Effects of Compound Bacillus on Performance and Body Health of Laying Hens

JIN Qian; GAO Yan; WANG Fei; WANG Qi; XU Shujie; LIU Fang; LI Xiang; LI Weifen

doi:10.12418/CJAN2024.258

Chinese Journal of Animal Nutrition >

2024 , Vol. 36 >Issue 5: 3003 - 3014

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.258

RESEARCH PAPER

Effects of Compound Bacillus on Performance and Body Health of Laying Hens

JIN Qian ^,¹^,² ,
GAO Yan ³ ,
WANG Fei ¹ ,
WANG Qi ¹ ,
XU Shujie ¹ ,
LIU Fang ¹ ,
LI Xiang ¹ ,
LI Weifen ^,¹^,^*

Expand

¹ Institute of Feed Science, College of Animal Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China
² Hainan Institute, Zhejiang University, Sanya 572000, China
³ Hangzhou Biocom Biotech Co., Ltd., Hangzhou 310014, China

^* professor, E-mail: wfli@zju.edu.cn

Received date: 2023-12-08

Online published: 2024-05-15

Fold

Abstract

This experiment was conducted to investigate the effects of dietary compound Bacillus (Bacillus amyloliquefaciens SC06 and B. subtilis 10) on performance and body health of laying hens. A total of 180 10-week-old Jingbai No.1 laying hens were randomly divided into 2 groups (6 replicates per group and 15 hens per replicate): hens in the control group (CK group) were fed a basal diet, and hens in the experimental group (Bas group) were fed the basal diet supplemented with 5×10⁸ CFU/kg compound Bacillus. The pre-trial period was 1 week and the experimental period was 18 weeks. The results showed as follows: compared with the CK group, 1) compound Bacillus increased the average egg weight, eggshell strength and eggshell thickness (P<0.05), however, there were no significant effects on body weight, organ indexes and follicle number of laying hens (P>0.05); 2) the contents of phosphorus and oxytocin in serum were significantly increased by complex Bacillus (P<0.05), calcium content was increased (P=0.10), and the relative expression level of follicle-stimulating hormone receptor gene in ovary was significantly increased (P<0.05); 3) compound Bacillus could significantly increase the total antioxidant capacity (T-AOC) in serum, the activity of glutathioneperoxidase (GSH-Px) in liver and ovarian, and significantly decrease the malondialdehyde (MDA) content and the gene expression level of Kelch like epichlorohydrin associated protein 1 (KEAP1) in ovary (P<0.05), thus improving the antioxidant capacity of hens; 4) compound Bacillus significantly decreased the gene expression levels of interleukin-2 (IL-2) and interleukin-8 (IL-8) in liver and that of IL-2 in ovary (P<0.05), while increasing the gene expression level of IL-8 in ovary (P<0.05). In conclusion, dietary supplementation of 5×10⁸ CFU/kg compound Bacillus can increase the contents of calcium, phosphorus and follicle-stimulating hormone in serum, hormone receptor gene expression levels in ovary and anti-inflammatory and antioxidant capacity of the body, so as to improve eggshell quality and production efficiency of laying hens.

Key words： Bacillus; laying hens; performance; anti-inflammatory; anti-oxidation

Cite this article

JIN Qian , GAO Yan , WANG Fei , WANG Qi , XU Shujie , LIU Fang , LI Xiang , LI Weifen . Effects of Compound Bacillus on Performance and Body Health of Laying Hens[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2024 , 36(5) : 3003 -3014 . DOI: 10.12418/CJAN2024.258

提高产蛋性能和蛋品质是蛋鸡养殖的主要目标,为此植物提取物、益生菌、益生元等生物饲料添加剂在蛋禽生产中得到了广泛的应用^[1]。益生菌是一类对宿主有益的活性微生物,具有无毒、无耐药性、无残留等诸多优点,可以通过刺激有益微生物生长、减少病原体数量、抵抗微生物感染、增强肠道屏障、改善宿主微生态平衡,从而促进生长发育、提高免疫力,而且在改善蛋品质、提高生产效率方面卓有成效^[2⇓-4]。其中,芽孢杆菌具有良好的稳定性和抗逆性,因此是一种安全且优质的禽类饲料添加剂^[5]。由于食用益生菌直接影响肠道,而家禽肠道拥有一个以细菌为主的复杂微生物群落,在宿主生理和肠道健康中起着关键作用,因此目前对芽孢杆菌的益生作用的研究主要集中于此。芽孢杆菌的菌株特异性很强,根据芽孢杆菌菌株的不同可发挥不同的作用。例如,同为枯草芽孢杆菌,菌株DSM32315的代谢物质可以激活辅助T细胞从而提高蛋鸡的免疫能力^[6];菌株KC1可通过富集肠道中其他益生菌如双歧杆菌来改善肠道屏障功能^[7];菌株PM5可与巨噬细胞结合抑制肠道中有害菌群大肠杆菌的黏附^[8],最终均可提高蛋鸡生产效率。由于菌株的不同特性,与单一菌相比,益生菌的复合使用会对机体产生更全面的影响^[9]。前期试验发现,枯草芽孢杆菌10(B10)和解淀粉芽孢杆菌SC06(BaSC06)均有增强肠道屏障功能的作用,在肉鸡、仔猪中均表现出良好的促健康和促生长作用,但两者作用机理有所差异;其中B10可增强巨噬细胞免疫功能,对肠道微生物群落结构表现出良好的调节功能^[10],BaSC06可以抑制大肠杆菌和产气荚膜梭菌,通过降低肠道中有害微生物的丰度来提高肠道屏障功能,并可提高畜禽消化吸收能力和抗氧化能力,最终提高家畜的生长性能^[11-12]。因此,本试验将BaSC06和B10复合使用作为饲料添加剂,探究其在蛋鸡生产上是否能表现出优异的效率,并针对肝脏和卵巢探究该复合芽孢杆菌制剂对蛋鸡机体健康和产蛋性能的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

