Chinese Journal of Animal Nutrition >

2024 , Vol. 36 >Issue 4: 2331 - 2343

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.201

RESEARCH PAPER

Effects of Alginate Oligosaccharide on Growth Performance, Immune Organ Indices, Serum Antioxidant Indices and Intestinal Health of Broilers

  • HU Die , 1 ,
  • Alatengzhula 1 ,
  • CHENG Zhiqian 2 ,
  • ZHANG Meihong 1 ,
  • XIAO Yuxuan 1 ,
  • CHENG Gong 3 ,
  • HU Yongfei , 1
Expand
  • 1 State Key Laboratory of Animal Nutrition, College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China
  • 2 Huzhou Inspection and Quarantine Comprehensive Technical Service Center, Huzhou 313000, China
  • 3 State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China
*professor, E-mail:

Received date: 2023-10-25

  Online published: 2024-04-15

Fold

Abstract

The aim of this study was to reveal the effects of alginate oligosaccharide (AOS) on growth performance, immune organ indices, serum antioxidant indices and intestinal health of broilers. Sodium alginate was hydrolyzed to prepare AOS of different molecular weights with alginate lyase PDE9 at enzyme-activity units of 100, 200 and 800 U. The molecular weights of the prepared AOS were determined using high performance molecular exclusion chromatography. The weight-average molecular weights of the three AOS were 23 981, 5 038 and 3 766 u, which were sequentially labeled with high molecular weight, medium molecular weight and low molecular weight, respectively. Then a total of 280 male Arbor Acres (AA) broiler chickens of 1-day-old with the same body condition and similar body weight were randomly divided into 4 groups with 7 replicates per group and 10 chickens per replicate. Broilers in the control group (CON group) were fed a basal diet, and the others in experiment groups were fed the basal diet supplemented with 200 mg/kg AOS with low molecular weight (AL group), medium molecular weight (AM group) and high molecular weight (AH group), respectively. The experiment lasted for 40 days. The results showed as follows: 1) compared with CON group, the body weight of broilers at 40 days of age and the average daily gain (ADG) during 1 to 40 and 21 to 40 days of age in AL, AM and AH groups were significantly increased (P<0.05); the body weight of broilers at 20 days of age and ADG during 1 to 20 days of age in AL and AM groups were significantly increased (P<0.05), and the ratio of feed to gain (F/G) during 1 to 20 days of age was significantly decreased (P<0.05). 2) Compared with CON group, the liver index of broilers at 20 days of age in AL group was significantly decreased (P<0.05); the bursa of Fabricius index of broilers at 20 days of age in AM and AH groups was significantly increased (P<0.05). 3) Compared with CON group, the crypt depth (CD) in jejunum of broilers in AH group tended to be decreased (P=0.084), the mRNA relative expression levels of sodium-glucose cotransporter 1 (SGLT1), zinc transporter 1 (ZnT1), zonula occluden-1 (ZO-1), mucin-2, occludin in AH group were significantly increased (P<0.05), and the claudin-3 mRNA relative expression level in jejunum tended to be increased (P=0.081). 4) Compared with CON group, the mRNA relative expression levels of interleukin-10 (IL-10), interleukin-17 (IL-17) and interleukin-1β (IL-1β) in cecal tonsil of broilers in AH group were significantly decreased (P<0.05). 5) Compared with CON group, the β diversity of microbiota in cecum of broilers in AH group tended to be increased (P=0.055), and the relative abundances of Bacteroides, Ruminococcaceae_UCG-005, Ruminiclostridium, Phascolarctobacterium, Parasutterella, Campylobacter, Gallibacterium and Escherichia-Shigella in cecum in AH group were significantly increased (P<0.05). In conclusion, adding different molecular weights of AOS in diets can effectively improve the growth performance of broilers; among them, the high molecular weight AOS requires less enzyme in preparation, has relatively lower production cost, and can enhance immune function and improve intestinal health of broilers.

Key words： alginate oligosaccharide; broilers; growth performance; immune organ indices; serum antioxidant indices; intestinal health

Cite this article

HU Die , Alatengzhula , CHENG Zhiqian , ZHANG Meihong , XIAO Yuxuan , CHENG Gong , HU Yongfei . Effects of Alginate Oligosaccharide on Growth Performance, Immune Organ Indices, Serum Antioxidant Indices and Intestinal Health of Broilers[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2024 , 36(4) : 2331 -2343 . DOI: 10.12418/CJAN2024.201

