Chinese Journal of Animal Nutrition >

2024 , Vol. 36 >Issue 4: 2262 - 2276

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.196

RESEARCH PAPER

Effects of Dietary Docosahexaenoic Acid and Glycerol Monolaurate Enriched Complex on Semen Quality of Boars

  • WU Yanting , 1, 2 ,
  • YANG Zhipeng 1, 2 ,
  • LI Yamei 1, 2 ,
  • LI Hao 1, 2 ,
  • PENG Jian 1, 2, 3 ,
  • WANG Jihua 4 ,
  • WEI Hongkui , 1, 2, 3
Expand
  • 1 College of Animal Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
  • 2 The Cooperative Innovation Center for Sustainable Pig Production, Wuhan 430070, China
  • 3 Frontiers Science Center for Animal Breeding and Sustainable Production, Wuhan 430070, China
  • 4 Calid Biotech (Wuhan) Co., Ltd., Wuhan 430070, China
*associate professor, E-mail:

Received date: 2023-07-04

  Online published: 2024-04-15

Fold

Abstract

This experiment was conducted to study the effects of dietary docosahexaenoic acid (DHA) and glycerol monolaurate (GML) enriched complex on semen quality of boars. Forty-eight 19 to 24-month-old Duroc boars were randomly divided into 4 groups with 12 replicates per group and 1 pig per replicate. Pigs in the control group were fed a basal diet, and others in experimental groups 1, 2 and 3 were fed the basal diet supplemented with 0.18%, 0.24% and 0.30% DHA and GML enriched complex, respectively. The experiment lasted for 16 weeks. The results showed as follows: 1) the contents of DHA, n-3 polyunsaturated fatty acids and polyunsaturated fatty acids in sperm of experimental groups 1, 2 and 3 were significantly higher than those of the control group (P<0.01). 2) On week 16, the total sperm count and effective sperm count of experimental groups 1, 2 and 3 were significantly higher than those of the control group (P<0.05), and the sperm abnormal rate was significantly lower than that of the control group (P<0.01). 3) On weeks 4, 12 and 16, the sperm membrane integrity of experimental groups 1, 2 and 3 was significantly higher than that of the control group (P<0.01); on week 10, the sperm membrane integrity of experimental groups 2 and 3 was significantly higher than that of the control group (P<0.05). 4) The rotational motile sperm ratio in fresh semen of experimental group 1 was significantly lower than that of the control group (P<0.05); after stored 72 h, the rotational motile sperm ratio of experimental group 1 was significantly lower than that of the control group (P<0.01). 5) The serum malondialdehyde (MDA) content of experimental group 2 was significantly lower than that of the control group and experimental groups 1 and 3 (P<0.01). The fresh sperm superoxide dismutase (SOD) activity of experimental groups 1 and 2 was significantly higher than that of the control group (P<0.01), and the fresh seminal plasma SOD activity of experimental group 2 was significantly higher than that of the control group (P<0.05). After stored 24 h, the sperm MDA content of experimental groups 1, 2 and 3 was significantly lower than that of the control group (P<0.01). 6) The serum interleukin-6 (IL-6) content of experimental groups 1 and 2 was significantly lower than that of the control group (P<0.01). The fecal diamine oxidase (DAO) content of experimental groups 1 and 2 was significantly lower than that of the control group (P<0.01), and the fecal calprotectin content of experimental groups 1 and 2 was significantly lower than that of the control group (P<0.05). In conclusion, the DHA and GML enriched complex positively influence the semen quality of boars by affecting the sperm fatty acid composition, oxidative stress and inflammatory status.

Key words： boars; DHA; GML; semen quality; oxidative stress

Cite this article

WU Yanting , YANG Zhipeng , LI Yamei , LI Hao , PENG Jian , WANG Jihua , WEI Hongkui . Effects of Dietary Docosahexaenoic Acid and Glycerol Monolaurate Enriched Complex on Semen Quality of Boars[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2024 , 36(4) : 2262 -2276 . DOI: 10.12418/CJAN2024.196

优秀的公猪精液品质是影响人工授精站经济效益的重要因素,也是保障猪群繁殖性能的关键。公猪精液品质的评价指标主要包括精液体积、精子密度、精子活力以及精子畸形率等多个方面。公猪精子细胞膜含有丰富的n-3多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA),其影响精子膜的流动性和稳定性,进而影响精子的活力和生存能力[1]。目前已经证实,饲粮中添加适宜水平的二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)具有提高公猪精液品质的作用[2]。研究发现,公猪饲粮中添加60 g/d鱼油(含19.8 g n-3 PUFA)或金枪鱼油(含23.7 g n-3 PUFA)饲喂16周,显著增加了睾丸中各种磷脂成分含量,提高了脂肪酸中n-3 PUFA含量,尤其提高了DHA和二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid,DPA)含量;公猪饲粮中添加10.8和19.8 g/d DHA,第4周精子活力极显著增加,并且平均曲线运动速率、平均直线运动速率、平均路径速度显著增加[3]。Strzezek等[4]研究表明,富含DHA的鱼油虽然具有提高精子抗氧化能力的作用,但是鱼油本身容易发生脂质过氧化。因此,当公猪精子中PUFA含量过多时,会导致精子发生脂质过氧化[5],降低精子膜完整性,致使精子活力降低、精子形态异常,影响精液品质[5-6]。此外,由于海洋环境污染等问题,海洋鱼类来源DHA的产量和质量的风险问题也逐渐显现。与鱼类DHA相比,藻类DHA更容易被动物机体吸收和代谢,具有较高的生物利用度、安全性和稳定性[7]。裂壶藻是DHA等PUFA的初级生产者,DHA含量达到总脂肪酸的35%以上,且由于其具有生长所需营养要求简单、生长环境可控等优势,已成为海洋来源n-3 PUFA的优质替代来源[8]。
此外,公猪精液品质与肠道通透性标志物含量和炎症状态显著相关,表明肠道炎性反应和屏障功能对公猪精液质量具有显著影响[9]。月桂酸单甘酯(glycerol monolaurate,GML)具有无毒、无害、无残留、高效广谱抗菌及抗炎等多种营养作用[10],可以改善畜禽的肠道健康状态[11⇓-13]。有研究报道,饲粮中添加GML可以改善断奶仔猪肠道微生物群落,提高仔猪的生长性能[14]。此外,饲粮中添加GML可以降低血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,同时增加血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性,从而提高动物的抗氧化能力[15]。
本试验旨在研究饲粮中添加富含不同水平富含DHA和GML的复合物对公猪新鲜和常温保存精液品质的影响,以及对精子脂肪酸组成、机体氧化应激状况、肠道炎症状态和通透性的影响,为合理应用DHA和GML调控公猪精液品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计

