0.54 1.68±0.99 0.825
空肠 Jejunum 1.67±0.41 1.75±0.37 0.393
回肠 Ileum 1.42±0.24 1.80±0.53** <0.001

50 mg/kg TTO组数据肩标“*”表示与对照组差异显著(P<0.05),肩标“**”表示与对照组差异极显著(P<0.01)。下表同。

There was a significant difference between the 50 mg/kg TTO group and the control group when the shoulder of the 50 mg/kg TTO group value marked with “*” (P<0.05), and there was an extremely significant difference between the 50 mg/kg TTO group and the control group when the shoulder of the 50 mg/kg TTO group value marked with “**” (P<0.01). The same as below.

表5 TTO对断奶仔猪肠黏膜抗氧化指标的影响

Table 5 Effects of TTO on intestinal mucosal antioxidant indices of weaned piglets

项目
Items		 对照组
Control group		 50 mg/kg TTO组
50 mg/kg TTO group		 P值
P-value
十二指肠 Duodenum
还原型谷胱甘肽 GSH/(μg/g) 1 771.37±224.92 2 213.76±337.54** 0.001
谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px/(ng/g) 729.35±68.70 864.65±96.97** <0.001
超氧化物歧化酶 SOD/(ng/g) 2 542.05±193.22 2 736.98±279.87 0.060
丙二醛 MDA/(nmol/g) 82.21±9.83 73.50±13.62 0.086
空肠 Jejunum
还原型谷胱甘肽 GSH/(μg/g) 2 385.56±213.25 2 528.90±215.40 0.116
谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px/(ng/g) 933.42±121.08 1 151.56±93.60** <0.001
超氧化物歧化酶 SOD/(ng/g) 2 929.96±283.60 3 111.43±308.49 0.148
丙二醛 MDA/(nmol/g) 113.27±14.93 89.15±13.72** <0.001
回肠 Ileum
还原型谷胱甘肽 GSH/(μg/g) 1 944.44±246.05 2 475.02±238.34** <0.001
谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px/(ng/g) 935.50±102.07 994.31±110.99 0.190
超氧化物歧化酶 SOD/(ng/g) 2 519.00±310.48 2 990.63±327.47** 0.002
丙二醛 MDA/(nmol/g) 95.68±9.95 69.02±14.14** <0.001

2.2.2 TTO对断奶仔猪肠道免疫屏障功能的影响

仔猪断奶时免疫系统发育并不完善,极易受到外界病原物质的入侵,造成仔猪的腹泻、生长抑制甚至死亡等危害[13]。本试验通过对断奶仔猪肠黏膜sIgA含量进行分析发现,在50 mg/kg TTO的作用下,断奶仔猪十二指肠及回肠黏膜中sIgA的含量极显著升高(P<0.01)(表6),提示TTO具有潜在的免疫增强作用。
表6 TTO对断奶仔猪肠黏膜sIgA含量的影响

Table 6 Effects of TTO on intestinal mucosal sIgA content of weaned pigletsμg/g

项目
Items		 对照组
Control group		 50 mg/kg TTO组
50 mg/kg TTO group		 P值
P-value
十二指肠 Duodenum 257.87±27.01 328.20±39.55** <0.001
空肠 Jejunum 403.27±31.75 391.86±39.15 0.441
回肠 Ileum 320.37±29.67 370.15±44.14** 0.004

2.2.3 TTO对断奶仔猪微生物屏障功能的影响

2.2.3.1 TTO对肠道菌群组成的影响

为探究TTO对断奶仔猪肠道微生物屏障功能的调控作用,本试验通过16S rDNA高通量测序技术,分别对断奶仔猪十二指肠、空肠及回肠菌群组成进行了分析。由图1可知,50 mg/kg TTO组十二指肠、空肠、回肠的菌群各自聚集且与对照组距离较远,表明50 mg/kg TTO组断奶仔猪肠道菌群组成与对照组差异较大[十二指肠:置换多元方差分析(PERMNOVA),R=0.208 6,P=0.001;空肠:PERMNOVA,R=0.271 4,P=0.001;回肠:PERMNOVA,R=0.242 8,P=0.001],提示TTO对断奶仔猪肠道菌群组成有一定程度的影响。
图1 断奶仔猪肠道菌群主坐标分析图

Fig.1 Principal coordinate analysis diagrams of intestinal flora of weaned piglets