复合芽孢杆菌制剂由BaSC06和B10混合制备,其菌落形成单位均为1×10⁹ CFU/g。收集BaSC06和B10菌液在3 500×g下4 ℃离心10 min后,然后用无菌磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.2)清洗3次。最后将2种芽孢杆菌制剂按1∶1的比例混合,形成含1×10⁹ CFU/g芽孢杆菌的复合益生菌制剂。

1.2 试验设计及饲养管理

本试验选取体重、营养状况相近的10周龄京白1号蛋鸡180只,经过1周的预试期后随机分为2组,每组6个重复,每个重复15只。正试期18周。对照组(CK组):基础饲粮,其中11~18周龄饲喂基础育成期饲粮,19~29周龄饲喂基础产蛋期饲粮;复合芽孢杆菌组(Bas组):基础饲粮中添加5×10⁸ CFU/kg复合芽孢杆菌制剂。试验鸡育成期采用4层阶梯式笼养,每笼5只;产蛋期采用3层阶梯式笼养,每笼5只。人工饲喂,每日饲喂2次,分别为10:00和17:00,并在同一时间捡蛋。试验期间,各组母鸡均可自由采食和饮水,光照、温度、湿度、通风及免疫接种等措施按照鸡场常规饲养管理进行。每天记录每组蛋鸡的产蛋数、蛋重及采食量。

1.3 试验饲粮

育成期饲粮和产蛋期饲粮配方选用玉米-豆粕型基础饲粮,参照NRC(1994)和《京白1号蛋鸡2022版饲养管理手册》中京白蛋鸡营养推荐量配制,基础饲粮组成及营养水平见表1。饲粮代谢能水平参考《中国饲料成分及营养价值表(2022年第33版)》中各原料成分中代谢能水平计算得出。在试验第1天、第70天分别采集各组200 g饲粮样品,置于干燥器中保存,用于检测常规养分含量。饲粮中粗蛋白质含量的测定参照《饲料中粗蛋白测定方法》(GB/T 6432—2018),钙含量的测定参照《饲料中钙的测定》(GB/T 6436—2002),总磷含量的测定参照《饲料中总磷的测定》(GB/T 6437—2018),氨基酸含量测定方法参照《饲料中氨基酸的测定》(GB/T 18246—2019)中的常规水解法。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) %

项目 Items	含量Content
项目 Items	11~18周龄 11 to 18 weeks of age	19~29周龄 19 to 29 weeks of age
原料Ingredients
玉米Corn	58.00	59.20
豆粕Soybean meal	30.00	26.50
玉米蛋白粉Corn gluten meal	4.00
大豆油Soybean oil	3.00	2.20
食盐NaCl	0.30	0.30
石粉Limestone	1.50	8.60
磷酸氢钙CaHPO₄	1.20	1.20
预混料Premix¹⁾	2.00	2.00
合计Total	100.00	100.00
营养水平Nutrient levels²⁾
代谢能ME/(MJ/kg)	12.77	11.40
粗蛋白质CP	20.55	16.27
钙Ca	1.04	3.48
总磷TP	0.65	0.56
苏氨酸Thr	0.75	0.69
色氨酸Try	0.21	0.18
赖氨酸Lys	1.15	0.82
蛋氨酸Met	0.52	0.39
蛋氨酸+半胱氨酸Met+Cys	0.85	0.64

1)预混料为每千克饲粮提供The premix provided the following per kg of diets:VA 6 250 IU,VB₁ 1 mg,VB₂ 8.5 mg,VB₃ 32.5 mg,VB₅ 50 mg,VB₆ 8 mg,VB₁₂ 5 mg,VD₃ 3 125 IU,VE 15 IU,VK₃ 2 mg,VH 1 mg,叶酸 folic acid 5 mg,氯化胆碱choline chloride 500 mg,I (as potassium iodide) 0.35 mg,Fe (as ferrous sulfate) 60 mg,Mn (as manganese sulfate) 65 mg,Zn (as zinc sulfate) 66 mg,Se (as sodium selenite) 0.3 mg。

2)代谢能为计算值,其余为实测值。ME was a calculated value, while the others were measured values.

