全球变暖已成为一个不容忽视的全球性热点话题。近年来,冰川融化、海平面上升、高温、干旱、洪水等恶劣天气现象对人类活动产生了巨大的影响,引起全球变暖的温室气体主要包括二氧化碳(carbon dioxide,CO2)、甲烷(methane,CH4)等,其中CH4产生与畜牧业发展息息相关[1]。畜牧业生产在我国农业生产中占了相当大的比重,在发挥重要作用的同时也产生了一些负面影响,带来了许多环境问题[2],尤其是反刍动物,其产生的CH4、CO2等气体对人和动物都有直接或间接毒害作用,空气中CH4含量增加,诱导空气中含氧量下降、污浊物含量升高,不仅会降低空气质量、产生异味,如果人、畜长期生活在CH4含量过高的环境中,还会对健康产生威胁,产生疾病,甚至中毒身亡[3]。
据统计,反刍动物CH4排放量约占全球温室气体量的16%,其主要来源于瘤胃(87%),其次来自后肠(13%)[4]。反刍动物生成CH4与其特有的消化方式有着密切的联系,瘤胃中的微生物将单胃动物难以消化的纤维和木质素等发酵成挥发性脂肪酸(volatile fatty acids,VFAs),为机体提供其所需要的能量和营养[5]。但在消化过程中,消耗2%~12%的总能用于生成CH4[6]。因此,反刍动物CH4的产生不仅对环境造成巨大威胁,也是一种饲料能量的浪费。因此,抑制CH4排放对提高生产效率具有重要意义,每减少1 kg CH4排放量,就可以多生产1.3 kg牛肉或者17.7 kg的标准乳[7]。
1 瘤胃内CH4生成机制及途径
反刍动物采食的饲粮在瘤胃中经细菌、原虫和真菌等发酵,将饲粮中的碳水化合物转化为VFAs及气态副产物[10]。同时,在瘤胃微生物发酵过程中,产甲烷菌利用瘤胃细菌、真菌、原虫降解底物所产生的气态物质[主要是CO2和氢气(H2)]生成CH4。Thauer[11]发现CH4不仅是产甲烷菌唯一的代谢终产物,还是获得能量的唯一来源,瘤胃中产甲烷菌数量比细菌少,却在瘤胃菌群发挥作用时占主导地位[8]。研究发现,在瘤胃中CH4的合成已知有3种途径[12],包括CO2-H2还原途径、甲基营养途径及解乙酸途径。其中,CO2-H2还原途径是通过产甲烷菌以H2和CO2为底物,由甲基辅酶M还原酶(methyl coenzyme M reductase,MCR)催化甲基辅酶M和辅酶B还原生成CH4和异二硫化物,瘤胃CH4的合成大部分来自CO2-H2还原途径,占瘤胃CH4总产量的82%[13]。甲基营养途径是由于饲粮中的果胶在酶的催化下分解成甲醇,甲醇在辅酶甲基转移酶系统的作用下,生成甲基辅酶M,在MCR的催化下生成CH4[12;解乙酸途径是乙酸在乙酸激酶和磷酸转移酶的作用下生成乙酰辅酶A,乙酰辅酶A在一氧化碳脱氢酶/去碳基甲酰化酶复合物的催化下,分别生成甲基四氢CH4喋呤和一氧化碳(CO),四氢CH4喋呤在辅酶M甲基转移酶和MCR的催化下生成CH4[9]。虽然CH4的产生是由产甲烷菌所催化,但CH4的产量与产甲烷菌总数无关,更多的是依赖产甲烷菌群落的结构[14]。
2 瘤胃内环境对CH4的影响
2.1 瘤胃微生物群体与CH4的关系