2.2.3.2 TTO对肠道菌群物种丰富度的影响

由图2可知,在门水平上,2组断奶仔猪十二指肠中主要优势菌门有厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、弯曲菌门(Campilobacterota)、拟杆菌门(Bacteroidota);空肠中的主要优势菌门为Firmicutes、Proteobacteria、Campilobacterota及放线菌门(Actinobacteriota);回肠中Firmicutes、Proteobacteria、Campilobacterota和蓝藻门(Cyanobacteria)为优势菌门。对优势菌门进行差异分析(表7、表8、表9)发现,50 mg/kg TTO组十二指肠、回肠中Firmicutes的相对丰度高于对照组,2组在十二指肠中的差异达到显著水平(P<0.05),而空肠中Firmicutes的相对丰度则极显著低于对照组(P<0.01),十二指肠中Proteobacteria的相对丰度显著低于对照组(P<0.05),空肠中Campilobacterota的相对丰度显著高于对照组(P<0.05),回肠中Campilobacterota的相对丰度显著低于对照组(P<0.05),空肠中Actinobacteriota的相对丰度显著高于对照组(P<0.05),回肠中Cyanobacteria的相对丰度显著低于对照组(P<0.05)。
图2 断奶仔猪肠道菌群在门水平上的组成

Acidobacteriota:酸杆菌门;Actinobacteriota:放线菌门;Armatimonadota:装甲菌门;Bacteroidota:拟杆菌门;Bdellovibrionota:蛭弧菌门;Campilobacterota:弯曲菌门;Chloroflexi:绿弯菌门;Cyanobacteria:蓝藻门;Dadabacteria:达达菌门;Deferribacterota:脱铁杆菌门;Deinococcota:奇异球菌门;Dependentiae:依附菌门;Desulfobacterota:脱硫杆菌门;Elusimicrobiota:迷踪菌门;Euryarchaeota:广古菌门;Fibrobacterota:纤维杆菌门;Firmicutes:厚壁菌门;Fusobacteriota:梭杆菌门;Gemmatimonadota:芽单胞菌门;Marinimicrobia:海微菌门;Myxococcota:黏球菌门;Nitrospirota:硝化螺旋菌门;Others:其他菌门;Patescibacteria:髌骨细菌门;Planctomycetota:浮霉菌门;Proteobacteria:变形菌门;SAR324:海洋细菌门;Spirochaetota:螺旋体门;Synergistota:互养菌门;Thermoplasmatota:热源菌门;Verrucomicrobiota:疣微菌门。

Fig.2 Composition of intestinal flora at phylum level of weaned piglets

表7 十二指肠中在门水平上相对丰度排名前10的菌群

Table 7 Relative abundances of top ten flora in duodenum at phylum level

项目
Items		 对照组
Control group		 50 mg/kg TTO组
50 mg/kg TTO group		 P值
P-value
厚壁菌门 Firmicutes 0.508 2±0.336 4 0.686 8±0.161 5* 0.012
变形菌门 Proteobacteria 0.358 8±0.300 6 0.209 1±0.178 4* 0.023
弯曲菌门 Campilobacterota 0.084 8±0.093 1 0.055 5±0.051 9 0.139
拟杆菌门 Bacteroidota 0.023 2±0.030 1 0.019 0±0.022 5 0.539
放线菌门 Actinobacteriota 0.007 8±0.004 3 0.018 6±0.016 1** <0.001
蓝藻门 Cyanobacteria 0.007 2±0.004 3 0.002 3±0.002 5** <0.001
梭杆菌门 Fusobacteriota 0.003 9±0.008 3 0.002 2±0.001 9 0.284
螺旋菌门 Spirochaetota 0.001 6±0.003 3 0.000 5±0.001 2 0.085
髌骨细菌门 Patescibacteria 0.000 2±0.000 3 0.001 7±0.002 1** <0.001
脱硫杆菌门 Desulfobacterota 0.000 6±0.000 4 0.000 4±0.000 5 0.059
表8 空肠中在门水平上相对丰度排名前10的菌群