1.4 样品采集

在试验结束前1天,蛋鸡禁食12 h。在各组中随机选取12只蛋鸡(每个重复2只)进行屠宰,颈动脉采血装入5 mL促凝管中,37 ℃水浴2 h析出血清后,1 000×g离心10 min,收集血清保存于-80 ℃超低温冰箱中,用于后续血清指标测定。

剪取适量肝脏、空肠、卵巢样品用锡箔纸包裹;分离1 cm左右的空肠肠段和0.2 cm²的卵巢基质,置于2.5%戊二醛中,避光保存。最后,将收集的组织样和内容物立即置于液氮中冷冻,然后转移至-80 ℃保存,用于后续试验分析。

1.5 指标测定

1.5.1 生长发育

1.5.1.1 体重

以每个重复为单位,于蛋鸡11、21、29周龄喂食前称量体重,计算平均值。

1.5.1.2 器官指数

试验结束时每个重复随机选取1只鸡,记录活体重,屠宰后完整摘取肝脏、脾脏、两侧肾脏、卵巢,使用生理盐水清洗后用滤纸擦干,称重记录,计算各部位器官指数。计算公式为:

器官指数=器官鲜重(g)/活体重(g)。

1.5.1.3 卵泡发育

将完整摘取的卵巢浸泡在生理盐水中,分离每个卵泡并由大到小排序,使用游标卡尺测量每个卵泡的最大直径,按照卵泡分级标准统计数量。

1.5.2 产蛋性能

在21~22周龄、27~28周龄分别统计每个重复蛋鸡饲粮的消耗量。每天16:00收集鸡蛋,记录产蛋数,称量鸡蛋质量。计算蛋鸡的平均日采食量、平均蛋重、产蛋率、料蛋比。计算公式如下:

平均日采食量[g/(只·d)]={[饲粮总重(g)-
饲粮末重(g)]/蛋鸡数}/试验天数(d);

产蛋率(%)=[(总产蛋数/蛋鸡数)/
试验天数(d)]×100;

料蛋比=饲粮用量(kg)/蛋重(kg);

平均蛋重(g)=总蛋重(g)/总产蛋数。

1.5.3 蛋品质

采样前1天每组随机选取9枚鸡蛋进行蛋品质测定。利用电子天平(YH-M10001)称量蛋重、蛋黄重和蛋壳重。用数字测蛋仪(DET-6000,NABEL,日本)测定蛋形指数、蛋壳强度、蛋白高度、哈氏单位(HU)、蛋黄颜色和蛋黄比率。蛋壳厚度由蛋壳厚度计(Robotmation有限公司,日本)测量,其值在鸡蛋的上、中、底3个不同位置取平均值。蛋黄总胆固醇(T-CHO)和甘油三酯(TG)含量使用南京建成生物工程研究所相应的试剂盒测定。

1.5.4 血清生化、激素及抗氧化指标及肝脏和卵巢抗氧化指标

血清中肝脏功能指标:碱性磷酸酶(AKP)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)活性及一氧化氮(NO)含量;血清钙、磷和激素指标:钙、磷、促黄体生成素(LH)、孕酮(Prog)、雌二醇(E2)、催产素(OT)、促卵泡生成素(FSH)含量;血清抗氧化指标:丙二醛(MDA)含量,总抗氧化能力(T-AOC)及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、血红素氧化酶-1(HO-1)活性。以上指标均使用南京建成生物工程研究所试剂盒,按照说明说进行测定。

取约0.1 g肝脏和卵巢组织,加入900 μL生理盐水,使用组织研磨机充分研磨均匀,随后1 000×g、4 ℃离心10 min,吸取上清用于测定抗氧化指标。肝脏和卵巢抗氧化指标:MDA含量,T-AOC及GSH-Px、SOD、CAT活性。以上指标均使用南京建成生物工程研究所试剂盒,按照说明说进行测定。

1.5.5 基因表达水平的测定

取约0.1 g肝脏和卵巢组织,放入1.5 mL无酶离心管中,加入1 mL Trizol,利用组织研磨机充分研磨均匀,随后1 000×g 4 ℃离心15 min,吸取上清于新的无菌EP管中,并置于冰上,用于后续RNA的提取。RNA提取和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)按照制造商的方案使用RNAiso plus (TaKaKa)进行RNA提取,然后使用PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Vazyme)根据制造商的说明书合成cDNA。具体试验步骤如下:取1 μg RNA与4 μL 4× gDNA wiper Mix混合,加入RNAase-free ddH₂O定容至16 μL,用枪头轻轻吹打混匀。随后在42 ℃条件下反应2 min以达到去除基因组DNA的目的。反应结束后,在先前的反应管中直接加入4 μL 5×HiScript Ⅲ qRT SuperMix,吹打混匀后,进行反应37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,结束后产物可立即用于下一步RT-qPCR试验,或在-20 ℃保存。RT-qPCR分析使用ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix试剂盒(Vazyme),具体RT-qPCR反应体系如表2所示。