选择48头9~24月龄、体重相近和试验前精液品质接近的杜洛克公猪,按照体重、年龄和初始精液品质接近的原则分为4组,每组12个重复,每个重复1头猪。试验期16周,采精频率6 d/次。对照组饲喂基础饲粮,3个试验组(试验1、2和3组)分别在基础饲粮中添加0.18%、0.24%和0.30%富含DHA和GML的复合物。富含DHA和GML的复合物中DHA含量为19.4%,GML含量为12.3%,DHA来源于裂壶藻粉。在试验过程中,对照组2头公猪由于疾病原因被淘汰。

1.2 试验饲粮

基础饲粮的营养水平达到或超过NRC(2012)推荐的种公猪营养需要量,基础饲粮组成及营养水平见表1。试验饲粮和富含DHA和GML的复合物脂肪酸组成见表2。
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)%

项目 Items 含量 Content
原料 Ingredients
小麦 Wheat 40.00
玉米 Corn 17.00
面粉 Flour 15.00
豆粕 Soybean meal 5.10
麸皮 Bran 15.90
石粉 Limestone 1.08
磷酸氢钙 CaHPO4 1.78
氯化钠 NaCl 0.50
可溶性纤维饲料 Soluble fiber feed 1.50
L-赖氨酸硫酸盐 L-Lys·H2SO4 (70%) 0.64
L-苏氨酸 L-Thr (98.5%) 0.21
蛋氨酸羟基类似物 HMTBA 0.11
L-色氨酸 L-Try (98%) 0.02
缬氨酸 Valine 0.02
甜菜碱 Betaine (96%) 0.15
氯化胆碱 Choline chloride (60%) 0.15
β-葡聚糖酶 β-glucanase 0.04
预混料 Premix1) 0.80
合计 Total 100.00
营养水平 Nutrient levels2)
消化能 DE/(MJ/kg) 12.77
粗蛋白质 CP 14.00
钙 Ca 0.90
总磷 TP 0.87
有效磷 AP 0.45
可消化赖氨酸 DLys 0.83
可消化蛋氨酸 DMet 0.34
可消化苏氨酸 DThr 0.65
可消化色氨酸 DTrp 0.17

1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of the diet:VA 15 000 IU,VD2 400 IU,VD3 50 μg,VK3 0.48 mg,VB1 2 mg,VB2 7.2 mg,VB6 3.6 mg,VB12 25 μg,生物素 biotin 0.48 mg,泛酸 pantothenic acid 25 mg,叶酸 folic acid 4 mg,烟酰胺 nicotinamide 400 mg,Cu 5 mg,Zn 50 mg,Mn 20 mg,I 0.14 mg,Se 0.15 mg。

2)营养水平依据德康农牧食品股份有限公司数据库计算。Nutrient levels were calculated based on the database of Dekang Agriculture and Food Co., Ltd..

表2 试验饲粮和富含DHA和GML的复合物脂肪酸组成

Table 2 Fatty acid composition of experimental diets and DHA and GML enriched complex%

项目
Items		 试验饲粮 Experimental diets 富含DHA和
GML的复合物
DHA and
GML enriched
complex
对照组
Control
group		 试验1组
Experimental
group 1		 试验2组
Experimental
group 2		 试验3组
Experimental
group 3
月桂酸 C12∶0 0.13 7.78 8.26 14.17 12.33
肉豆蔻酸 C14∶0 0.12 0.16 0.15 0.20 0.11
棕榈酸 C16∶0 16.59 18.13 15.75 16.07 6.03
棕榈油酸 C16∶1 0.37 0.64 0.36 0.41 ND
硬脂酸 C18∶0 2.32 2.46 2.07 2.15 0.30
油酸 C18∶1 n-9 16.76 12.34 14.94 14.66 ND
亚油酸 C18∶2 n-6 63.48 56.06 58.07 51.99 ND
α-亚麻酸 C18∶3 n-3 0.02 0.04 0.02 0.02 ND
花生四烯酸 C20∶4 n-6 ND 0.09 0.01 0.01 0.05
二十碳三烯酸 C20∶3 n-6 0.08 0.97 0.18 0.11 ND
二十碳五烯酸 C20∶5 n-3 0.13 0.29 0.16 0.16 4.89
二十二碳六烯酸 C22∶6 n-3 (DHA) ND 0.03 0.05 0.07 19.73
n-3多不饱和脂肪酸 n-3 PUFA 0.16 0.36 0.24 0.25 24.62
n-6多不饱和脂肪酸 n-6 PUFA 63.56 57.11 58.26 52.11 0.05
饱和脂肪酸 SFA 19.16 28.53 26.23 32.59 0.74
单不饱和脂肪酸 MUFA 17.13 12.98 15.30 15.07 ND
多不饱和脂肪酸 PUFA 63.69 57.39 58.48 52.35 24.67
n-6多不饱和脂肪酸/n-3多不饱和脂肪酸
n-6 PUFA/n-3 PUFA		 0.53 2.94 0.81 0.47 0.00