反刍动物的瘤胃内生活着复杂多样的微生物群落[15],这些微生物大体可以分为产H2和耗H2 2种类型,前者主要包括各种瘤胃球菌、原虫以及厌氧真菌等;后者主要是消耗瘤胃内H2的产甲烷菌[16],也是瘤胃中与CH4生成直接相关的微生物,与瘤胃原虫、细菌和真菌以及其他微生物有着密切关系[2]。瘤胃中82%的CH4由产甲烷菌通过利用饲料降解产生的H2、甲酸代谢等产物还原CO2生成[2,17],其中瘤胃原虫为产甲烷菌提供了底物 [16]。此外,研究发现一些细菌,如拟杆菌门可以很好地利用H2,产甲烷菌和这些细菌相互作用可以对瘤胃内的H2进行转移,从而影响瘤胃发酵和CH4的产生[2]。CH4的生成可以很好地缓解瘤胃内H2分压过高导致的发酵抑制,从而维持瘤胃的正常发酵[16],同时也会造成饲料的浪费,瘤胃内微生物与CH4生成有着密切联系,而不同动物其内部的微生物组成差异较小,这就使得我们可以通过饮食干预调控瘤胃微生物群体的组成,在不影响瘤胃发酵的前提下,减少CH4产量,提高饲料利用率,促进动物健康、高效生产[15]。
2.2 瘤胃发酵对CH4的影响
反刍动物体内CH4生成与其特有的消化方式有着密切的联系,饲粮经反刍动物采食后,在瘤胃内进行厌氧发酵生成VFAs和各种气体,其中乙酸、丙酸、丁酸等VFAs与CH4产量之间具有高度关联性,丙酸产量与CH4产量呈高度的负相关[18]。丙酸作为主要VFAs之一,除了为反刍动物提供能量,丙酸的生成也消耗H2,是瘤胃中利用H2的途径之一,同时也影响瘤胃CH4的生成[2]。微生物群中存在丙酸形成的最丰富的琥珀酸途径,也存在更为广泛的丙二醇途径。研究发现,在动物饲粮中添加丙酸前体物质可以有效促进丙酸生成[19]。为了提高丙酸生成菌的代谢活性,人们根据饲养水平以及动物生产类型,通过饲粮干预等对瘤胃发酵进行操控,以寻求适当的条件调控瘤胃发酵向丙酸产生方向转变,以及增加与产甲烷菌有竞争的细菌丰度来抑制CH4的产生[15]。
3 植物提取物主要活性物质对CH4的调控作用
3.1 类黄酮
类黄酮广泛存在于黄芩、甘草、橙皮、儿茶、葛根等多种药用植物中,是植物次生代谢产物中一类重要的活性物质[20],可以细化为黄烷酮、异黄酮、黄酮醇、黄烷醇和花色素等多个亚类[21],主要存在形式以黄酮苷为主[20],具有多种活性功能。Eger等[17]通过体外试验探究了大蒜黄酮和苦橙黄酮粉末混合物对CH4产量的影响,结果发现,添加1 g混合物减少了6.9 mL/d的CH4产量,添加2 g混合物减少了0.43 mL/d的CH4产量;试验中短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)和丁酸盐的产量、干物质降解率(dry matter degradation rate,DMD)及H2含量均有所增加,其中与产甲烷菌属有关的CH4微生物科数量显著降低,尤其降低了产甲烷菌物种的丰度,随着混合物添加量的增加,对CH4的抑制效果下降。这一结果与不同剂量组别之间个体聚类丰度差异和产甲烷古细菌群的性质有关,高剂量影响了瘤胃微生物群的组成,从而导致CH4产量出现差异。Zhou等[22]通过体外试验探究了桑叶黄酮对CH4产量的影响,对桑叶果实提取物进行晒干、青贮和添加剂(乳酸杆菌)青贮等不同处理,结果表明,样品添加剂量同为5 g时,添加剂青贮组CH4产量减少了4.6%,青贮组CH4产量减少了15.1%,由于青贮发酵保留了桑叶中的各种成分,当酚类物质含量高时会抑制瘤胃微生物的生长,从而表现出青贮组抑制CH4效果最好,对动物生产性能的影响还需进一步研究。Ma等[23]以2 g/d的剂量在绵羊饲粮中添加桑叶黄酮,使每日CH4产量降低了12%,并且DMD和总VFAs含量都有所提高,与纤维溶解菌的丰度增加有关,同时导致了产甲烷菌丰度和瘤胃原虫数量的减少,从而影响CH4排放。