寡糖是由2~10个单糖通过糖苷键聚合形成的带有支链或直链的低聚合度糖,分为普通寡糖和功能性寡糖[1]。普通寡糖能被机体消化道分泌的酶水解,为机体提供能量[2]。与普通寡糖相比,功能性寡糖不易被机体消化,主要被机体后肠的微生物分解利用,促进肠道益生菌增殖[3-4]。研究表明,功能性寡糖能够改善肉鸡肠道健康,增强免疫功能,并提高其生长性能[5-6]。褐藻寡糖(alginate oligosaccharide,AOS)是一种由褐藻胶降解形成的典型海洋功能性寡糖,近年来在饲料添加剂领域受到广泛关注。黄健彬等[7]研究发现,AOS能改善卵形鲳鲹肠道形态,增强肠道免疫功能,提高其生长性能。Wan等[8]研究表明,AOS可以通过抑制核因子-κB(NF-κB)通路的激活来减轻产肠毒素大肠杆菌诱导的断奶仔猪肠道炎症损伤。Alatengzhula等[9]研究发现,AOS可以调节肉鸡肠道菌群,增强肠道免疫功能,改善肠道消化吸收能力,提高其生长性能。有研究表明,AOS的生物学活性与分子量大小密切相关[10],但目前不同分子量的AOS对肉鸡生长性能和免疫器官指数的研究尚未见报道。因此,本研究首先酶解制备不同分子量的AOS,之后探究不同分子量AOS对爱拔益加肉鸡生长性能和免疫器官指数的影响,并进一步研究了高分子量AOS对肉鸡血清抗氧化指标和肠道健康的影响,为AOS在肉鸡生产中的科学应用提供数据支撑和理论依据。

1 材料与方法

1.1 AOS的酶法制备与分子量测定

本实验室前期研究从海洋微生物中克隆表达了褐藻胶裂解酶PDE9。本研究利用PDE9水解制备不同分子量AOS:称取3份100 g的褐藻酸钠(市售),加水溶解,使底物浓度为10%,并分别添加100、200和800 U的PDE9,调节反应温度至40 ℃,搅拌反应24 h。待反应结束后,升温至80 ℃维持1 h使酶灭活,使用冻干机对3个酶解产物进行冻干。然后使用高效分子排阻色谱方法测定酶解产物的分子量:色谱仪型号为安捷伦1260 Infinity Ⅱ;色谱柱为TSK-GEL G4000PWXL;柱温为40 ℃;流动相为0.1%乙酸钠;流动相流速为0.75 mL/min;酶解液浓度为10 mg/mL;注射体积为50 μL;标准品为六旋糖苷。经实测,3种酶解产物的重均分子量分别为23 981、5 038和3 766 u,依次记为高分子量、中分子量和低分子量。

1.2 试验动物与试验设计

动物试验采用单因素完全随机设计,选取1日龄爱拔益加雄性肉仔鸡280只,随机分为4组,每组7个重复,每个重复10只,重复之间体重接近(P>0.05)。对照组(CON组)饲喂玉米-豆粕型基础饲粮,其为参照《鸡营养需要》(NY/T 33—2004)和NRC(1994)配制的颗粒状配合饲料,基础饲粮组成及营养水平见表1;试验组分别在基础饲粮中添加200 mg/kg低分子量(AL组)、中分子量(AM组)和高分子量(AH组)的AOS。试验期40 d。
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis)%

项目 Items 含量 Content
1~20日龄 1 to 20 days of age 21~40日龄 21 to 40 days of age
原料 Ingredients
玉米 Corn 56.76 59.87
玉米蛋白粉 Corn gluten meal 2.50 2.90
豆粕 Soybean meal 34.11 30.04
大豆油 Soybean oil 2.65 3.80
氯化钠 NaCl 0.35 0.30
石粉 Limestone 0.88 0.98
磷酸氢钙 CaHPO4 1.89 1.41
氯化胆碱 Choline chloride (50%) 0.30 0.20
L-赖氨酸盐酸盐 L-Lys·HCl (98%) 0.11 0.14
DL-蛋氨酸 DL-Met (98%) 0.19 0.10
预混料 Premix1) 0.26 0.26
合计 Total 100.00 100.00
营养水平 Nutrient levels2)
代谢能 ME/(MJ/kg) 12.43 12.98
粗蛋白质 CP 21.54 20.00
赖氨酸 Lys 1.21 1.07
蛋氨酸 Met 0.58 0.44
钙 Ca 1.00 0.90
有效磷 AP 0.51 0.40
总磷 TP 0.80 0.65

1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of diets:VA 13 500 IU,VB1 3.6 mg,VB2 11.25 mg,VB6 6 mg,VB12 0.039 mg,VD3 3 600 IU,VE 36 IU,VK3 4.5 mg,生物素 biotin 0.24 mg,叶酸 folic acid 2.1 mg,D-泛酸 D-pantothenic acid 16.5 mg,烟酸 nicotinic acid 39 mg,抗氧化剂 antioxidant 300 mg,Cu (as copper sulfate) 16 mg,Fe (as ferrous sulfate) 80 mg,Mn (as manganese sulfate) 120 mg,Zn (as zinc sulfate) 110 mg,I (as potassium iodide) 1.50 mg,Se (as sodium selenite) 0.30 mg。

2)代谢能、钙、有效磷和总磷为计算值,粗蛋白质、赖氨酸和蛋氨酸为实测值,测定方法依据GB/T 6432—2018和GB/T 18246—2019。ME, Ca, AP and TP were calculated values, while CP, Lys and Met were measured values based on GB/T 6432—2018 and GB/T 18246—2019.