ND:未检出

not detected。

1.3 样品采集

饲粮样品:在试验期间,每隔14 d配制饲粮1次,每种试验饲粮配制300 kg。每次采集饲粮样品500 g,整个试验期结束后将饲粮混匀,按四分法取样500 g,-20 ℃冰箱保存,待测脂肪酸组成。
血清样品:在试验期第16周,通过大腿静脉穿刺法采血,室温静置,自然析出血清,在4 ℃条件下,3 000 r/min离心15 min,取上清分装于1.5 mL的EP管中,立即置于-20 ℃冰箱保存待用。
精液样品:在试验期第0(采精当天)、2、4、8、10、12、16周,使用徒手采精法采集公猪精液,并检测精液品质。取5 mL精液分装入10 mL离心管,在2 600 r/min离心8 min,取上清分装于1.5 mL的EP管中;倾倒出余下上清液,加入15 mL磷酸盐缓冲液(PBS),2 600 r/min离心8 min,倾倒出余下上清液,反复3次,即得精子样品,立即置于-80 ℃冰箱保存待用。
粪便样品:在试验期第16周,通过刺激肛门采集公猪粪便,使用无菌离心管收集,立即置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 脂肪酸组成测定

饲粮、原料和精子样品采用Folch等[16]所述方法测定脂肪酸组成。取出样品于37 ℃快速解冻,加入2 mL氯仿-甲醇(体积比2/1)混匀,室温下振荡15~20 min后静置24 h,之后于5 000 r/min离心10 min。吸取上清液于10 mL试管中,加入0.2倍体积超纯水振荡后静置,待分层后除去上清液,下层用氮气小心吹干,完成脂肪提取。加入2 mL 0.5 mmol/L氢氧化钠-甲醇溶液,轻轻振动,封口膜封口后置于沸水中水浴15 min。待冷却后加入2 mL 14%三氟化硼甲醇溶液,封口膜封口后置于沸水中水浴15 min。冷却后加入1 mL异辛烷,2 mL饱和氯化钠,剧烈振荡1 min,静置分层后取上清(异辛烷层),放置于瓶底铺满无水硫酸钠EP管中,吸取上清,用氮气吹干,再加入110 μL异辛烷溶解脂肪。吸取全部液体至含有内插管的液质小瓶中,用于气相色谱上机。结果用单个脂肪酸峰面积与总峰面积的百分比表示。饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)、n-6 PUFA、n-3 PUFA和PUFA的计算公式如下:
SFA=C12∶0+C14∶0+C16∶0+C18∶0;
MUFA=C16∶1+C18∶1 n-9;
n-6 PUFA=C18∶2 n-6+C20∶3 n-6+C20∶4 n-6;
n-3 PUFA=C18∶3 n-3+C22∶5 n-3+C22∶6 n-3;
PUFA=n-6 PUFA+n-3 PUFA。

1.4.2 精液品质检测方法

射精量:使用电子天平检测精液重量,转化为精液体积(1 g约为1 mL)。
精子密度:使用精子密度仪(SDM1,Minitube公司,德国)检测。
精子活力:新鲜精液与精液稀释剂(成都德麟科技有限公司)等温等比例(1∶9)稀释,取10 μL稀释后精液样品置于预热的37 ℃载玻片上,放置于精子质量分析仪(AndroVision,Minitube公司,德国),倍数调制200倍,随机选取5个视野,使用仪器记录3次精子活力数据,最终选取平均值为精子活力[17]。
精子畸形率:采用伊红染色法测定,取稀释精液1%伊红染色液混匀后制备精液涂片,风干固定后于400倍相差显微镜下观察200个精子,记录畸形精子数,计算精子畸形率[18]。畸形精子包括头部畸形、尾部畸形、近端原生质滴、远端原生质滴和头部分离等异常形态[19]。总精子数和有效精子数计算公式[20-21]如下:
总精子数=精液量×精子密度×精子活力;
有效精子数=精液量×精子密度×精子活力×(1-畸形率)。
精子膜完整性:采用低渗透肿胀试验(hypo-osmotic swelling test,HOST)测定[22]。取稀释精液50 μL,加37 ℃预温的低渗肿胀试剂1 mL,混匀后置于37 ℃水浴30 min后,在400倍相差显微镜下计数200条精子中弯尾精子的百分率。
精子运动能力参数:新鲜精液与精液稀释剂等温和等比例稀释(1∶9),取10 μL稀释后精液样本放在37 ℃预热的载玻片上,用CASA系统检测精子前向运动精子比率、快速运动精子比率、缓慢运动精子比率、旋转运动精子比例以及原地摆动精子比例等参数。

1.4.3 血清和精液中抗氧化指标、血清炎症细胞因子及粪便中肠道通透性和炎症指标测定

血清、精液和精浆中SOD活性和MDA含量采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定,所有试验操作按照试剂盒执行。血清中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)含量和粪便中D-乳酸(D-lactic acid,D-LAC)、二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)、钙卫蛋白(calprotectin)含量采用南京卡米洛生物工程有限公司试剂盒进行测定,试验操作按照试剂盒说明书进行。

1.5 数据统计分析

数据分析采用SPSS 23.0软件进行。精液量、精子密度、有效精子数、总精子数、MDA、SOD、TNF-α、IL-6、IL-1β等指标符合正态分布,其中精液量、精子密度、有效精子数、总精子数等指标使用two-way ANOVA程序检验数据,MDA、SOD、TNF-α、IL-6、IL-1β等指标使用one-way ANOVA程序检验数据,对于差异显著的数据进行Duncan氏法多重比较,数据以平均值±标准差(mean±SD)表示。对于非正态分布的数据,包括精子活力、畸形率和精子膜完整性采用Kruskal-Wallis分析,数据以50%[75%]呈现。0.05<P<0.10表示存在趋势,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 饲粮中添加富含DHA和GML的复合物对公猪精子脂肪酸组成的影响

由表3可知,试验2和3组的精子DHA、n-3 PUFA和PUFA含量均极显著高于对照组(P<0.01)。试验2组的精子二十碳三烯酸(C20∶3 n-6)含量显著高于对照组(P<0.05)。饲粮中添加富含DHA和GML的复合物对公猪精子n-6 PUFA/n-3 PUFA及n-6 PUFA、SFA和MUFA含量没有显著影响(P>0.05)。各组精子均未检出月桂酸(C12∶0)。
表3 饲粮中添加富含DHA和GML的复合物对公猪精子脂肪酸组成的影响