Ramos-Morales等[24]通过体外模拟试验研究了甘草提取物中的异黄酮——光甘草定对CH4产量的影响,结果发现,添加1 g/L光甘草定使CH4产量下降了0.32 mmol/d,添加2 g/L光甘草定使CH4产量下降了1.61 mmol/d,CH4产量的减少与瘤胃原虫数量的减少有关,因为瘤胃原虫为产甲烷菌提供H2作为还原底物,瘤胃原虫数量减少导致可生成CH4的底物减少;尽管添加甘草提取物对细菌总数没有影响,但降低了瘤胃原虫和厌氧真菌丰度,对细菌群落结构有巨大影响,在饲粮中加入光甘草定会提高反刍动物的饲料利用率,CH4产量也随着光甘草定剂量的增加而降低。Yu等[25]在泌乳奶牛上进行了体内试验,探究了柑橘类黄酮对奶牛瘤胃发酵的影响,结果显示,随柑橘类黄酮水平的升高,VFAs含量呈线性增加,瘤胃真菌和产甲烷菌丰度均降低,说明植物来源的类黄酮物质是一种前景广泛的CH4抑制剂。然而,目前缺乏黄酮类物质对减缓反刍动物CH4排放和营养利用的长期影响的研究,还需开展大量试验进行评估。
3.2 植物多酚
多酚在植物界中广泛存在。有研究指出,多酚能改变瘤胃微生物区系的组成,抑制瘤胃原虫的数量,从而抑制CH4的生成[26]。滕战伟[27]通过体外试验研究了绿茶多酚对瘤胃发酵和CH4产量的影响,结果发现,当添加剂量为1%时,CH4产量减少了0.59 mL/d,抑制效果最好,并且降低了乙酸/丙酸比值,提高了瘤胃纤维降解菌的丰度,不同剂量的抑制效果差异与多酚分子质量有关。单宁不仅是一种抗营养因子,也是除木质素外含量最为丰富的天然多酚之一[28]。有研究指出,单宁不仅能直接降低瘤胃产甲烷古菌群落的丰度和数量,减少CH4的产生[29],还可以通过抑制瘤胃原虫的数量间接抑制CH4生成[9]。牛玉环[30]在体外研究了同一剂量(15 mg)5种不同分子质量的单宁对瘤胃发酵和CH4产量的影响,结果发现,随着单宁分子质量升高,总产气量和CH4产量总体呈现出下降的趋势,其中金露梅在分子质量为4 331.9 u时抑制CH4效果最好,CH4产量减少了4.3 mL/g。Puchalska等[31]通过体外试验研究了泡桐叶中的多酚类物质对瘤胃发酵和CH4产量的影响,结果显示,添加剂量同样为400 mg时,高酚泡桐叶减少了2.22 mmol/g的CH4产量,低酚泡桐叶减少了2.39 mmol/g的CH4产量;同时验证了不同部位泡桐多酚对CH4的抑制效果,泡桐叶薄片减少了0.41 mmol/g的CH4产量,是由于叶片中中性洗涤纤维(neutral detergent fiber,NDF)含量增加,导致DMD降低,提供的H2减少,从而减少了CH4产量,泡桐枝降低了0.65 mmol/g的CH4产量,与丙酸含量提高、乙酸/丙酸比值降低有关。
植物来源多酚类物质对CH4的影响较大,对瘤胃中纤维降解菌的影响效果一致,对DMD以及产甲烷菌和原生动物的影响表现出差异,与其不同来源、部位、添加剂量以及植物体内多酚含量有关。考虑到某些植物作为抗营养因子带来的毒性问题[28],植物多酚是否能应用于实践,未来研究重点应该集中在多酚的剂量和毒性试验,为其在体内试验提供依据,填补体内研究的空缺,为其在实践中的应用奠定基础。
3.3 糖苷