1.3 饲养管理

试验开始前对鸡舍及器具进行严格的消毒处理。采用3层重叠式笼养,试验鸡自由采食和饮水。鸡舍内照明采用人工光照,结合爱拔益家肉鸡饲养手册调控鸡舍光照时间和强度、温度、相对湿度及通风等环境条件,按照正常免疫接种程序进行免疫。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 生长性能

试验期间,每天观察肉鸡的健康状况,记录死亡和淘汰肉鸡的数量和重量,分别于试验的第1、20和40天,以重复为单位称量肉鸡空腹体重和剩余料重,并计算各阶段平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.4.2 免疫器官指数

于试验第20天,每重复随机选取1只接近平均体重的肉鸡,颈静脉放血处死,剖开腹腔,分离肝脏、脾脏、法氏囊和胸腺并称重,计算免疫器官指数,计算公式为:
免疫器官指数(%)=100×免疫器官重量/体重。

1.4.3 血清抗氧化指标

试验第40天,分别于每个重复中选取1只接近平均体重的肉鸡翅下静脉采血3 mL,用采血软管采集血液后45°斜置,待血清析出后使用离心机3 000 r/min离心10 min,收集血清于1.5 mL无菌离心管中,标记好后于-20 ℃保存。按照试剂盒说明书,利用碧云天试剂盒检测血清总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及丙二醛(MDA)含量。

1.4.4 空肠形态

采血后将肉鸡颈静脉放血处死,剖开腹腔,分离空肠,取肠段中部约0.5 cm肠段,用无菌生理盐水冲洗后固定于4%多聚甲醛溶液。肠道固定样品送往武汉塞维尔生物科技有限公司进行石蜡包埋、切片处理和苏木精-伊红(HE)染色。在光学显微镜下用合适倍数观察空肠切片组织形态,在合适视野下用LIOO软件拍照并测量肉鸡空肠的绒毛高度(VH)和隐窝深度(CD),并计算绒隐比(VH/CD)。

1.4.5 空肠消化吸收和屏障相关基因表达

采集上述屠宰肉鸡的部分空肠中段肠道组织于2 mL无菌离心管中,迅速放于液氮中,之后放置于-80 ℃冰箱中保存。将空肠肠道组织于液氮中研磨,用TsingZol试剂(擎科,北京)提取总RNA,并用Epoch2酶标仪(Bio Tek,美国)测定提取RNA的纯度与浓度。采用BeyoRTTM Ⅱ cDNA合成试剂盒(with gDNA Eraser)(碧云天,中国)进行反转录,合成cDNA。采用BeyoFastTM SYBR Green qPCR Mix试剂盒(2×,Low ROX)(碧云天,中国)在实时荧光定量PCR仪(ABI QuantStudioTM 7 Flex,Thermo Fisher Scientific,美国)进行荧光定量PCR的测定,操作步骤参照说明书进行。检测的空肠消化吸收相关基因包括钠-葡萄糖共转运蛋白1(SGLT1)、锌转运蛋白1(ZnT1)、葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)、葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)、寡肽转运蛋白1(PepT1)、味觉受体1成员1(T1R1)和味觉受体1成员3(T1R3),检测的空肠屏障相关基因包括闭合蛋白(occludin)、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、封闭蛋白-3(claudin-3)和黏蛋白-2(mucin-2)。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因,目的基因的mRNA相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。基因引物序列见表2。
表2 引物序列

Table 2 Primer sequences

基因 Genes 引物序列 Primer sequences (5'—3') 登录号 Accession No.
β-肌动蛋白 β-actin F:GAGAAATTGTGCGTGACATCA
R:CCTGAACCTCTCATTGCCA		 L08165
闭合蛋白 Occludin F:ACGGCAGCACCTACCTCAA
R:GGGCGAAGAAGCAGATGAG		 GI:464148
闭锁小带蛋白-1 ZO-1 F:CTTCAGGTGTTTCTCTTCCTCCTC
R:CTGTGGTTTCATGGCTGGATC		 XM_413773
封闭蛋白-3 Claudin-3 F:CCAAGATCACCATCGTCTCC
R:CACCAGCGGGTTGTAGAAAT		 NM_204202.2
黏蛋白-2 Mucin-2 F:TTCATGATGCCTGCTCTTGTG
R:CCTGAGCCTTGGTACATTCTTGT		 XM_421035
钠-葡萄糖共转运蛋白1 SGLT1 F:GCCATGGCCAGGGCTTA
R:CAATAACCTGATCTGTGCACCAGTA		 NM_001293240
锌转运蛋白1 ZnT1 F:TCCGGGAGTAATGGAAATCTTC
R:AATCAGGAACAAACCTATGGGAAA		 XM_421021.5
葡萄糖转运蛋白1 GLUTI F:TCCTCCTGATCAACCGCAAT
R:TGTGCCCCGGAGCTTCT		 NM_205209.1
葡萄糖转运蛋白2 GLUT2 F:CACACTATGGGCGCATGCT
R:ATTGTGCCTGGAGGTGTTGGT		 Z22932
寡肽转运蛋白1 PepT1 F:CCCCTGAGGAGGATCACTGTT
R:CAAAAGAGCAGCAGCAACGA		 NM_204365.1
味觉受体1成员1 T1R1 F:GTGTCATCCCCACAACCAA
R:CACCACTGCCTCAAAGAAGG		 XM_425734.4
味觉受体1成员3 T1R3 F:CATTACCGTCTTCGCCACTC
R:CTCTGTTCAAATCGGGCTTC		 XM_425740.3
白细胞介素-10 IL-10 F:CGCTGTCACCGCTTCTTCA
R:CGTCTCCTTGATCTGCTTGATG		 NM_001004414.2
白细胞介素-17 IL-17 F:TATCAGCAAACGCTCACTGG
R:AGTTCACGCACCTGGAATG		 NM_204460.1
白细胞介素-1β IL-1β F:ACTGGGCATCAAGGGCTA
R:GGTAGAAGATGAAGCGGGTC		 NM_204524