Table 3 Effects of dietary DHA and GML enriched complex on sperm fatty acid composition of boars%

项目
Items		 对照组
Control
group		 试验1组
Experimental
group 1		 试验2组
Experimental
group 2		 试验3组
Experimental
group 3		 P值
P-value
肉豆蔻酸 C14∶0 2.81±1.10 3.76±2.09 4.27±2.08 4.98±2.41 0.39
棕榈酸 C16∶0 46.19±4.80 39.43±12.16 38.29±2.82 42.44±3.27 0.36
硬脂酸 C18∶0 25.80±3.92 25.87±6.60 21.69±2.28 21.21±2.03 0.10
棕榈油酸 C16∶1 15.07±3.20 13.03±8.12 13.85±1.61 12.05±5.42 0.85
油酸 C18∶1 n-9 1.78±0.47 4.22±7.28 1.86±0.73 2.19±0.54 0.63
亚油酸 C18∶2 n-6 1.28±0.53 2.14±1.38 1.75±0.41 1.90±0.61 0.47
二十碳三烯酸 C20∶3 n-6 1.86±2.35b 3.77±1.46ab 5.22±1.63a 3.47±1.99ab 0.04
花生四烯酸 C20∶4 n-6 0.74±0.36 0.89±0.93 0.84±0.33 1.06±0.29 0.84
α-亚麻酸 C18∶3 n-3 0.27±0.20 0.37±0.04 0.41±0.05 0.40±0.06 0.13
二十碳五烯酸 C20∶5 n-3 0.83±1.23 0.37±0.28 0.89±0.33 1.23±0.38 0.17
二十二碳六烯酸 C22∶6 n-3 (DHA) 2.67±1.00Bb 4.92±1.75Bb 8.84±2.70Aa 9.07±2.85Aa <0.01
n-6多不饱和脂肪酸 n-6 PUFA 5.03±3.68 6.79±1.67 7.81±2.02 6.43±2.65 0.29
n-3多不饱和脂肪酸 n-3 PUFA 3.56±1.00Bb 7.33±4.32ABab 9.93±2.90Aa 10.69±2.57Aa <0.01
饱和脂肪酸 SFA 74.79±8.77 69.06±18.22 64.25±5.57 68.63±3.84 0.55
单不饱和脂肪酸 MUFA 16.85±2.77 17.25±15.21 15.71±1.30 14.24±4.93 0.93
多不饱和脂肪酸 PUFA 8.59±4.23Bb 13.24±3.72Bb 17.74±1.93Aa 17.12±3.91Aa <0.01
n-6多不饱和脂肪酸/n-3多不饱和脂肪酸
n-6 PUFA/n-3 PUFA		 0.99±0.78 1.03±0.77 0.69±0.33 0.44±0.22 0.20

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01),相同小写字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), while with the same small letter or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 饲粮中添加富含DHA和GML的复合物对公猪精液品质的影响

由表4可知,饲粮处理和饲喂时间对精子密度的影响没有显著的交互作用(P>0.05),但对精液量的影响有交互作用的趋势(P=0.06),对总精子数、精子活力、有效精子数的影响有显著的交互作用(P<0.05),对畸形率有极显著的交互作用(P<0.01)。从第10周开始,各组间的精液品质开始出现差异。在第10周时,试验3组的总精子数显著高于对照组和试验1组(P<0.05);在第12周时,试验3组的总精子数极显著高于对照组和试验1、2组(P<0.01);在第16周时,试验1、2和3组的总精子数均显著高于对照组(P<0.05)。在第10周时,试验1和3组的精子活力极显著高于对照组(P<0.01)。在第12周时,试验3组的精子畸形率极显著低于对照组(P<0.01);在第16周时,试验1、2和3组的精子畸形率均极显著低于对照组(P<0.01)。在第12周时,试验3组的有效精子数极显著高于对照组和试验1、2组(P<0.01);在第16周时,试验1、2和3组的有效精子数均显著高于对照组(P<0.05)。
表4 饲粮中添加富含DHA和GML的复合物对公猪精液品质的影响

Table 4 Effects of dietary DHA and GML enriched complex on semen quality of boars