Table 8 Relative abundances of top ten flora in jejunum at phylum level

项目
Items		 对照组
Control group		 50 mg/kg TTO组
50 mg/kg TTO group		 P值
P-value
厚壁菌门 Firmicutes 0.855 6±0.230 3 0.591 6±0.313 9** <0.001
变形菌门 Proteobacteria 0.110 0±0.224 0 0.243 9±0.302 4 0.057
弯曲菌门 Campilobacterota 0.007 3±0.011 5 0.078 0±0.188 0* 0.049
放线菌门 Actinobacteriota 0.010 8±0.009 0 0.028 4±0.037 6* 0.018
拟杆菌门 Bacteroidota 0.005 7±0.002 8 0.032 1±0.062 5* 0.028
蓝藻门 Cyanobacteria 0.008 9±0.005 0 0.013 5±0.022 5 0.282
梭杆菌门 Fusobacteriota 0.000 2±0.000 2 0.003 5±0.002 5** <0.001
螺旋菌门 Spirochaetota 0.000 0±0.000 0 0.001 9±0.005 4 0.071
髌骨细菌门 Patescibacteria 0.000 5±0.000 6 0.001 4±0.001 4** 0.002
脱硫杆菌门 Desulfobacterota 0.000 4±0.000 2 0.001 2±0.002 5 0.101
表9 回肠中在门水平上相对丰度排名前10的菌群

Table 9 Relative abundances of top ten flora in ileum at phylum level

项目
Items		 对照组
Control group		 50 mg/kg TTO组
50 mg/kg TTO group		 P值
P-value
厚壁菌门 Firmicutes 0.628 9±0.296 5 0.756 5±0.290 8 0.098
变形菌门 Proteobacteria 0.234 0±0.313 3 0.218 5±0.279 3 0.841
弯曲菌门 Campilobacterota 0.072 0±0.157 6 0.011 8±0.014 9* 0.046
蓝藻门 Cyanobacteria 0.037 0±0.075 0 0.000 5±0.000 4* 0.012
拟杆菌门 Bacteroidota 0.012 7±0.013 7 0.006 9±0.005 4* 0.039
放线菌门 Actinobacteriota 0.007 2±0.002 9 0.002 8±0.003 1** <0.001
梭杆菌门 Fusobacteriota 0.006 4±0.012 0 0.001 6±0.001 6* 0.036
脱硫杆菌门 Desulfobacterota 0.000 5±0.000 3 0.000 4±0.000 8 0.343
螺旋菌门 Spirochaetota 0.000 3±0.000 7 0.000 0±0.000 1* 0.029
疣微菌门 Verrucomicrobiota 0.000 1±0.000 0 0.000 2±0.000 2** 0.006
由图3可知,在属水平上,2组断奶仔猪十二指肠中主要优势菌属有梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、埃希氏菌-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)等;空肠中主要优势菌属有Clostridium、Lactobacillus、Escherichia-Shigella、Klebsiella、链球菌属(Streptococcus);回肠中主要优势菌属有Clostridium、Escherichia-Shigella、Lactobacillus、Streptococcus、Terrisporobacter。对优势菌属进行差异分析(表10、表11、表12)发现,与对照组相比,50 mg/kg TTO组3个肠段中Clostridium的相对丰度均高于对照组,且2组在十二指肠、回肠中的差异达到极显著水平(P<0.01),3个肠段中Lactobacillus的相对丰度均极显著低于对照组(P<0.01),且Klebsiella的相对丰度均显著低于对照组(P<0.05)。
图3 断奶仔猪肠道菌群在属水平上的组成

Campylobacter:弯曲杆菌属;Citrobacter:柠檬酸杆菌属;Clostridium:梭状芽孢杆菌属;Escherichia-Shigella:埃希氏菌-志贺氏菌属;Gemella:孪生菌属;Hafnia-Obesumbacterium:肥杆菌属;Helicobacter:螺杆菌属;Klebsiella:克雷伯氏菌属;Lactobacillus:乳杆菌属;Mycoplasma:支原体属;Others:其他菌属;Prevotella:普雷沃氏菌属;Romboutsia:罗姆布茨菌属;Streptococcus:链球菌属;Terrisporobacter:土孢杆菌属。