1.4.6 盲肠扁桃体免疫相关基因表达

采集上述屠宰肉鸡的盲肠扁桃体组织于2 mL无菌离心管中,迅速放于液氮中,之后放置于-80 ℃冰箱中保存。试验方法同1.4.5,检测的盲肠扁桃体免疫相关基因包括白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-17(IL-17)和白细胞介素-1β(IL-1β)。以β-肌动蛋白为内参基因,目的基因的mRNA相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。基因引物序列见表2。

1.4.7 盲肠菌群

采集上述屠宰肉鸡的盲肠内容物于2 mL无菌离心管中,迅速放于液氮中,之后放置于-80 ℃冰箱中保存。盲肠内容物样品送往中国科学院微生物研究所,使用Illumina Hiseq-PE250测序平台对盲肠内容物基因组进行双端测序,使用DADA2对测序平台产生的原始数据进行去噪、合并和聚类,对输出的归一化数据进行生物信息学分析。

1.5 数据统计分析

试验数据采用Excel 2021软件进行初步整理,并采用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析,采用Duncan氏法进行组间多重比较;AH组和CON组数据用SPSS 22.0统计软件进行独立样本t检验,P<0.05为差异显著,P>0.05为差异不显著,0.05≤P<0.10为差异有显著趋势。

2 结果与分析

2.1 不同分子量AOS对1~40日龄肉鸡生长性能的影响

由表3可知,1~20日龄,与CON组相比,AL组和AM组肉鸡末重和ADG均显著提高(P<0.05),F/G均显著降低(P<0.05),但ADFI均无显著差异(P>0.05);AH组末重、ADG、F/G和ADFI均无显著差异(P>0.05)。21~40日龄,与CON相比,AL组、AM组和AH组肉鸡末重和ADG均显著提高(P<0.05),但ADFI和F/G均无显著差异(P>0.05)。1~40日龄,与CON组相比,AL组、AM组和AL组肉鸡ADG均显著提高(P<0.05),但ADFI和F/G均无显著差异(P>0.05)。
表3 不同分子量AOS对1~40日龄肉鸡生长性能的影响

Table 3 Effects of different molecular weight AOS on growth performance of broilers from 1 to 40 days of age

项目
Items		 日龄
Days of age		 组别 Groups 均值标准误
SEM		 P值
P-value
CON AL AM AH
体重
BW/g		 1 43.54 43.51 43.47 43.50 0.00 0.931
20 686.25b 730.11a 733.72a 692.75b 4.22 <0.001
40 2 573.73c 2 729.91ab 2 775.97a 2 675.20b 13.85 <0.001
平均日采食量
ADFI/g		 1~20 48.30 50.65 49.11 48.69 0.24 0.111
21~40 166.46 171.72 171.28 169.71 0.83 0.163
1~40 104.73 108.33 103.95 105.96 1.14 0.551
平均日增重
ADG/g		 1~20 33.83b 36.14a 36.33a 34.17b 0.22 <0.001
21~40 95.91b 99.99a 102.11a 99.67a 0.76 <0.001
1~40 64.88c 68.06ab 69.22a 66.92b 0.35 <0.001
料重比
F/G		 1~20 1.43a 1.40b 1.35c 1.43a 0.00 <0.001
21~40 1.73 1.71 1.68 1.70 0.01 0.397
1~40 1.61 1.59 1.54 1.58 0.01 0.182

同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。表4同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as Table 4.