项目
Items		 对照组
Control
group		 试验1组
Experimental
group 1		 试验2组
Experimental
group 2		 试验3组
Experimental
group 3		 P值 P-value
饲喂时间
Feeding time		 饲粮处理
Diet
treatment		 饲喂时间×
饲粮处理
Feeding time×
diet treatment
精液量 Ejaculate volume/mL
第0周 Week 0 203.60±51.31 198.67±61.44 201.33±69.36 247.50±82.75 <0.01 0.80 0.24
第2周 Week 2 194.60±62.78 236.92±75.64 194.33±61.08 245.67±59.29
第4周 Week 4 217.63±78.67 239.33±72.62 225.25±47.67 250.08±67.98
第8周 Week 8 260.63±86.34 290.30±66.86 246.60±78.26 265.09±70.96
第10周 Week 10 213.14±38.52 250.11±38.05 257.33±50.08 245.50±47.27
第12周 Week 12 230.33±51.81 230.74±79.22 231.96±88.51 213.73±56.66
第16周 Week 16 219.55±72.37 248.70±60.24 227.79±82.83 221.68±48.01
精子密度 Sperm concentration/(×108个/mL)
第0周 Week 0 5.22±0.85 4.15±0.96 4.89±2.03 4.16±1.39 <0.01 0.88 0.23
第2周 Week 2 3.55±1.55 3.89±1.06 3.29±1.39 3.48±1.13
第4周 Week 4 4.09±0.60 3.78±1.26 3.96±0.83 4.58±1.52
第8周 Week 8 3.74±1.00 3.95±1.06 4.12±1.39 3.97±1.15
第10周 Week 10 4.29±0.92 4.17±0.99 4.70±1.28 4.57±1.15
第12周 Week 12 4.28±0.93 3.92±1.20 4.41±1.16 4.71±1.38
第16周 Week 16 4.39±1.08 4.36±0.72 4.84±1.72 4.80±1.19
总精子数 Total sperm count/×108个
第0周 Week 0 870.86±249.62 668.85±223.76 734.84±295.90 874.22±331.72 <0.01 0.09 0.04
第2周 Week 2 569.48±262.52 724.10±279.50 508.27±252.67 729.82±265.48
第4周 Week 4 655.96±107.18 784.89±293.42 818.92±113.99 995.76±293.44
第8周 Week 8 680.53±114.90 982.41±226.87 848.59±235.74 961.50±317.01
第10周 Week 10 800.81±87.87b 924.60±188.33b 931.67±116.79ab 1120.10±260.94a
第12周 Week 12 762.41±168.26Bb 851.50±100.44Bb 860.73±114.28Bb 1083.53±137.59Aa
第16周 Week 16 750.52±136.27b 984.98±175.37a 963.63±188.77a 961.76±231.42a
精子活力 Sperm motility/%
第0周 Week 0 83.00[80.00,87.25] 82.00[80.00,94.50] 83.50[75.00,87.75] 85.50[82.25,87.00] <0.01 0.73 <0.01
第2周 Week 2 84.00[80.00,86.25] 80.25[83.50,88.00] 83.50[80.00,90.00] 86.00[84.00,87.75]
第4周 Week 4 90.00[85.00,90.00] 90.00[88.50,90.00] 90.00[96.00,90.00] 90.00[90.00,90.00]
第8周 Week 8 88.00[87.00,90.00] 89.00[87.25,90.00] 90.00[87.00,90.00] 90.00[89.50,90.00]
第10周 Week 10 82.00[82.50,87.25]Cc 90.00[88.50,90.00]ABab 85.00[84.00,87.00]BCbc 90.00[90.00,92.00]ABab
第12周 Week 12 88.00[86.75,90.00] 87.00[85.00,90.00] 86.00[83.00,88.00] 88.50[85.25,90.00]
第16周 Week 16 93.00[89.00,95.00] 89.00[86.00,92.00] 91.00[89.50,94.00] 90.00[87.00,92.00]
精子畸形率 Sperm abnormal rate/%
第4周 Week 4 15.00[10.75,18.50] 14.00[13.00,18.75] 6.50[11.75,20.25] 12.50[9.25,14.75] <0.01 0.12 <0.01
第8周 Week 8 16.00[11.00,19.00] 12.50[10.75,16.00] 18.00[12.75,19.75] 12.00[10.50,17.50]
第10周 Week 10 13.50[11.25,18.00] 13.00[11.50,15.50] 12.00[4.00,17.00] 15.00[12.00,17.00]
第12周 Week 12 12.00[11.00,18.50]Aa 9.50[6.25,13.25]ABab 10.00[5.50,15.50]ABab 7.00[5.50,9.25]Bb
第16周 Week 16 13.00[10.50,16.00]Aa 5.00[3.00,6.00]Bb 6.00[5.50,7.00]Bb 4.50[2.75,6.25]Bb
有效精子数 Effective sperm count/×108个
第4周 Week 4 579.72±75.33 660.57±149.51 575.61±156.91 782.79±232.60 <0.01 0.05 0.04
第8周 Week 8 566.03±129.38 809.58±101.26 761.26±204.17 874.07±269.68
第10周 Week 10 653.71±185.32 797.08±107.25 767.67±189.85 968.66±267.76
第12周 Week 12 710.73±65.41Bb 757.57±75.87Bb 796.75±108.07Bb 1 019.70±141.98Aa
第16周 Week 16 682.73±184.83b 931.94±162.05a 895.81±191.17a 910.39±229.55a

2.3 饲粮中添加富含DHA和GML的复合物对公猪精子膜完整性的影响

由表5可知,饲粮处理和饲喂时间对精子膜完整性有极显著的交互作用(P<0.01)。在第4、12和16周时,试验1、2和3组的精子膜完整性均极显著高于对照组(P<0.01)。在第10周时,试验2和3组的精子膜完整性显著高于对照组(P<0.05),试验1组的精子膜完整性与对照组无显著差异(P>0.05)。
表5 饲粮中添加富含DHA和GML的复合物对公猪精子膜完整性的影响

Table 5 Effects of dietary DHA and GML enriched complex on sperm membrane integrity of boars%

项目
Items		 对照组
Control
group		 试验1组
Experimental
group 1		 试验2组
Experimental
group 2		 试验3组
Experimental
group 3		 P值 P-value
饲喂时间
Feeding
time		 饲粮处理
Diet
treatment		 饲喂时间×
饲粮处理
Feeding time×
diet treatment
第4周 Week 4 37.00[33.25,39.75]Bb 53.00[48.00,60.00]Aa 55.50[52.25,62.00]Aa 51.00[43.50,67.50]Aa <0.01 <0.01 <0.01
第8周 Week 8 51.50[40.50,61.75] 53.00[51.50,57.50] 55.00[51.00,59.00] 65.00[53.00,71.00]
第10周 Week 10 49.00[43.25,53.25]b 55.00[52.00,59.00]ab 57.50[56.00,67.25]a 66.00[58.72,75.00]a
第12周 Week 12 45.50[41.00,53.75]Bb 65.00[61.50,71.75]Aa 72.00[67.50,73.00]Aa 71.00[62.00,79.00]Aa
第16周 Week 16 45.50[40.75,48.75]Bb 74.00[65.00,81.00]Aa 71.00[61.00,81.50]Aa 79.00[71.75,83.25]Aa

2.4 饲粮中添加富含DHA和GML的复合物对公猪新鲜和储存精液的精子运动学参数的影响

由表6可知,各组之间新鲜精液前向运动精子比率、快速运动精子比率、缓慢运动精子比率和原地摆动精子比率均无显著差异(P>0.05)。试验1组的新鲜精液旋转运动精子比率显著低于对照组(P<0.05),试验2和3组的新鲜精液旋转运动精子比率与对照组相比无显著差异(P> 0.05)。
表6 饲粮中添加富含DHA和GML的复合物对公猪新鲜精液的精子运动学参数的影响