皂苷是一种植物糖苷,可分为三萜和甾体2种类型,对瘤胃的发酵模式具有调控作用,从而抑制CH4产生[32]。有研究表明,当皂苷经瘤胃中的微生物脱去糖基变为皂苷元时,会失去活性,因此其抗原性作用非常短暂[33]。Lila等[34]通过体外试验研究了丝兰皂苷对瘤胃CH4产量和瘤胃发酵的影响,结果发现,添加了丝兰皂苷组的CH4产量均有所下降,随着丝兰皂苷添加剂量的增加,其抑制效果越好,添加剂量为0.5%时,CH4产量降低了2.5 L/d,添加剂量为1%时,CH4产量降低了3.8 L/d;与此同时,DMD、NDF降解率也随丝兰皂苷添加剂量上升而下降,总VFAs和丙酸含量增加,丝兰皂苷对CH4的影响表现在抑制原生动物的生长、减少了乙酸/丙酸比值等方面。Belanche等[35]进行的一项体外研究结果发现,与对照组相比,添加5%的常春藤皂苷对DMD没有负面影响,CH4产量降低了1.98 mmol/L,降低了真菌丰度,在丰度和Shannon指数上表现出有降低甲烷菌多样性的趋势,常春藤皂苷对CH4的影响主要是通过直接减少瘤胃原虫和产甲烷菌的数量来抑制CH4的产生。Hess等[36]通过体外试验研究了含有皂苷的热带水果对瘤胃发酵和CH4产量的影响,分别在发酵底物中添加100 mg/g皂苷果实、200 mg/g环果和沙曼果,结果发现,与对照组相比,添加皂苷果实组的NDF降解率降低,CH4产量减少了1.22 mmol/L,而添加200 mg/g环果和沙曼果组的CH4产量分别提高了0.87和0.46 mmol/L,pH和DMD下降,瘤胃原虫数量增加,动物生产性能降低。
糖苷是一类重要的活性物质,学者也进行了大量研究来验证其对瘤胃发酵和CH4的影响,但结果存在差异,与其所用皂苷来源、添加剂量等有密切关系。不同研究对DMD的影响表现出差异的原因是不同类型的皂苷影响瘤胃纤维溶解菌丰度从而导致了DMD的变化。为了更好地将皂苷应用于反刍动物的CH4减排研究中,未来应重点关注其是否对瘤胃发酵存在负面影响,为开展体内试验提供参考,以期选出对瘤胃发酵、生产性能无负面影响的CH4抑制剂。
3.4 植物精油
植物精油很早之前就被人类开发利用,不同化学成分的精油其作用方式也不尽相同,其作用方式主要有2种,一种是进入瘤胃通过改变细菌群落发挥作用,另一种则是通过抑制氨基酸的脱氨作用发挥后续效应[37]。Nunes等[38]选取了3种植物精油在体外研究了其对CH4产量的影响,结果发现,添加精油降低了总产气量和CH4产量,添加120 μL/g DM松孢精油使CH4产量降低了47%,随精油添加剂量的增加,其对CH4的抑制效果越显著。Zhou等[39]研究了颗粒状粉末牛至精油对体外发酵的影响,结果显示,随牛至精油剂量的升高,乙酸/丙酸比值以及异丁酸、异戊酸含量均有所下降,CH4产量总体呈现下降趋势,在剂量为91 mg/L时,抑制效果最好,CH4产量减少了6.4 mL,如果剂量继续增加,抑制效果会有所下降。Benetel等[40]在体外试验中,研究了10种精油对瘤胃CH4排放的影响,结果发现在50 mg/L添加剂量时,生姜精油和百里香精油抑制CH4效果最佳,分别减少了13.69和10.62 mL/g的CH4产量,且对CH4的抑制不会随着添加剂量的增加而加强。El-Zaiat等[41]在体外试验中研究了添加90 μg/g广藿香精油对CH4排放的影响,结果显示,广藿香精油的添加减少了9%的CH4产量和19%的瘤胃原虫数量,增加了29%的丙酸含量,说明广藿香精油通过减少瘤胃原虫数量,调控瘤胃发酵模式向丙酸盐生成方向转变,从而减少了CH4产量。