2.2 不同分子量AOS对20日龄肉鸡免疫器官指数的影响

由表4可知,与CON组相比,AL组肉鸡肝脏指数显著降低(P<0.05),但脾脏指数、法氏囊指数和胸腺指数均无显著差异(P>0.05);AM组和AH组肉鸡法氏囊指数均显著提高(P<0.05),但肝脏指数、脾脏指数和胸腺指数均无显著差异(P>0.05)。
表4 不同分子量AOS对20日龄肉鸡免疫器官指数的影响

Table 4 Effects of different molecular weight AOS on immune organ indices of broilers at 20 days of age%

项目
Items		 组别 Groups 均值标准误
SEM		 P值
P-value
CON AL AM AH
肝脏指数 Liver index 3.88b 3.39c 3.66bc 3.94abc 0.08 <0.001
脾脏指数 Spleen index 0.07 0.07 0.07 0.08 0.01 0.862
法氏囊指数 Bursa of Fabricius index 0.15b 0.13b 0.21a 0.22a 0.01 <0.001
胸腺指数 Thymus index 0.10 0.11 0.10 0.11 0.01 0.654
以上结果表明,低分子量、中分子量及高分子量AOS均能有效提高肉鸡生长性能,且中分子量和高分子量AOS均能增强肉鸡免疫功能。综合考虑制备成本和应用效果两方面因素,高分子量AOS最具实际应用价值,其原因在于:1)低分子量、中分子量及高分子量AOS的制备流程一致,但制备高分子量AOS的用酶量最少(制备低分子量、中分子量及高分子量AOS的用酶量分别为800、200和100 U),故制备高分子量AOS的成本最低;2)高分子量AOS对肉鸡的生长性能和免疫功能均产生有益作用。因此,后续的指标测定中只测定CON组和AH组,探究高分子量AOS对肉鸡血清抗氧化指标和肠道健康的影响。

2.3 高分子量AOS对40日龄肉鸡血清抗氧化指标的影响

由表5可知,与CON组相比,AH组肉鸡血清T-AOC、SOD和CAT活性以及MDA含量均无显著差异(P>0.05)。
表5 高分子量AOS对40日龄肉鸡血清抗氧化指标的影响

Table 5 Effects of high molecular weight AOS on serum antioxidant indices of broilers at 40 days of age

项目
Items		 组别 Groups P值
P-value
CON AH
总抗氧化能力 T-AOC/(mmol/L) 0.78±0.06 0.81±0.15 0.639
超氧化物歧化酶 SOD/(U/mL) 78.71±19.27 68.86±14.97 0.332
过氧化氢酶 CAT/(U/mL) 0.01±0.00 0.01±0.00 0.847
丙二醛 MDA/(μmol/L) 1.79±0.77 1.22±0.42 0.154

2.4 高分子量AOS对40日龄肉鸡空肠形态的影响

由表6可知,与CON组相比,AH组肉鸡空肠VH、CD和VH/CD均无显著差异(P>0.05),但空肠CD有降低趋势(P=0.084)。
表6 高分子量AOS对40日龄肉鸡空肠形态的影响

Table 6 Effects of high molecular weight AOS on jejunum morphology of broilers at 40 days of age

项目
Items		 组别 Groups P值
P-value
CON AH
绒毛高度 VH/μm 1 266.28±127.13 1 232.03±162.39 0.684
隐窝深度 CD/μm 237.91±55.59 192.82±17.39 0.084
绒隐比 VH/CD 5.89±1.27 6.25±0.82 0.580

2.5 高分子量AOS对40日龄肉鸡空肠消化吸收相关基因表达的影响

由表7可知,与CON组相比,AH组肉鸡空肠SGLT1和ZnT1的mRNA相对表达量均显著提高(P<0.05),空肠GLUT1和T1R1的mRNA相对表达量均显著降低(P<0.05),空肠GLUT2、T1R3和PePT1的mRNA相对表达量均无显著差异(P>0.05)。
表7 高分子量AOS对40日龄肉鸡空肠消化吸收相关基因表达的影响

Table 7 Effects of high molecular weight AOS on jejunum digestion and absorption related gene expression of broilers at 40 days of age

项目
Items		 组别 Groups P值
P-value
CON AH
钠-葡萄糖共转运蛋白1 SGLT1 1.00±0.49 2.17±0.96 <0.001
葡萄糖转运蛋白1 GLUTI 1.00±0.17 0.60±0.22 <0.001
葡萄糖转运蛋白2 GLUT2 1.00±0.27 0.90±0.48 0.314
锌转运蛋白1 ZnT1 1.00±0.71 2.52±0.91 <0.001
寡肽转运蛋白1 PepT1 1.00±0.47 0.97±0.50 0.841
味觉受体1成员1 T1R1 1.00±0.68 0.58±0.23 <0.001
味觉受体1成员3 T1R3 1.00±0.35 1.01±0.33 0.995

2.6 高分子量AOS对40日龄肉鸡空肠屏障相关基因表达的影响

由表8可知,与CON组相比,AH组肉鸡空肠ZO-1、occludin和mucin-2的mRNA相对表达量均显著提高(P<0.05),空肠claudin-3的mRNA相对表达量有提高趋势(P=0.081)。
表8 高分子量AOS对40日龄肉鸡空肠屏障相关基因表达的影响