Table 6 Effects of dietary DHA and GML enriched complex on sperm kinematic parameters in fresh semen of boars%

项目
Items		 对照组
Control group		 试验1组
Experimental group 1		 试验2组
Experimental group 2		 试验3组
Experimental group 3		 P值
P-value
前向运动精子比率 Progressive motile sperm ratio 89.27[86.78,92.54] 88.97[85.99,91.61] 88.86[87.76,93.53] 89.93[85.21,92.24] 0.97
快速运动精子比率 Fast Progressive motile sperm ratio 63.34[58.01,65.91] 56.08[52.47,65.84] 68.56[57.99,71.35] 63.78[61.68,76.27] 0.23
旋转运动精子比率 Rotational motile sperm ratio 5.32[2.03,7.51]a 1.59[0.64,2.09]b 2.72[1.88,4.56]ab 3.28[1.47,4.50]ab 0.01
缓慢运动精子比率 Slow motile sperm ratio 30.07[20.39,33.08] 29.52[18.29,40.78] 17.57[11.27,23.68] 20.30[10.30,31.39] 0.18
原地摆动精子比率 Local oscillating sperm ratio 1.85[1.41,2.13] 1.78[0.98,2.22] 1.81[0.61,2.21] 1.21[0.41,1.64] 0.22
由表7可知,在储存24和72 h后,各组之间精子前向运动精子比率和地摆动精子比率无显著差异(P>0.05)。在储存24 h后,试验3组的快速运动精子比率显著高于试验1组(P<0.05);在储存72 h后,各组之间快速运动精子比率无显著差异(P>0.05)。在储存24 h后,各组之间旋转运动精子比率无显著差异(P>0.05);在储存72 h后,试验1组旋转运动精子比率极显著低于对照组(P<0.01)。在储存24 h后,各组之间缓慢运动精子比率无显著差异(P>0.05);在储存72 h后,试验2和3组的缓慢运动精子比率极显著低于试验1组(P<0.01)。
表7 饲粮中添加富含DHA和GML的复合物对公猪储存精液的精子运动学参数的影响

Table 7 Effects of dietary DHA and GML enriched complex on sperm kinematic parameters in stored semen of boars%

项目
Items		 对照组
Control group		 试验1组
Experimental group 1		 试验2组
Experimental group 2		 试验3组
Experimental group 3		 P值
P-value
前向运动精子比率 Progressive motile sperm ratio
储存24 h Stored 24 h 88.30[79.95,89.60] 88.01[81.87,90.39] 88.03[85.63,90.01] 88.72[83.69,89.81] 0.95
储存72 h Stored 72 h 82.76[76.76,85.65] 82.14[80.82,88.37] 86.09[80.11,90.52] 87.64[83.69,89.69] 0.28
快速运动精子比率 Fast Progressive motile sperm ratio
储存24 h Stored 24 h 45.43[33.23,51.33]ab 43.26[36.14,54.09]b 57.20[48.78,65.54]ab 61.84[54.93,66.19]a 0.02
储存72 h Stored 72 h 41.32[36.66,56.14] 40.42[35.74,54.39] 45.86[42.76,64.87] 52.82[42.82,66.66] 0.22
旋转运动精子比率 Rotational motile sperm ratio
储存24 h Stored 24 h 2.01[1.45,4.18] 1.50[0.51,2.43] 2.41[0.91,3.48] 1.51[0.66,2.33] 0.31
储存72 h Stored 72 h 2.27[1.40,4.00]Aa 0.61[0.29,0.99]Bb 0.89[0.56,1.43]ABab 1.25[0.76,2.16]ABab <0.01
缓慢运动精子比率 Slow motile sperm ratio
储存24 h Stored 24 h 33.22[27.42,42.79] 16.42[10.58,32.35] 22.18[15.80,27.52] 17.69[10.09,25.96] 0.06
储存72 h Stored 72 h 30.53[23.74,41.67]ABab 42.77[32.56,46.10]Aa 21.02[10.40,23.71]Bb 23.64[11.17,32.76]Bb <0.01
原地摆动精子比率 Local oscillating sperm ratio
储存24 h Stored 24 h 3.21[1.84,4.37] 1.09[0.96,1.94] 1.62[0.87,2.09] 1.01[0.40,2.90] 0.05
储存72 h Stored 72 h 3.69[2.30,6.66] 3.22[1.71,5.19] 1.87[1.15,3.75] 2.68[0.97,5.38] 0.66

2.5 饲粮中添加富含DHA和GML的复合物对公猪血清、精子和精浆氧化应激状态的影响

由表8可知,试验2组的血清MDA含量极显著低于对照组和试验1、3组(P<0.01)。各组之间血清SOD活性无显著差异(P>0.05)。
表8 饲粮中添加富含DHA和GML的复合物对公猪血清MDA含量和SOD活性的影响

Table 8 Effects of dietary DHA and GML enriched complex on serum MDA content and SOD activity of boars

项目
Items		 对照组
Control group		 试验1组
Experimental group 1		 试验2组
Experimental group 2		 试验3组
Experimental group 3		 P值
P-value
丙二醛 MDA/(nmol/mL) 4.00±0.48Aa 3.75±0.69Aa 2.92±0.47Bb 3.99±0.22Aa <0.01
超氧化物歧化酶 SOD/(U/mL) 0.27±0.02 0.27±0.02 0.27±0.03 0.27±0.01 0.99
由表9可知,各组之间新鲜以及储存24和72 h后的精浆MDA含量均无显著差异(P>0.05)。试验2组的新鲜精浆SOD活性显著高于对照组(P<0.05),而储存24和72 h后,各组之间精浆SOD活性无显著差异(P>0.05)。试验2组的新鲜精子MDA含量极显著低于对照组(P<0.01),试验1和3组的新鲜精子MDA含量与对照组无显著差异(P>0.05),但试验3组的新鲜精子MDA含量极显著高于试验2组(P<0.01);在储存24 h后,试验1、2和3组的精子MDA含量均极显著低于对照组(P<0.01);储存72 h后,各组之间精子MDA含量无显著差异(P>0.05)。试验1和2组的新鲜精子SOD活性极显著高于对照组(P<0.01),但试验3组与对照组无显著差异(P> 0.05);而储存24和72 h后,各组之间精子SOD活性均无显著差异(P>0.05)。
表9 饲粮中添加富含DHA和GML的复合物对公猪新鲜和储存精液MDA含量和SOD活性的影响