Fig.3 Composition of intestinal flora at genus level of weaned piglets

表10 十二指肠中在属水平上相对丰度排名前10的菌群

Table 10 Relative abundances of top ten flora in duodenum at genus level

项目
Items		 对照组
Control group		 50 mg/kg TTO组
50 mg/kg TTO group		 P值
P-value
梭状芽孢杆菌属 Clostridium 0.087 5±0.070 5 0.417 6±0.199 4** <0.001
乳杆菌属 Lactobacillus 0.357 1±0.374 1 0.051 4±0.064 1** <0.001
埃希氏菌-志贺氏菌属Escherichia-Shigella 0.159 8±0.212 1 0.166 9±0.181 5 0.890
克雷伯氏菌属 Klebsiella 0.121 2±0.221 3 0.012 7±0.021 9* 0.012
弯曲杆菌属 Campylobacter 0.032 3±0.028 0 0.048 2±0.046 8 0.116
支原体属 Mycoplasma 0.003 9±0.006 3 0.074 6±0.160 6* 0.023
螺杆菌属 Helicobacter 0.052 5±0.070 6 0.007 2±0.012 7** 0.002
链球菌属 Streptococcus 0.008 0±0.003 2 0.045 2±0.033 5** <0.001
柠檬酸杆菌属 Citrobacter 0.039 0±0.065 7 0.005 3±0.008 3** 0.009
土孢杆菌属 Terrisporobacter 0.007 1±0.006 2 0.023 0±0.021 7** <0.001
表11 空肠中在属水平上相对丰度排名前10的菌群

Table 11 Relative abundances of top ten flora in jejunum at genus level

项目
Items		 对照组
Control group		 50 mg/kg TTO组
50 mg/kg TTO group		 P值
P-value
梭状芽孢杆菌属 Clostridium 0.247 9±0.286 9 0.346 7±0.335 3 0.225
乳杆菌属 Lactobacillus 0.486 3±0.355 8 0.061 4±0.077 3** <0.001
埃希氏菌-志贺氏菌属Escherichia-Shigella 0.004 5±0.002 9 0.213 3±0.296 7** <0.001
克雷伯氏菌属 Klebsiella 0.097 5±0.220 0 0.008 8±0.010 7* 0.035
链球菌属 Streptococcus 0.015 5±0.012 3 0.065 5±0.084 9** 0.003
支原体属 Mycoplasma 0.042 2±0.098 3 0.011 5±0.048 5 0.132
弯曲杆菌属 Campylobacter 0.004 6±0.006 7 0.039 4±0.098 0 0.063
土孢杆菌属 Terrisporobacter 0.023 6±0.035 7 0.019 9±0.018 5 0.613
螺杆菌属 Helicobacter 0.002 7±0.004 9 0.038 6±0.091 4* 0.040
孪生菌属 Gemella 0.000 2±0.000 3 0.018 6±0.026 8** <0.001
表12 回肠中在属水平上相对丰度排名前10的菌群

Table 12 Relative abundances of top ten flora in ileum at genus level

项目
Items		 对照组
Control group		 50 mg/kg TTO组
50 mg/kg TTO group		 P值
P-value
梭状芽孢杆菌属 Clostridium 0.377 5±0.255 8 0.617 1±0.279 9** 0.001
埃希氏菌-志贺氏菌属Escherichia-Shigella 0.133 2±0.216 7 0.207 5±0.271 2 0.246
乳杆菌属 Lactobacillus 0.096 5±0.073 0 0.004 8±0.008 3** <0.001
链球菌属 Streptococcus 0.075 6±0.139 7 0.023 8±0.030 3 0.056
土孢杆菌属 Terrisporobacter 0.027 6±0.020 4 0.050 8±0.053 8* 0.033
弯曲杆菌属 Campylobacter 0.055 5±0.121 7 0.007 5±0.012 0* 0.040
克雷伯氏菌属 Klebsiella 0.050 3±0.106 4 0.002 7±0.002 0* 0.021
罗姆布茨菌属 Romboutsia 0.003 2±0.003 4 0.020 7±0.019 7** <0.001
柠檬酸杆菌属 Citrobacter 0.019 6±0.032 7 0.001 6±0.001 8** 0.005
螺杆菌属 Helicobacter 0.016 5±0.037 4 0.004 3±0.006 2 0.088