表2 RT-qPCR反应体系

Table 2 Reaction system of RT-qPCR

试剂Reagent	用量Amount/μL
2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix	5.0
上游引物Forward primer (10 μmol/L)	0.2
下游引物Reverse primer (10 μmol/L)	0.2
cDNA模板Template cDNA	0.5
双蒸水ddH₂O	4.1
合计Total	10.0

根据制造商手册使用StepOne Plus Real-Time PCR系统(Applied Biosystems,美国),具体反应程序如下:初始阶段95 ℃加热100 s,使cDNA变性,随后进入循环扩增阶段,先95 ℃保持10 s,随后降温至60 ℃保持30 s,循环45次,最后阶段先95 ℃保持15 s,再降至60 ℃维持60 s,形成熔解曲线。

本研究使用的引物是使用NCBI引物blast工具设计的。所有靶基因引物序列见表3。归一化后计算内参基因β-肌动蛋白(β-actin)的折叠变化,并使用2^-ΔΔCt方法计算目的基因相对表达量。所有试验均为3次重复。

表3 RT-qPCR的引物序列信息

Table 3 Primer sequence information of RT-qPCR

基因名称 Gene names	引物序列 Primer sequences (5'—3')	序列号 Sequence number
β-肌动蛋白β-actin	F:CATTGTCCACCGCAAATGCT R:AAGCCATGCCAATCTCGTCT	NM_205518
超氧化物歧化酶SOD	F:TGTGCATGAATTTGGAGACAAC R:TTGCAGTCACATTGCCGAG	NM_205064
谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px	F:CAGTAAAGGAAAGCCCGCAC R:GCTGTTCCCCCAACCATTTC	NM_001277853
白细胞介素-1β IL-1β	F:TCTGCCTGCAGAAGAAGCC R:CCTCACTTTCTGGCTGGAGG	NM_204524
白细胞介素-2 IL-2	F:ATCTTTGGCTGTATTTCGGTAG R:CCTGGGTCTCAGTTGGTGTGTA	NM_204153
白细胞介素-4 IL-4	F:AATTGTTTGGGAGAGCCAGCA R:ATTCAGGAGCTGACGCATGTT	NM_001007079
白细胞介素-8 IL-8	F:AGCACTCATTCTAAGTTCATCC R:CCAAGCACACCTCTCTTCCATC	NM_205498
白细胞介素-10 IL-10	F:TGCTGCGCTTCTACACAGAT R:TGGCTTTGCTCCTCTTCTCG	NM_001004414
白细胞介素-13 IL-13	F:GGTCCCTTGCAATGACACCA R:GTGATGAGGGGCTCGTAGTC	NM_001007085
白细胞介素-17 IL-17	F:TCAACTCCGTGCCCATCAAA R:TGCTAATCGTTACGGCCTGG	NM_204460
白细胞介素-18 IL-18	F:ATAAAACTATCAAACGATTCTT R:TCCCTGCTGAAGGCGCGGTGGT	NM_204608
雌激素受体α ESRα	F:CTCTCACCCTTCATCCATCACC R:CCTCACAAGACCAGACCCCATA	NM_205183
雌激素受体β ESRβ	F:AAGAAGAGAACGCTGTGGGTAT R:CTCGGTGAATGGTTTGCTAGGA	NM_001396358
Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1 KEAP1	F:CTCGCCCTCCAAGGATTACC R:AAGGATTGGCGGAAGTAGCC	XM_005515118
胃饥饿素Ghrelin	F:GCTCTGGCTGGCTCTAGTTTTT R:TTCTGTGCCTCGGCGATGTAAT	NM_001001131
抑制素INH	F:CAAAAGGATGTGAGGAGGGTGC R:CCGAGGGCTGGAAGAGGTAAGT	NM_001031257
促性腺激素释放激素GNRH	F:TGCTTGGCTCAACACTGGTCTT R:TCCTTTCTTCTGGCTTCTCCTT	NM_001080877
促卵泡激素受体FSHR	F:CCAATGCCACAGAACTGAGATT R:CTTATGGACGACGGGTAAAAAG	NM_205079

1.6 苏木精-伊红(HE)染色

用4%多聚甲醛固定蛋鸡肝脏和卵巢基质,石蜡包埋,切片,脱水,HE染色。图像由Olympus Microsystem (日本东京)拍摄。

1.7 卵巢电镜

将卵巢基质组织切成1 mm×3 mm×1 mm的大小,放入新鲜的2.5%戊二醛固定液中,固定过夜。随后倒掉固定液,用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液漂洗样品3次,每次15 min。用1%的锇酸溶液固定样品2 h后,用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液漂洗样品3次,每次15 min。然后经梯度上升(30%、50%、70%、80%)的乙醇快速脱水后包埋做切片,进行醋酸铀及枸橼酸铅染色处理,在型号为JEM-1200EX的透射电镜下观察卵巢颗粒细胞线粒体形态并摄影。