Table 9 Effects of dietary DHA and GML enriched complex on MDA content and SOD activity in fresh and stored semen of boars

项目
Items		 对照组
Control group		 试验1组
Experimental group 1		 试验2组
Experimental group 2		 试验3组
Experimental group 3		 P值
P-value
精浆
Seminal plasma		 丙二醛含量 MDA/(nmol/mL)
新鲜 Fresh 1.91±0.47 1.82±0.42 2.06±0.26 2.00±0.83 0.76
储存24 h Stored 24 h 2.59±0.78 2.15±0.84 2.27±0.24 2.81±0.21 0.16
储存72 h Stored 72 h 3.65±2.04 3.38±0.86 2.61±0.88 2.89±0.40 0.27
超氧化物歧化酶 SOD/(U/mL)
新鲜 Fresh 1.3±0.06b 1.36±0.06ab 1.42±0.14a 1.31±0.13b 0.04
储存24 h Stored 24 h 0.46±0.45 0.68±0.14 0.72±0.13 0.52±0.16 0.08
储存72 h Stored 72 h 0.13±0.11 0.18±0.09 0.15±0.15 0.19±0.16 0.81
精子
Sperm		 丙二醛含量 MDA/(nmol/mL)
新鲜 Fresh 11.64±3.34Aa 8.55±1.52ABab 6.20±2.06Bb 9.33±1.77Aa <0.01
储存24 h Stored 24 h 14.82±5.46Aa 5.32±2.03Cc 5.48±2.42Cc 9.12±1.98Bb <0.01
储存72 h Stored 72 h 7.84±2.31 6.75±3.75 5.36±1.56 7.33±1.66 0.18
超氧化物歧化酶 SOD/(U/mL)
新鲜 Fresh 54.68±20.8Bb 89.26±15.58Aa 92.24±24.69Aa 72.65±20.44ABab <0.01
储存24 h Stored 24 h 50.16±10.84 43.48±7.58 53.67±20.48 54.07±16.80 0.46
储存72 h Stored 72 h 49.13±17.07 77.56±49.36 82.28±34.00 50.28±20.42 0.08

2.6 饲粮中添加富含DHA和GML的复合物对公猪血清炎症细胞因子含量的影响

由图1可知,各组之间血清TNF-α和IL-1β含量无显著差异(P>0.05)。试验1和2组的血清IL-6含量极显著低于对照组(P<0.01)。
图1 饲粮中添加富含DHA和GML的复合物对公猪血清炎症细胞因子含量的影响

数据柱标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01),相同小写字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下图同。

Fig.1 Effects of dietary DHA and GML enriched complex on serum inflammatory cytokines contents of boars

Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05), and with different capital letters mean significant difference (P<0.01), while with the same small letters or no letter mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.7 饲粮中添加富含DHA和GML的复合物对公猪粪便中肠道通透性和炎症指标的影响

由图2可知,各组之间粪便D-LAC含量无显著差异(P>0.05)。试验1和2组的粪便DAO含量极显著低于对照组(P<0.01),试验3组与对照组相比无显著差异(P>0.05)。试验1和2组的粪便钙卫蛋白含量显著低于对照组(P<0.05),试验3组与对照组相比无显著差异(P>0.05)。
图2 饲粮中添加富含DHA和GML的复合物对肠道通透性和炎症指标的影响

Fig.2 Effects of dietary DHA and GML enriched complex on fecal intestinal permeability and inflammation indices of boars

3 讨论

3.1 饲粮中添加富含DHA和GML的复合物对精子脂肪酸组成的影响

饲粮中的脂肪酸组成被认为会对单胃动物体组织中的脂肪酸组成产生直接影响。研究表明,饲粮中的n-3 PUFA可以被直接转入精子,增加公猪精子中n-3 PUFA比例,对精子正常功能具有重要作用[18,22]。有研究表明,在公猪饲粮中添加3%鱼油可显著提高精子中DHA含量(占总脂肪酸的33%~45%)。在公猪饲粮中添加含有0.21%和0.39% DHA的鱼油,也得到了相同的效果。本课题组前期研究发现,饲粮中添加富含DHA的微藻粉也同样显著增加了精子中DHA含量[2]。本试验结果发现,饲粮中添加富含DHA和GML的复合物提高了精子中PUFA含量,而对n-6 PUFA含量无显著影响。以上结果均证明了在公猪饲粮中添加富含DHA的饲料原料可以增加精子中DHA含量[23⇓-25]。值得注意的是,尽管饲粮中添加了GML,但在精子脂肪酸组成中并未检测到月桂酸。这一方面说明了公猪精子脂肪酸组成中,几乎不含有14个碳原子以下的脂肪酸;另一方面说明了GML并不会通过参与形成精子膜系统来影响公猪精液品质。