2.2.3.3 肠道微生物功能分析

利用PICRUSt对2组肠道微生物功能进行预测(图4),在KEGG的二级水平上进行检验分析,结果显示,在十二指肠中共有27条KEGG通路,有15条通路显著富集,其中50 mg/kg TTO组中免疫系统(immune system)、细胞运动(cell motility)、氨基酸代谢(amino acid metabolism)、环境适应(environmental adaptation)、其他次级代谢物的生物合成(biosynthesis of other secondary metabolites)、转录(transcription)、内分泌系统(endocrine system)、萜类化合物和聚酮酸的代谢(metabolism of terpenoids and polyketides)这8条通路的相对丰度极显著高于对照组(P<0.01);在空肠中共有28条KEGG通路,有18条通路显著富集,其中50 mg/kg TTO组中endocrine system、immune system、cell motility、amino acid metabolism、biosynthesis of other secondary metabolites、信号转导(signal transduction)、辅因子和维生素代谢(metabolism of cofactors and vitamins)、运输与分解(transport and catabolism)、感染性疾病:寄生虫(infectious diseases:parasitic)、能量代谢(energy metabolism)这10条通路的相对丰度极显著高于对照组(P<0.01),消化系统(digestive system)这1条通路的相对丰度显著高于对照组(P<0.05);回肠中共有26条KEGG通路,有12条通路显著富集,其中50 mg/kg TTO组中immune system、endocrine system、metabolism of terpenoids and polyketides、biosynthesis of other secondary metabolites这4条通路的相对丰度极显著高于对照组(P<0.01),transcription、environmental adaptation、amino acid metabolism 这3条通路的相对丰度显著高于对照组(P<0.05)。
图4 二级KEGG通路相关的预测基因相对丰度的差异

Amino acid metabolism:氨基酸代谢;Biosynthesis of other secondary metabolites:其他次级代谢物的生物合成;Cancers: Overview:癌症:概述;Carbohydrate metabolism:碳水化合物代谢;Cardiovascular diseases:心血管疾病;Cell growth and death:细胞的生死;Cell motility:细胞运动;Development:发展;Digestive system:消化系统;Endocrine system:内分泌系统;Energy metabolism:能量代谢;Environmental adaptation:环境适应;Excretory system:排泄系统;Folding, sorting and degradation:折叠、分类和降解;Glycan biosynthesis and metabolism:多糖合成和代谢;Immune diseases:免疫疾病;Immune system:免疫系统;Infectious diseases: Bacterial:感染性疾病:细菌;Infectious diseases: Parasitic:感染性疾病:寄生虫;Lipid metabolism:类脂(化合)物代谢作用;Membrane transport:膜输送;Metabolism of cofactors and vitamins:辅因子和维生素代谢;Metabolism of other amino acids:其它氨基酸代谢;Metabolism of terpenoids and polyketides:萜类化合物和聚酮酸的代谢;Neurodegenerative diseases:神经退行性疾病;Nucleotide metabolism:核苷酸代谢;Replication and repair:复制和修复;Signal transduction:信号转导;Signaling molecules and interaction:信号分子和相互作用;Transcription:转录;Translation:翻译;Transport and catabolism:运输和分解;Xenobiotics biodegradation and metabolism:异生素生物降解和代谢。

Fig.4 Differences in relative abundance of predictors of genes associated with secondary KEGG pathway