1.8 数据统计与分析

使用SPSS 22.0统计软件独立样本t检验对所得数据进行统计分析,2组数据均以“平均值±标准差”表示,P≤0.05表示差异显著,0.05<P≤0.10表示有相应变化趋势。

2 结果

2.1 复合芽孢杆菌对蛋鸡产蛋性能及蛋品质的影响

由表4可知,蛋鸡由开产到产蛋高峰的产蛋率及平均蛋重快速提高,与CK组相比,Bas组的平均蛋重显著提高(P<0.05),但料蛋比和平均日采食量无显著差异(P>0.05)。其中Bas组在产蛋初期产蛋率略低于CK组,但在高峰期产蛋率提高了约2%,提高了综合效益。

表4 复合芽孢杆菌对蛋鸡产蛋性能的影响

Table 4 Effects of compound Bacillus on laying performance of laying hens

项目 Items	对照组 CK group	复合芽孢杆菌组 Bas group	P值 P-value
21~22周龄(产蛋初期) 21 to 22 weeks of age (early laying period)
平均日采食量Average daily feed intake/[g/(只·d)]	86.56±6.69	85.88±11.62	0.93
料蛋比Feed-egg ratio	7.06±4.32	7.58±5.70	0.39
产蛋率Laying rate/%	59.99±10.45	55.71±5.59	0.35
平均蛋重Average egg weight/g	45.84±2.52^b	51.41±3.36^a	<0.01
27~28周(产蛋高峰) 27 to 28 weeks of age (laying peak period)
平均日采食量Average daily feed intake/[g/(只·d)]	113.31±5.02	114.26±5.17	0.83
料蛋比Feed-egg ratio	2.13±0.12	2.09±0.10	0.22
产蛋率Laying rate/%	95.23±3.77	97.38±1.88	0.20
平均蛋重Average egg-weight/g	53.06±1.96^b	59.26±2.13^a	<0.01

	同行数据肩标无字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。
	In the same row, values with no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

由表5可知,与CK组相比,复合益生菌显著提高了蛋壳强度和蛋壳厚度(P<0.05),但蛋黄比率显著下降(P<0.05)。同时,蛋黄中的总胆固醇和甘油三酯含量显著降低(P<0.05)。

表5 复合芽孢杆菌对蛋品质的影响

Table 5 Effects of compound Bacillus on egg quality

项目 Items	对照组 CK group	复合芽孢杆菌组 Bas group	P值 P-value
蛋壳比率Eggshell ratio/%	13.10±1.11	13.10±0.80	0.99
蛋黄重Yolk weight/g	11.13±0.95	11.26±0.63	0.70
蛋黄比率Yolk ratio/%	24.33±2.25^a	21.44±1.07^b	<0.01
蛋壳强度Eggshell strength/kgf	3.82±0.76^b	4.32±0.61^a	0.04
蛋壳厚度Eggshell thickness/mm	0.31±0.02^b	0.34±0.03^a	<0.01
蛋白高度Albumen height/mm	6.88±1.35	7.80±1.67	0.21
哈氏单位Haugh unit	86.68±8.47	89.99±7.91	0.40
蛋黄颜色Yolk color	7.67±1.41	7.11±0.78	0.31
蛋形指数Egg shape index/%	1.32±0.05	1.33±0.04	0.81
蛋黄总胆固醇Yolk T-CHO/(mmol/L)	0.95±0.16^a	0.75±0.17^b	0.04
蛋黄甘油三酯Yolk TG/(mmol/L)	7.29±1.04^a	5.69±0.71^b	<0.01

2.2 复合芽孢杆菌对蛋鸡生长发育和肝脏健康情况的影响

由表6可知,Bas组与CK组体重和器官指数并未出现显著差异(P>0.05),各级卵泡数量未发生显著变化(P>0.05)。

表6 复合芽孢杆菌对蛋鸡体重、器官指数及卵泡发育的影响

Table 6 Effects of compound Bacillus on body weight, organ indexes and follicular development of laying hens