Table 8 Effects of high molecular weight AOS on jejunum barrier related gene expression of broilers at 40 days of age

项目
Items		 组别 Groups P值
P-value
CON AH
闭锁小带蛋白-1 ZO-1 1.00±0.19 1.30±0.29 <0.001
封闭蛋白-3 Claudin-3 1.00±0.14 1.16±0.38 0.081
闭合蛋白 Occludin 1.00±0.29 1.51±0.41 <0.001
黏蛋白-2 Mucin-2 1.00±0.22 3.36±0.34 <0.001

2.7 高分子量AOS对40日龄肉鸡盲肠扁桃体免疫相关基因表达的影响

由表9可知,与CON组相比,AH组肉鸡空肠IL-10、IL-17和IL-1β的mRNA相对表达量均显著降低(P<0.05)。
表9 高分子量AOS对40日龄肉鸡盲肠扁桃体免疫相关基因表达的影响

Table 9 Effects of high molecular weight AOS on cecal tonsil immune-related gene expression of broilers at 40 days of age

项目
Items		 组别 Groups P值
P-value
CON AH
白细胞介素-10 IL-10 1.00±0.25 0.75±0.31 0.033
白细胞介素-17 IL-17 1.00±0.18 0.58±0.22 <0.001
白细胞介素-1β IL-1β 1.00±0.19 0.46±0.15 <0.001

2.8 高分子量AOS对40日龄肉鸡盲肠菌群的影响

2.8.1 高分子量AOS对40日龄肉鸡盲肠菌群α多样性的影响

α多样性反映肠道菌群丰富度和多样性,常用的指数有Chao1指数、Ace指数、Shannon指数和Simpson指数,其中Chao1指数和Ace指数反映菌群物种的丰富度,Simpson指数和Shannon指数反映菌群物种的多样性。由表10可知,与CON组相比,AH组肉鸡盲肠菌群Chao1指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数均无显著差异(P>0.05)。
表10 高分子量AOS对40日龄肉鸡盲肠菌群α多样性的影响

Table 10 Effects of high molecular weight AOS on α diversity of cecal microbiota of broilers at 40 days of age

项目
Items		 组别 Groups P值
P-value
CON AH
Chao1指数 Chao1 index 89.58±8.93 87.91±5.13 0.970
ACE指数 ACE index 87.33±5.20 87.51±3.61 0.780
Shannon指数 Shannon index 3.12±0.19 3.23±0.17 0.300
Simpson指数 Simpon index 0.93±0.19 0.93±0.14 0.450

2.8.2 高分子量AOS对40日龄肉鸡盲肠菌群β多样性的影响

β多样性反映不同分组样本间菌群组成的相似性或差异性。在主坐标分析(PCoA)中,样本距离越近则表示物种组成结构越相似。如图1所示,AH组肉鸡盲肠菌群明显聚集,且与CON组有一定距离。采用置换多元方差分析(PERM ANOVA)方法检验2组样品间β多样性的差异显著性,结果显示P=0.055,CON组和AH组肉鸡盲肠菌群β多样性差异有显著性趋势(0.05≤P<0.10)。
图1 肉鸡盲肠菌群主坐标分析

Fig.1 PCoA of cecal microbiota of broilers

2.8.3 高分子量AOS对40日龄肉鸡盲肠菌群在属水平上组成的影响

采用线性判别分析效应大小(LEfSe)方法在属水平上对CON组和AH组肉鸡盲肠菌群的差异菌属进行分析,分析结果如图2所示,与CON组相比,AH组肉鸡盲肠未培养的厚壁菌门细菌(uncultured Firmicutes bacterium)、瘤胃球菌科UCG-005(Ruminococcaceae_UCG-005)、帕拉苏特氏菌属(Parasutterella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、瘤胃梭菌属(Ruminiclostridium)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)、鸡杆菌属(Gallibacterium)、埃希氏-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)和无害梭菌群(Clostridium innocuum group)的相对丰度显著提高(P<0.05)。
图2 肉鸡盲肠菌群线性判别分析分布柱状图

g_:属 genus;Clostridium_sensu_stricto_1:狭义梭菌属1;Unknown Lachnospiraceae:未知毛螺菌科;Methanomassiliicoccus:甲烷马赛球菌属;Unknown Eggerthellaceae:未知伊格尔兹氏菌科;Gordonibacter:戈登氏菌属;uncultured Firmicutes bacterium:未培养的厚壁菌门细菌;Parasutterella:帕拉苏特氏菌属;Campylobacter:弯曲杆菌属;Ruminiclostridium:瘤胃梭菌属;Clostridium innocuum group:无害梭菌群;Ruminococcaceae_UCG-005:瘤胃球菌科UCG-005;Phascolarctobacterium:考拉杆菌属;Bacteroides:拟杆菌属;Gallibacterium:鸡杆菌属;Escherichia-Shigella:埃希氏-志贺氏菌属。