3 讨论

断奶是仔猪养殖过程中的关键环节,由于仔猪各系统发育并不完善,通常在断奶后会出现食欲下降、消化功能紊乱、免疫、抗氧化功能低下等应激反应,同时也带来了饲料利用率下降、腹泻率和死亡率提升等问题。李桂贤[14]、李慧敏[15]的试验证明TTO可以作为饲料添加剂提高仔猪的生长性能。本试验结果显示,TTO能够降低断奶仔猪的料重比,表明TTO对断奶仔猪的生长性能有提高作用,这也与上述研究结果一致。
肠道是动物机体重要的消化吸收器官。仔猪过早断奶会对肠道组织结构和肠黏膜造成损伤,紧密连接蛋白表达降低,致使肠上皮细胞间通透性增加,表现为绒毛变短、隐窝增生、消化吸收能力下降以及腹泻等,影响仔猪对营养物质的吸收。有研究报道TTO的主要活性单体松油烯-4-醇(terpinene-4-ol)能够调节脂多糖(LPS)诱导的肠上皮细胞稳态失衡,促进肠道上皮细胞增殖和肠干细胞分化,缓解免疫应激仔猪肠道损伤,改善肠道健康[16]。本试验结果显示,TTO能够提高断奶仔猪十二指肠、空肠及回肠的绒毛隐窝比,说明TTO具有改善断奶仔猪肠道组织结构、增强肠道屏障功能的作用。除改善肠道组织结构外,TTO还具有调节肠道菌群和促进消化吸收的作用[11]。本试验中,经TTO作用后,断奶仔猪肠道中Clostridium的相对丰度提高。Clostridium隶属Firmicutes,Firmicutes是影响猪饲料利用率的主要细菌,能够分解代谢食物中的纤维素并将其转化为短链脂肪酸(SCFAs),有利于肠道的消化吸收,可以提高猪的平均日增重和脂肪沉积[17]。本试验通过PICRUSt基因功能预测进一步证明了在TTO的作用下,断奶仔猪肠道氨基酸、萜类化合物、聚酮酸及辅因子和维生素等营养代谢功能得到提高。
机体氧化系统和抗氧化系统相互作用,维持自由基代谢的稳定平衡,保证机体的正常生长和免疫[18]。仔猪由于断奶和环境变化,加之本身抗氧化系统发育不完善,极易发生氧化应激反应。GSH、GSH-Px、SOD作为抗氧化系统的关键物质,其含量或活性的增加有助于机体清除自由基及有毒代谢产物,缓解氧化损伤,而MDA是生物体内脂质过氧化物的终产物且具有细胞毒性,MDA含量可间接反映组织过氧化损伤程度。TTO是一种具有抗氧化特性的天然化合物[19],主要为单萜类、倍单萜类及其醇类衍生物[20],包括松油烯-4-醇[21]、α-松油烯、γ-松油烯及异松油烯等单体化合物,已被广泛报道具有较强的抗氧化作用[22⇓-24]。本试验中有关血浆抗氧化指标和肠黏膜抗氧化指标的研究结果证明了TTO可以提高断奶仔猪的抗氧化能力,改善氧化应激状态。TTO参与断奶仔猪抗氧化作用的主要活性单体成分及具体作用机理还有待进一步研究。此外,肠道Clostridium代谢产生的SCFAs能够提升机体和肠道的抗氧化能力,有研究报道其家族中的丁酸梭菌具有显著提高断奶仔猪血清中GSH-Px、SOD含量和总抗氧化能力的作用[25]。TTO改善断奶仔猪氧化应激的作用也可部分归因于其提升了肠道中Clostridium的相对丰度。
仔猪生长初期免疫调控系统尚未完全建立,断奶容易导致仔猪生长发育停滞、免疫力低下、发病率和死亡率增加等情况的出现[26]。sIgA是肠道中最主要的免疫球蛋白,其分泌产生与肠道菌群紧密相连,不仅菌群本身可以提高sIgA含量[27],其代谢产物如SCFAs也能促进sIgA的分泌[28]。Clostridium是碳水化合物发酵产生SCFAs的主要菌群,研究表明SCFAs可作为肠黏膜上皮细胞的主要能量来源[29],还能提高免疫能力[30],减少各种炎症因子的生成[31]。Clostridium还可促进调节性T细胞(Treg)的积累,丰富转化生长因子-β,诱导T细胞增殖和分化,在肠道健康中发挥重要作用[32]。同时,Clostridium的主要发酵代谢产物丁酸还可以显著增加断奶仔猪血清中IgG含量[33]。本试验结果显示,TTO能够提高断奶仔猪血浆中IgG、IgM和肠黏膜中sIgA的含量,提示TTO对断奶仔猪具有一定的免疫调节作用,该作用与TTO提升肠道中Clostridium的相对丰度有关。
TTO具有较强的抑菌作用,其活性单体α-松油醇(α-terpineol)可以破坏部分致病菌的结构并且能够抑制其蛋白质与DNA的合成[34];1,8-桉叶素可以显著增加某些菌体细胞膜的通透性,降低菌体的耐盐能力;异松油烯可改变菌体细胞膜的流动性和特定物质的渗透性[35]。本试验结果表明,TTO显著降低了断奶仔猪肠道中条件致病菌Klebsiella的相对丰度,在一定程度上降低了致病的风险,改善了机体的健康状况,但是这一指标降低的具体原因和作用机制是否与上TTO中各单体的作用相关还需进一步研究。总体来说,TTO能够抑制部分有害菌的增殖,优化肠道微生物环境,增强机体的免疫功能。

4 结论

本试验结果表明,在饲粮中添加适量TTO可以提高断奶仔猪的生长性能,并且能够提高机体的抗氧化能力,改善肠道组织结构,并在增强机体免疫功能、肠道屏障功能方面具有重要作用,有助于改善仔猪断奶应激综合征,对仔猪的健康具有积极作用。因此,TTO作为饲料添加剂在断奶仔猪上具有较好的应用前景。

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