项目 Items	对照组 CK group	复合芽孢杆菌组 Bas group	P值 P-value
11周龄体重Body weight of 11 weeks of age/g	783.33±28.41	790.83±18.13	0.67
21周龄体重Body weight of 21 weeks of age/g	1 516.67±66.80	1 438.89±52.75	0.35
29周龄体重Body weight of 29 weeks of age/g	1 466.67±118.25	1 492.56±65.66	0.57
肝脏指数Liver index/×10^-2	1.82±0.29	1.72±0.09	0.32
脾脏指数Spleen index/×10^-3	1.05±0.18	1.03±0.22	0.78
肾脏指数Kidney index/×10^-3	6.24±1.01	6.16±0.90	0.86
卵巢指数Ovary index/×10^-2	3.26±0.83	3.19±0.27	0.79
等级卵泡数量Number of hierarchical follicles/个	6.20±1.79	5.20±0.84	0.29
小黄卵泡数量Number of small yellow follicles (8 to 10 mm)/个	1.80±1.79	2.40±1.14	0.54
大白卵泡数量Number of large white follicles (6 to 8 mm)/个	8.80±5.63	8.20±5.76	0.87
中白卵泡数量Number of mid white follicles (4 to 6 mm)/个	13.80±2.77	15.40±3.51	0.44
小白卵泡数量Number of small white follicles (2 to 4 mm)/个	26.40±11.46	26.00±8.40	0.95

对肝脏和卵巢组织的HE染色显示(图1),2组的肝脏和卵泡膜细胞形态完整,结构清晰,CK组显示有部分出血,细胞核较模糊,细胞间隙较大,而Bas组肝脏的细胞排列更为紧密,且细胞核更清晰。透射电镜观察显示,与CK组相比,Bas组的卵巢基质细胞中线粒体嵴断裂及空泡减少。

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图1 复合芽孢杆菌对蛋鸡肝脏及卵巢组织的影响

A:HE染色观察 ;B:透射电镜观察。A:HE staining observation; B: transmission electron microscope observation.

→表示线粒体 →for mitochondria。

Fig.1 Effects of compound Bacillus on liver and ovary tissues of laying hens

由表7可知,与CK组相比,Bas组血清NO含量显著提高(P<0.05),碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶和乳酸脱氢酶的活性没有显著变化(P>0.05)。

表7 复合芽孢杆菌对蛋鸡血清中肝脏功能指标的影响

Table 7 Effects of compound Bacillus on liver function indexes in serum of laying hens

项目 Items	对照组 CK group	复合芽孢杆菌组 Bas group	P值 P-value
碱性磷酸酶AKP/(U/L)	150.51±56.90	200.84±63.11	0.13
谷丙转氨酶ALT/(U/L)	1.65±0.55	1.03±0.45	0.75
谷草转氨酶AST/(U/L)	34.46±9.01	39.73±4.82	0.17
乳酸脱氢酶LDH/(U/L)	7 748.52±1 672.50	8 380.88±1 167.57	0.39
一氧化氮NO/(μmol/L)	38.25±16.39^b	78.85±18.52^a	<0.01

2.3 复合芽孢杆菌对蛋鸡血清钙、磷和激素含量以及卵巢激素和激素受体的基因表达的影响

与CK组相比,Bas组血清中与蛋壳形成相关的钙含量呈上升趋势(P=0.10),磷含量显著提高(P<0.05)。与产蛋率相关的催产素含量显著提高(P<0.05)(表8);且卵巢中促卵泡激素受体(FSHR)基因相对表达量显著提高(P<0.05),而胃饥饿素(Ghrelin)基因相对表达量显著降低(P<0.05)(表9)。

表8 复合芽孢杆菌对蛋鸡血清钙、磷和激素含量的影响

Table 8 Effects of compound Bacillus on serum calcium, phosphorus and hormone contents of laying hens

项目 Items	对照组 CK group	复合芽孢杆菌组 Bas group	P值 P-value
钙Ca/(mmol/L)	4.41±0.49	5.11±1.08	0.10
磷P/(mmol/L)	0.71±0.21^b	2.34±1.01^a	<0.01
促黄体生成素LH/(mIU/mL)	6.27±1.84	7.41±1.44	0.30
孕酮Prog/(ng/mL)	4.72±3.61	4.42±1.62	0.85
雌二醇E2/(ng/L)	48.30±13.18	41.85±15.66	0.41
催产素OT/(ng/L)	33.01±9.43^b	43.33±7.16^a	0.04
促卵泡生成素FSH/(mIU/mL)	140.96±6.46	141.06±10.79	0.98

表9 复合芽孢杆菌对蛋鸡卵巢中激素和激素受体的基因表达的影响

Table 9 Effects of compound Bacillus on hormone and hormone receptor gene expression in ovary of laying hens

项目 Items	对照组 CK group	复合芽孢杆菌组 Bas group	P值 P-value
雌激素受体α ESRα	1.05±0.37	1.11±0.23	0.76
雌激素受体β ESRβ	1.12±0.50	1.12±0.27	0.99
胃饥饿素Ghrelin	1.01±0.14^a	0.36±0.19^b	0.01
抑制素INH	1.03±0.28	0.81±0.20	0.26
促性腺激素释放激素GNRH	1.01±0.18	1.07±0.41	0.84
促卵泡激素受体FSHR	1.01±0.17^b	1.50±0.41^a	0.05