植物精油来源丰富,已有学者在体外探讨了其对CH4的影响,但不同研究结果存在差异。高剂量精油对微生物发酵表现出负面影响,低剂量精油对CH4抑制效果不佳,与瘤胃微生物群降解能力有关,限制了精油在低剂量添加时的作用效果[42]。植物精油对CH4的抑制机制主要通过改变古细菌群落的结构,直接影响产甲烷古菌丰度及产CH4微生物的活性[43]。通过调控瘤胃发酵模式,促进丙酸生成以及降低饲料营养物质表观消化率[42]。有关植物精油抑制CH4生成的研究都是在体外进行验证的,不同来源、研究对象、添加剂量均存在差异,且不同部位其化学组成、作用效果也不一样[37]。因此,精油在CH4减排中的应用还需评估其不同部位来源的化学差异,以及对瘤胃发酵及消化率可能存在的负面影响,明确其最佳抑制效果时的添加剂量,在不影响生产性能和瘤胃发酵的情况下,植物精油在抑制CH4生成方面是一种非常具有前景的天然饲料添加剂[44]。
3.5 多糖
碳水化合物是不可或缺的营养物质,主要为机体提供所需能量,单糖、多糖、低聚糖3种类型[45],其中多糖是研究最多的物质[46]。苦瓜在世界范围内被广泛种植,苦瓜多糖是其重要的活性物质之一,能提高VFAs产量、调节瘤胃发酵模式和影响纤维素溶解菌数量[46]。菊粉是一种广泛存在的植物源益生元,在饲粮中使用不仅不会对瘤胃发酵存在任何负面影响,还能提高饲料营养物质消化率。Paya等[47]通过体外试验探究了菊粉作为益生元添加剂对瘤胃发酵和CH4产量的影响,结果表明,与对照相比,饲粮中添加2%菊粉降低了1.4%的CH4产量,添加4%菊粉降低了2.6%的CH4产量,菊粉主要通过提高瘤胃微生物数量,降低乙酸/丙酸比值,提高了VFAs含量,调控瘤胃发酵模式向丙酸生成方向转变,以此来减少CH4的产生。
自然界碳水化合物来源广泛、种类繁多,已有研究发现植物多糖抑制CH4生成机制主要是调节瘤胃发酵模式,促进VFAs生成,增加纤维素溶解菌数量,提高饲料利用率,为微生物提供更多能量,不会对瘤胃发酵产生负面影响。同时植物多糖又作为不可或缺的营养物质之一,对机体不会产生负面影响,是一种前景广泛的天然CH4抑制剂,未来我们应该重点关注植物多糖对CH4产量方面的研究,以期开发出更多植物多糖CH4抑制剂。
3.6 生物碱
生物碱通常被认为是一种结构复杂、无色但具有苦味的有机碱[48],多存在于植物种子中,拥有复杂的化学性质和多种生物功能[49]。Pereira等[50]在体外发酵试验中,通过对麦麸和蒂夫顿85干草2种底物以及草粉生物碱和黄豆生物碱2种提取物进行了对比测试,结果发现,草粉生物碱在以麦麸为底物发酵中展示出了更大的抑制CH4的潜力,与对照组相比,在添加量为3.9 μg时,CH4产量降低了1.965 mL/g,乙酸和丙酸含量增加;在添加量为7.9 μg时,DMD升高,CH4产量降低了3.665 mL/g;在添加量为12.0 μg时,CH4产量虽降低了2.99 mL/g,但对比添加量为7.9 μg时抑制效果略有下降,草粉生物碱通过选择性地破坏微生物和产甲烷菌群的关系,从而减少了CH4的产生。Sousa等[51]选用胡椒生物碱提取物在4月龄杜泊羔羊上进行了饲养试验,结果发现,随着其添加剂量的增加,CH4产量呈线性下降,添加剂量小于17.3 mg/kg时,CO2产量随着胡椒生物碱提取物添加剂量的增加线性下降;当随胡椒生物碱提取物添加剂量为27.8 mg/kg时,对CH4的抑制效果减少了0.29 L/kg BW0.75,且研究中CO2产量与CH4产量呈正相关;CO2作为瘤胃中CH4形成的前体,随着胡椒生物碱提取物添加剂量的增加,CO2和CH4产量降低,说明胡椒碱影响了瘤胃微生物群的组成,调控瘤胃发酵模式向丙酸生成转变。