3.2 饲粮中添加富含DHA和GML的复合物对公猪精液品质的影响

本试验结果表明,饲粮中添加富含DHA和GML的复合物对公猪精液量和精子密度无显著影响。这与其他研究中报道的饲粮中添加富含DHA的饲料原料对公猪精液品质的影响结果相似,例如,在饲粮中添加100~300 g富含n-3 PUFA的亚麻籽油,或者在饲粮中添加富含DHA的鱼油并不影响公猪的精液量和精子密度[2,26-27]。
饲粮中添加富含DHA和GML的复合物12周及以上时,公猪精子畸形率降低。此外,有效精子数在第12和16周时出现了显著差异,与精子畸形率差异性结果一致。由于在此期间精液量、精子密度和精子活力均无差异,因此有效精子数的增加归功于精子畸形率的降低。在实验室前期研究中,饲粮中添加富含DHA的微藻粉在第10周有降低精子畸形率的趋势[2]。本试验在第10周也观测到精子畸形率降低的趋势,且在第16周出现极显著降低,说明添加富含DHA和GML的复合物具有降低精子畸形率的作用效果,但需要10周以上的添加时间。本试验仅在第10周观测到精子活力出现显著差异,这可能是由于个体间变异较大导致[18,28]。选择更大的样本数来研究精子活力的变化可能更具有代表性。
PUFA具有增加细胞膜的流动性、提高跨膜蛋白活性的分子特征,依据先前的研究报道,精子的前进速率及其活力与精子中的PUFA含量呈正相关[29-30]。本研究发现,对于新鲜精液而言,饲粮中添加富含DHA和GML的复合物仅对公猪新鲜精液的旋转精子比率有改善作用,但对于储存72 h后的精液而言,添加高水平富含DHA和GML的复合物(试验2和3组)对于旋转运动精子比率、快速运动精子比率和缓慢运动精子比率均有不同程度的改善。这些结果表明,饲粮中添加富含DHA和GML的复合物提高了公猪储存期精子活力。有研究在饲粮中添加富含DHA的亚麻籽油,发现储存72 h后精子活力也出现了显著升高[31]。因此,在常温储藏条件下,通过提高饲粮中n-3 PUFA含量对公猪精液品质的改善效果至少可以持续到72 h,这对当前规模化养殖普遍需要使用经过一定时间储藏的精液具有积极意义。

3.3 饲粮中添加富含DHA和GML的复合物改善公猪精液品质的可能机制

n-3 PUFA是精子质膜中的一类重要脂肪酸,其含量对精子膜完整性及精子的功能正常具有重要意义[32]。有关研究在饲粮中添加亚麻籽油和鱼油均发现,伴随着精子DHA含量的增加,精子膜完整性也得到提高[33-34]。在本研究中也得到了类似的结果,即随着精子脂肪酸组成的变化,精子膜完整性增加,证明了DHA含量升高可能与改善精子膜功能密切相关。有研究表明,DHA复合物富集于精子尾部,使尾部更易耐受低渗介质[35],该作用可能与本研究发现的精子畸形率改善和常温保存精液的运动学参数改善有关,但具有联系及作用机制尚需进一步研究。
当公猪精子中PUFA含量增加,而自身抗氧化能力不足时,则会导致精子发生脂质过氧化反应[5],反而降低精子膜完整性,致使精子活力降低、精子形态异常,影响精液品质[6,36]。因此,先前的研究已经指出,在提高公猪饲粮DHA含量时,应同时提高饲粮中具有抗氧化功能的添加剂含量[2]。本研究发现,饲粮中添加适宜水平的富含DHA和GML的复合物(试验1和2组)提高了精子和精浆的SOD活性,同时降低了精子和血清的MDA含量。考虑到机体氧化还原状态与炎性状态的相关性,我们认为上述变化可能得益于肠道屏障功能的改善,以及可能带来的系统性慢性炎性状态的改善。
值得注意的是,n-3 PUFA本身也具有通过基因表达调控上调抗氧化酶的功能。Safarinejad等[37]研究指出,DHA含量与SOD活性呈正相关,且添加鱼油增强了公猪精液中的SOD活性。因此,本研究结果中SOD活性的上升也可能与精子中DHA含量的升高有关。有意思的是,尽管饲粮中添加富含DHA和GML的复合物提高了精子SOD活性,但对血清SOD活性并没有显著影响。这可能是因为精子相较于肝脏等其他SOD来源的组织有更高的DHA含量,对于饲粮脂肪酸的调控更为敏感。此外,我们发现,尽管饲粮中添加高水平的富含DHA和GML的复合物(试验3组)提高精子SOD活性的作用与添加中、低水平的富含DHA和GML的复合物(试验1和2组)基本相当,但是精子MDA含量却较试验1和2组高。这表明了在本试验条件下,试验3组的DHA添加水平可能过高,有部分DHA发生了脂质过氧化,这也可能是高水平的富含DHA和GML的复合物进一步提高精子中DHA含量十分有限的重要原因。
值得注意的是,本试验中饲粮处理对于精子MDA含量的调控仅能持续到储存24 h,而对于精子SOD活性的调控作用甚至无法维持到储存24 h。这可能与成熟精子的基因转录处于关闭状态,DHA无法继续通过基因表达调控影响SOD的表达有关。这同时也说明了饲粮处理对于储存期精子运动学参数的改善,可能主要归功于精子膜脂肪酸组成改变,而不是精子氧化还原状态的变化。
n-3 PUFA可以通过多种途径调节机体的炎症和免疫反应。本研究结果与Kiecolt-Glaser等[38]发现的饲喂富含n-3 PUFA的鱼油导致血清IL-6含量显著降低试验的结果一致。有研究发现GML具有减轻机体炎症,提高机体免疫力的作用[39],在试验中使用5 μg/mL GML抑制了T淋巴细胞增殖的作用,当GML用量达到20 μg/mL时可以抑制上皮细胞炎症细胞因子产生[40]。郭锡钦等[14]研究表明,在饲粮中添加500和1 000 mg/kg GML显著提高了断奶仔猪生长性能,肠道IL-6基因表达水平降低。本研究也发现,饲粮中添加富含DHA与GML的复合物降低了公猪肠道炎性反应和肠道通透性。因此,本研究发现的血清IL-6含量的改变可能是由于DHA和GML共同作用引起的。

4 结论

公猪饲粮中添加0.18%~0.30%的富含DHA与GML的复合物10周以后,具有改善新鲜和常温保存精液品质的作用,其机制可能与精子脂肪酸含量的增加从而改善精子膜完整性有关。此外,富含DHA和GML的复合物对肠道屏障功能以及机体氧化应激和炎症状态的调控可能也发挥了一定作用。

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