2.4 复合芽孢杆菌对蛋鸡血清、卵巢和肝脏抗氧化指标的影响

与CK组相比,Bas组血清中T-AOC显著提高(P<0.05),但SOD、CAT、GSH-Px、HO-1活性均无显著变化(P>0.05)(表10);Bas组肝脏中GSH-Px活性显著提高(P<0.05),而GSH-Px的基因相对表达量显著降低(P<0.05)(表11)。同时,与CK组相比,Bas组卵巢中MDA含量显著降低(P<0.05),而GSH-Px活性显著提高(P<0.05),Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(KEAP1)的基因相对表达量显著降低(P<0.05)(表12)。

表10 复合芽孢杆菌对蛋鸡血清抗氧化指标的影响

Table 10 Effects of compound Bacillus on serum antioxidant indexes of laying hens

项目 Items	对照组 CK group	复合芽孢杆菌组 Bas group	P值 P-value
丙二醛MDA/(nmol/mL)	5.63±1.64	6.07±0.80	0.54
总抗氧化能力T-AOC/(U/mL)	3.93±1.53^b	4.67±0.91^a	0.05
超氧化物歧化酶SOD/(U/mL)	309.99±13.67	314.93±8.60	0.37
过氧化氢酶CAT/(U/mL)	4.40±1.95	4.01±1.33	0.20
谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px/(U/mL)	1 590.17±178.63	1 568.36±164.56	0.32
血红素氧化酶-1 HO-1/(ng/mL)	77.34±12.95	74.24±16.27	0.71

表11 复合芽孢杆菌对蛋鸡肝脏抗氧化指标和相关基因表达的影响

Table 11 Effects of compound Bacillus on liver antioxidant indexes and related gene expression of laying hens

项目 Items	对照组 CK group	复合芽孢杆菌组 Bas group	P值 P-value
肝脏抗氧化指标Antioxidant indexes of liver
丙二醛MDA/(nmol/mg prot)	2.21±0.48	2.73±1.15	0.37
总抗氧化能力T-AOC/(U/mg prot)	0.91±0.13	0.76±0.19	0.13
谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px/(U/mg prot)	44.04±8.62^b	54.74±8.70^a	0.04
超氧化物歧化酶SOD/(U/mg prot)	2 227.05±253.39	2 136.74±452.84	0.63
过氧化氢酶CAT/(U/mg prot)	85.13±24.00	86.97±20.14	0.87
肝脏抗氧化基因表达水平Expression levels of liver antioxidant genes
超氧化物歧化酶SOD	1.04±0.29	0.77±0.27	0.19
谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px	1.07±0.15^a	0.61±0.35^b	0.04

表12 复合芽孢杆菌对蛋鸡卵巢抗氧化指标和相关基因表达的影响

Table 12 Effects of compound Bacillus on ovary antioxidant indexes and related gene expression of laying hens

项目 Items	对照组 CK group	复合芽孢杆菌组 Bas group	P值 P-value
卵巢抗氧化指标Antioxidant indexes of ovary
丙二醛MDA/(nmol/mg prot)	0.84±0.18^a	0.51±0.09^b	<0.01
总抗氧化能力T-AOC/(U/mg prot)	0.82±0.49	0.65±0.27	0.45
谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px/(U/mg prot)	44.63±13.62^b	65.40±17.20^a	0.03
超氧化物歧化酶SOD/(U/mg prot)	408.63±109.91	335.62±36.31	0.15
过氧化氢酶CAT/(U/mg prot)	0.50±0.34	0.44±0.08	0.75
卵巢抗氧化基因表达水平Expression levels of ovary antioxidant genes
超氧化物歧化酶SOD	1.01±0.17	0.97±0.27	0.80
谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px	1.07±0.39	1.07±0.25	0.98
Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1 KEAP1	1.04±0.29^a	0.24±0.14^b	0.01

2.5 复合芽孢杆菌对蛋鸡肝脏、卵巢抗炎指标的影响

与CK组相比,Bas组肝脏中促炎因子IL-2和IL-8的基因相对表达量显著降低(P<0.05)(表13);同时复合芽孢杆菌显著降低了卵巢中促炎因子IL-1β和IL-2的基因相对表达量(P<0.05),显著提高了卵巢IL-8基因相对表达量(P<0.05)(表14)。

表13 复合芽孢杆菌对蛋鸡肝脏抗炎基因表达的影响

Table 13 Effects of compound Bacillus on anti-inflammatory gene expression in liver of laying hens

项目 Items	对照组 CK group	复合芽孢杆菌组 Bas group	P值 P-value
白细胞介素-1β IL-1β	1.08±0.39	1.15±0.29	0.78
白细胞介素-2 IL-2	1.17±0.70^a	0.13±0.08^b	0.03
白细胞介素-4 IL-4	1.08±0.43	0.63±0.31	0.12
白细胞介素-8 IL-8	1.27±0.77^a	0.26±0.11^b	0.03
白细胞介素-18 IL-18	1.14±0.59	0.64±0.22	0.20