Fig.2 LDA distribution histogram of cecal microbiota of broilers

3 讨论

3.1 不同分子量AOS对1~40日龄肉鸡生长性能的影响

肉鸡的生长性能与养殖经济效应密切相关,而生长性能常用ADG、ADFI和F/G等指标来综合评定[11]。Alatengzhula等[9]研究发现,饲粮中添加AOS能显著提高肉鸡ADG和ADFI,但对末重和F/G没有显著影响。张丽等[12]报道,饲粮中添加AOS能显著提高断奶仔猪ADG和ADFI,但对F/G没有显著影响。本试验研究结果表明,与CON组相比,AL组、AM组和AH组肉鸡40日龄体重以及21~40日龄和1~40日龄ADG均显著提高;AL组和AM组肉鸡20日龄体重和1~20日龄ADG均显著提高,1~20日龄F/G均显著降低。这一试验研究结果证明了饲粮中添加不同分子量AOS对肉鸡的生长性能均产生积极影响,其中,中分子量和低分子量AOS对肉鸡1~20日龄也有良好的促生长作用。功能性寡糖能改善肠道健康,提高机体免疫[5-6],这些有益作用最终促进了生长性能的提高。

3.2 不同分子量AOS对20日龄肉鸡免疫器官指数的影响

胸腺是禽类的中枢免疫器官,也是淋巴细胞成熟分化的场所;法氏囊是禽类特有的中枢免疫器官,与B细胞产生、成熟和分化密切相关;脾脏是禽类的外周免疫器官,是免疫反应的重要场所;肝脏是急性期蛋白质合成的场所。免疫器官指数是用来反映禽类免疫功能状态的重要指标[13]。石雪傲等[14]研究发现,饲粮中添加壳寡糖可以显著提高肉鸡法氏囊指数。熊阿玲等[15]报道,饲粮中添加甘露寡糖可以显著提高肉鸡法氏囊指数和胸腺指数。本试验研究结果表明,与CON组相比,AM组和AH组肉鸡法氏囊指数显著提高,这与石雪傲等[14]和熊阿玲等[15]的研究结果相似,说明功能性寡糖可以促进肉鸡法氏囊发育,从而增强肉鸡免疫功能,改善肉鸡健康状况。

3.3 高分子量AOS对40日龄肉鸡血清抗氧化指标的影响

抗氧化能力在一定程度上反映机体的健康状况。T-AOC用来反映机体中各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成的总体抗氧化水平。SOD能促使超氧化物转化成过氧化氢,而CAT能够让过氧化氢分解成无毒的水和氧气,两者可以反映机体清除自由基的能力。MDA是脂质氧化终产物,能反映机体脂质过氧化的程度。何雪萍[16]研究表明,饲粮中添加壳寡糖可以显著提高肉鸡血清CAT活性。张丽等[12]报道,饲粮中添加AOS能显著提高断奶仔猪血清T-AOC以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和CAT活性。本试验研究结果表明,与CON组相比,AH组肉鸡血清T-AOC、SOD和CAT活性以及MDA含量均无显著差异,这可能是在正常饲养条件下,肉鸡的氧化和抗氧化处于比较稳定的状态。

3.4 高分子量AOS对40日龄肉鸡空肠形态的影响

肠道绒毛结构影响肠道消化吸收能力,VH提高或CD降低均能增加肠道消化吸收表面积,VH、CD和VH/CD是评价肠道消化吸收能力的常用指标[17]。本试验研究结果表明,与CON组相比,AH组肉鸡空肠VH和VH/CD均无显著差异,CD有降低趋势。这说明高分子量AH对肉鸡空肠形态具有一定的改善作用。

3.5 高分子量AOS对40日龄肉鸡空肠消化吸收相关基因表达的影响

营养物质是机体生长发育的必要物质条件,消化道对营养物质的消化吸收是机体利用其的关键环节,转运蛋白在肠道消化吸收中扮演重要角色,膳食营养物质在肠道内被消化分解为小分子物质后先被肠上皮细胞上的转运蛋白转运至细胞内,随后转运蛋白把小分子物质输送到血液[18]。SGLT1是钠离子(Na+)依赖性葡萄糖转运体,在肠上皮细胞对膳食葡萄糖的吸收过程中起重要作用;GLUT1和GLUT2是Na+非依赖性葡萄糖转运体,其中GLUT1遍布所有组织,负责调节组织从血浆中摄取葡萄糖,而GTUT2存在小肠上皮细胞基底膜,将细胞内的单糖转运至血液[19]。ZnT1是细胞膜上的锌转运蛋白,负责将胞内的锌转运至细胞外,维持细胞锌稳态[20]。PepT1是寡肽转运蛋白,在肠上皮细胞对膳食寡肽的吸收过程中发挥重要作用[21]。T1R1和T1R3是味觉受体第一家族成员,在动物味觉传导系统中,T1R1和T1R3异源二聚体发挥鲜味受体的作用[22]。Alatengzhula等[9]研究发现,饲粮中添加AOS可以显著提高肉鸡空肠PepT1、SGLT1和ZnT1的mRNA相对表达量。张丽等[12]研究表明,饲粮中添加AOS可以显著提高断奶仔猪空肠SGLT1的mRNA相对表达量。万津[23]研究发现,饲粮中添加AOS能显著提高断奶仔猪空肠SGLT1和二价金属离子转运载体(DMT1)的mRNA相对表达量。本试验研究结果表明,与CON组相比,AH组肉鸡空肠SGLT1和ZnT1的mRNA相对表达量显著提高,空肠GLUT1和T1R1的mRNA相对表达量显著降低,这说明高分子量AOS能够促进肉鸡肠上皮细胞吸收葡萄糖和转运锌,但不利于肠上皮细胞从血液中摄取葡萄糖,也降低了肉鸡对鲜味的感知能力。综上可知,高分子量AOS可以通过提高转运蛋白基因表达来增强肠道消化吸收能力。