3.7 其他
海洋类巨藻含有丰富的碳水化合物,其化学组成在门水平上表现出差异,由于具有独特的营养特性,对CH4有抑制效果,在反刍动物生产中得以应用[52]。Choi等[53]在体外研究了5种褐藻对瘤胃发酵以及CH4产量的影响,结果发现,添加100 mg的5种褐藻均提高了VFAs含量,在发酵的前24 h,丙酸含量升高,24 h之后丙酸含量降低;在发酵48 h时均表现出对CH4的抑制,其中黑藻抑制效果最好,CH4产量减少了12.23 mL/g,其次是褐藻和裙带菜,CH4产量分别减少了10.97和9.04 mL/g。褐藻对CH4产量的影响可能是由于前期调控瘤胃发酵向丙酸方向转变,导致后期瘤胃中H2含量减少,因而导致CH4生成受到抑制。但Sucu[54]指出,不同藻类、底物、剂量作用效果存在差异,选择合适的藻类与底物进行组合才会对瘤胃表现出较好的调控作用,同时更好的抑制CH4的生成。目前此类研究多集中在体外,缺乏体内研究数据,限制了其推广应用。
研究显示,大蒜中的有机硫化合物通过影响瘤胃古菌群落组成,减少CH4的产生,且不会对瘤胃发酵产生不良影响[17]。Kang等[55]通过体外试验探究了香蕉花粉颗粒对瘤胃发酵和CH4产量的影响,结果发现添加60 g/kg香蕉花粉颗粒可减少34.7%的CH4产量,对产气量和营养物质消化率没有影响,增加了细菌的数量,提高了体外发酵效率,减少了瘤胃原虫的数量。Wang等[56]为了研究中草药对瘤胃发酵和CH4产量的影响,对100种中草药提取物进行了评估,结果发现有12种中草药提取物具有降低CH4产量的潜力,其中紫苏种子提取物的效果最好。此外,研究发现番石榴叶和芒果叶等植物也有抑制CH4的潜力,红桃树、李树等果树以及一些中大型乔木——栎树、黄花柳以及白杨等树中的天然化学物质有抑制产甲烷菌活性的作用,且对饲料营养物质消化率、瘤胃发酵没有负面影响,展现出抑制CH4的潜能[9]。但也存在一些问题,如具有刺激气味,会影响采食量,以及其是否对动物机体存在潜在毒性作用是个值得持续关注的问题。虽然已经有大量化合物及植物展现出了抑制CH4的潜力,但至今仍缺乏解决CH4问题的实用方案[17]。
4 小结
温室效应问题的解决已迫在眉睫,反刍动物作为农业领域温室气体排放的重要来源,有必要对其进行调控,目前抑制CH4的方法手段有很多,但都或多或少存在一定问题,导致无法大规模应用于生产中。植物提取物源于自然,不存在耐药性,更不会对环境造成污染的压力,在抑制瘤胃产CH4方面是一种极具前景的绿色添加剂,而且来源广泛,结构复杂多样,功能也极其丰富。本文从类黄酮、多酚、糖苷、精油、多糖、生物碱等不同植物来源的生物活性物质对反刍动物瘤胃发酵和CH4排放的影响进行了总结归纳,每种生物活性物质对瘤胃发酵和CH4产量均产生了影响,主要通过降低产甲烷菌丰度、减少瘤胃原虫数量以及改变瘤胃的发酵模式等发挥作用。自然界天然植物众多,而且不同类型的植物来源活性物质其效果存在差异,同时,也受底物类型、添加剂量、提取方法等多个因素的影响,未来研究应重点关注植物提取物对瘤胃微生物的影响,在开展体外研究的同时加大对体内试验的研究力度,探究新的研究方法,为其在反刍动物领域的应用添砖加瓦。