表14 复合芽孢杆菌对蛋鸡卵巢抗炎基因表达的影响

Table 14 Effects of compound Bacillus on anti-inflammatory gene expression in ovary of laying hens

项目 Items	对照组 CK group	复合芽孢杆菌组 Bas group	P值 P-value
白细胞介素-1β IL-1β	1.04±0.26^a	0.63±0.16^b	0.05
白细胞介素-2 IL-2	1.07±0.38^a	0.47±0.13^b	0.02
白细胞介素-4 IL-4	1.10±0.44	1.21±0.30	0.70
白细胞介素-8 IL-8	1.09±0.41^b	2.90±0.58^a	0.01
白细胞介素-10 IL-10	1.07±0.39	1.59±1.34	0.54
白细胞介素-13 IL-13	1.18±0.74	0.72±0.21	0.41
白细胞介素-17 IL-17	1.12±0.56	2.13±0.52	0.09
白细胞介素-18 IL-18	1.11±0.47	1.01±0.29	0.75

3 讨论

关于在蛋鸡饲粮中添加益生菌的有益影响研究非常多,但主要集中在通过保护肠道屏障功能进而提高生产性能^[13]。目前已经明确BaSC06通过提高产丁酸细菌的绝对丰度改善肠道屏障,B10可激活并增强巨噬细胞的免疫功能,促进肠道屏障健康,提高抗炎、抗氧化能力^[14⇓-16],并且相关的代谢产物可由肠道吸收,经肠-肝轴影响机体健康,进而影响生产效率。除肠道健康以外,本试验进一步证实了饲喂益生菌可调节激素和机体抗炎、抗氧化能力,从而提高蛋鸡产蛋率和蛋品质。

蛋壳含85%的碳酸钙和0.9%的磷成分,产蛋率的提高也加重了机体对钙和磷的需求^[17]。Kwiatkowska等^[18]的试验证实了益生菌可以刺激家禽体内钙的积累,这一结果与本研究结果一致,蛋鸡血清中丰富的钙和磷储备供给蛋壳形成,有效提高了蛋壳厚度和强度。

蛋鸡的生产效率直接受到激素调节,研究报道,生殖激素如催产素和类固醇激素等对促进颗粒细胞的增殖分化、卵泡的成熟起着重要作用^[19],而FSH会刺激卵泡发育和成熟,FSHR是FSH的受体,在卵巢的颗粒细胞中有高表达,与卵黄发生有关^[20]。本试验证实了复合芽孢杆菌可以通过上调血清中催产素的含量和卵巢中激素受体FSHR的表达等促进卵泡发育、刺激排卵,最终提高产蛋率。同时,卵巢中IL-8的基因相对表达量显著提高。有研究认为,IL-8虽为传统意义上的促炎因子,但可诱导黄体中血管生成、促进卵泡发育、刺激排卵等^[21-22],这一结果与产蛋率提高结果相一致。

已有研究表明,炎症和氧化应激交互作用影响着机体的整体健康^[23],高浓度的活性氧(ROS)可诱导促炎因子的产生和细胞的凋亡,最终导致细胞死亡^[24],从而影响蛋鸡的生产效率。本试验发现,复合芽孢杆菌提高了蛋鸡的抗炎、抗氧化能力。机体抗氧化能力主要体现为对自由基的清除能力和细胞氧化损伤的修复能力、对抗氧化酶活性、对氧化信号通路的调控等方面^[23]。机体的抗氧化防御系统主要利用抗氧化酶CAT、GSH-Px和SOD来清除多余的自由基^[25],以保护机体免受氧化损伤。本试验中,复合芽孢杆菌提高了蛋鸡肝脏、血清、卵巢中的抗氧化指标,具体表现为血清中T-AOC提高,肝脏和卵巢主要为GSH-Px活性的提高,且卵巢的MDA含量显著降低,表明复合芽孢杆菌具有缓解氧化应激的效果。同时,本试验发现,肝脏中的促炎因子IL-2和IL-8和卵巢中的促炎因子IL-1β和IL-2基因相对表达量降低,直接证明复合芽孢杆菌可降低机体的炎症水平,这一结果与Xu等^[26]和Khochamit等^[27]的研究结果一致。研究表明,GSH-Px可以调节谷胱甘肽的含量,进而调节细胞核因子-κB(NF-κB)信号通路^[28],同时Jung等^[29]也发现芽孢杆菌可抑制NF-κB信号通路的表达,降低炎症反应。从本试验结果可推测,复合芽孢杆菌通过提高肝脏和卵巢中的GSH-Px活性来调节谷胱甘肽含量,进而调节NF-κB信号通路,降低机体炎症反应。

4 结论

饲粮中添加5×10⁸ CFU/kg复合芽孢杆菌可通过上调血清钙和磷含量提高蛋壳品质,并通过提高血清中催产素含量和卵巢中生殖激素基因表达水平及抗炎、抗氧化能力来提高蛋鸡的产蛋率。

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