3.6 高分子量AOS对40日龄肉鸡空肠屏障相关基因表达的影响

肠道单层上皮细胞构成肠黏膜上皮屏障,紧密连接封闭细胞旁的空间结构,在维持肠黏膜上皮屏障功能的完整性中发挥着重要作用;紧密连接由不同的occludin、封闭蛋白(claudin)及闭锁小带蛋白(ZO)组成[24]。黏蛋白(mucin)是肠道黏液层的主要成分,在肠上皮表面形成仅允许小分子物质通过的凝胶状筛子网状结构,保护肠上皮细胞免受肠腔内物质的侵害[25]。李俊[26]研究表明,饲粮中添加壳寡糖可以显著提高肉鸡空肠claundin-3的mRNA相对表达量。万津[23]研究发现,饲粮中添加AOS能显著提高断奶仔猪空肠mucin-2的mRNA相对表达量。本试验研究结果表明,与CON组相比,AH组肉鸡空肠ZO-1、occludin和mucin-2的mRNA相对表达量显著提高,这说明高分子量AOS能够通过促进紧密连接蛋白和黏蛋白基因的表达来增强肠道屏障功能。

3.7 高分子量AOS对40日龄肉鸡盲肠扁桃体免疫相关基因表达的影响

炎症反应是一个复杂的过程,适度的炎症反应有利于增强机体免疫力,而过度的炎症反应会造成病理学损伤[27]。白细胞介素家族在炎症反应中发挥重要作用,促炎因子IL-1β和IL-17可以诱导免疫细胞产生炎症细胞因子或趋化因子,促进炎症的发生;而抗炎因子IL-10能抑制炎症介质的产生,减轻炎性细胞浸润[28]。一般来说,促炎因子或抑炎因子在正常范围内的波动在一定程度上反映了机体免疫状态的改变。本试验研究结果表明,与CON组相比,AH组肉鸡盲肠扁桃体IL-10、IL-17和IL-1β的mRNA相对表达量均显著降低,这说明肉鸡的免疫状态发生了改变,但是高分子量AOS对肉鸡免疫状态的影响机制仍需进一步研究论证。

3.8 高分子量AOS对40日龄肉鸡盲肠菌群的影响

肠道菌群是影响肠道健康的重要因素,α多样性指数是评价肠道菌群物种丰富度和多样性的指标,β多样性指数反映群落组成变化的程度。本试验对肉鸡盲肠内容物进行菌群测序分析结果表明,与CON组相比,AH组肉鸡盲肠菌群丰富度指数Chao1和ACE指数以及多样性指数Shannon和Simpson指数均无显著差异,但β多样性差异有显著性趋势,说明饲粮中添加高分子量AOS对肉鸡肠道菌群丰富度和多样性没有显著效果,但改变了盲肠菌群结构。本试验在属水平上对肉鸡盲肠菌群进行了差异菌分析,结果表明,与CON组相比,AH组肉鸡盲肠拟杆菌属、瘤胃梭菌属和考拉杆菌属等益生菌的相对丰度显著提高。拟杆菌属是肠道乙酸盐和丙酸盐的主要生产者,而乙酸盐和丙酸盐都是有效的抗炎介质,可以抑制巨噬细胞释放促炎细胞因子,维持机体免疫系统的稳定性[29]。瘤胃梭菌属具有很强的纤维素分解活性,能够发酵纤维素产生短链脂肪酸[30]。考拉杆菌属是肠道菌群的核心成员,参与机体胆固醇代谢和维持胆汁酸稳态[31]。综上可知,饲粮中添加高分子量AOS能改善肉鸡盲肠菌群结构,促进肠道健康。

4 结论

饲粮中添加不同分子量AOS均能有效提高肉鸡生长性能。其中,高分子量AOS在制备中所需的酶量更少,生产成本相对更低,且能增强肉鸡免疫功能和改善肠道健康。

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