Chinese Journal of Animal Nutrition >

2024 , Vol. 36 >Issue 5: 3035 - 3048

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.261

RESEARCH PAPER

Alleviating Effects of Different Dietary Levels of Bifidobacterium on Ileum Injury of Goslings under Lipopolysaccharide Stress

  • CHEN Shi , 1 ,
  • FU Zhenming 1 ,
  • WANG Jian 2, 3 ,
  • FAN Zhongjun , 4, ** ,
  • WANG Jun 2, 3 ,
  • WANG Zhiyue 1 ,
  • YANG Haiming , 1, **
Expand
  • 1 College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China
  • 2 Jiangsu Agri-Animal Husbandry Vocational College, Taizhou 225300, China
  • 3 National Waterfowl Gene Bank (Jiangsu), Taizhou 225300, China
  • 4 School of Marine and Biological Engineering, Yancheng Teachers University, Yancheng 224002, China
** FAN Zhongjun, associate professor, E-mail: ;
YANG Haiming, professor, E-mail:

*Contributed equally

Received date: 2023-11-21

  Online published: 2024-05-15

Fold

Abstract

The aim of this study was to investigate the alleviating effects of different dietary levels of Bifidobacterium on ileum injury of goslings under lipopolysaccharide (LPS) stress. A total of 288 one-day-old male Jiangnan white goose chicks were randomly divided into 6 groups with 6 replicates per group and 8 chicks per replicate. A 3×2 two-factor design was adopted, and the two factors were Bifidobacterium supplemental level (0, 300 and 600 mg/kg Bifidobacterium freeze-dried powder was supplemented, and the effective viable bacteria number was 1.7×1010 CFU/g, respectively) and LPS stress or not (intraperitoneal injection of LPS saline solution or saline solution, and the concentration of LPS saline solution was 0.5 mg/mL). The experiment lasted for 28 days, and the goslings were intraperitoneally injected with 1 mL/kg BW on the 15th, 17th and 19th days of the experiment, respectively. The results showed as follows: 1) LPS stress significantly increased the diamine oxidase (DAO) activity and the D-lactic acid (D-LA) content in serum of goslings (P<0.05); Bifidobacterium supplementation significantly reduced the DAO activity and the D-LA content in serum of goslings (P<0.05). 2) LPS stress significantly increased the ileum injury score of goslings and had a significant effect on mucin 2 (MUC2) content in ileum (P<0.05); Bifidobacterium supplementation significantly reduced the ileum injury score and increased the MUC2 content in ileum (P<0.05). 3) Compared with the supplementation of 300 mg/kg Bifidobacterium, the supplementation of 600 mg/kg Bifidobacterium significantly decreased the D-LA content in serum and significantly increased the MUC2 content in ileum of goslings at 28 days of age (P<0.05), but there were no significant differences in the indices at other days of age (P>0.05). 4) LPS stress could cause serious injury of gosling’s ileal epithelial cells, with obvious cytoplasm edema, approximately irregular oval nucleus, expansion of Golgi capsule membrane, overall structural damage of microvilli, and fuzzy structure of tight junctions and intermediate junctions between cells. Bifidobacterium was involved in alleviating the above phenomenon by inducing autophagy and helping to protect mitochondrial structure. In addition, 300 mg/kg Bifidobacterium freeze-dried powder could significantly alleviate cytosolic edema and rough endoplasmic reticulum dilation. In conclusion, LPS stress of goslings aged from 1 to 28 days can cause damage to the ileum and ileal epithelial cells, result in abnormal secretion of MUC2 and increase intestinal permeability. Dietary Bifidobacterium can alleviate ileum injury and improve intestinal permeability by promoting MUC2 secretion, and can alleviate ileal epithelial cell injury by inducing autophagy. Under the conditions of this experiment, the supplementation of 600 mg/kg Bifidobacterium freeze-dried powder in the diet could not achieve better relief effects, so the supplementation of 300 mg/kg is recommended.

Key words： Bifidobacterium; LPS; goslings; ileum injury; intestinal permeability; mucin 2; transmission electron microscopy

Cite this article

CHEN Shi , FU Zhenming , WANG Jian , FAN Zhongjun , WANG Jun , WANG Zhiyue , YANG Haiming . Alleviating Effects of Different Dietary Levels of Bifidobacterium on Ileum Injury of Goslings under Lipopolysaccharide Stress[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2024 , 36(5) : 3035 -3048 . DOI: 10.12418/CJAN2024.261

雏鹅免疫系统发育尚不成熟,在饲养过程中易受到外源因素(如环境污染、病原菌)的影响,这些外源性刺激会诱导动物机体产生免疫应激[1]。在此状态下,动物机体的免疫系统被激活,将原本用于生长的部分营养物质分配到免疫系统中,造成动物生产性能下降[2]。脂多糖(LPS)应激模型是目前较为经典并使用普遍的免疫应激模型[3]。阳金金[4]研究发现,多次腹腔注射LPS会导致雏鹅免疫应激,造成肠道黏膜受损。
双歧杆菌(Bifidobacterium)是动物机体主要的益生菌之一,是肠黏膜屏障中生物屏障的主要成分,在维持机体肠黏膜屏障的完整性方面起重要作用,能够预防LPS诱导的肠屏障损伤[5]。王玮[6]研究发现,双歧杆菌能减轻LPS应激幼鼠的回肠组织病理学改变并能促进修复;双歧杆菌能通过抑制LPS引起的过氧化损伤而对幼鼠有一定的保护作用;双歧杆菌能通过抑制幼鼠体内的髓过氧化物酶(MPO)活性和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达而保护肠道;双歧杆菌可能通过抑制LPS引起的局部炎症反应并提高胰岛素样生长因子-1(IGF-1)表达而保护肠道。然而,目前关于双歧杆菌作为饲料添加剂应用于雏鹅生产,并不清楚其作为营养辅助手段缓解LPS应激所造成的雏鹅肠黏膜损伤的效果。
透射电镜可以突破可见光衍射极限,观察到光学显微镜下无法看清的超微结构[7]。在观察肠黏膜超微结构损伤方面,如肠上皮细胞连接、微绒毛、细胞器以及细胞核等处,透射电镜有着光学显微镜无法比拟的优势[8]。本文主要通过对雏鹅进行LPS应激建立免疫应激模型,并在饲粮中添加不同水平双歧杆菌,探讨其对LPS应激雏鹅肠道通透性、回肠损伤评分和回肠黏膜黏蛋白2(MUC2)含量的影响,并结合透射电镜观察雏鹅回肠上皮细胞损伤的方法[9],明确不同双歧杆菌添加水平对LPS应激雏鹅回肠损伤的缓解效果,为双歧杆菌在雏鹅生产中的应用提供依据,并为透射电镜在鹅肠道健康方面的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

LPS纯度≥98%,血清型O55∶B5,购自Solarbio公司。双歧杆菌产品为市售[10],冻干粉型,检测[11]有效活菌数为1.7×1010 CFU/g。试验动物为288只1日龄体重相近且健康的江南白鹅公雏。

1.2 试验设计

试验采用3×2两因素设计,两因素分别为双歧杆菌添加水平(分别添加0、300和600 mg/kg双歧杆菌冻干粉)和LPS应激与否(腹腔注射LPS生理盐水溶液或生理盐水,LPS生理盐水溶液浓度为0.5 mg/mL)。试验将288只1日龄的江南白鹅公雏,随机分为6组,每组6个重复,每个重复8只。A组饲喂基础饲粮并注射生理盐水,B组在基础饲粮中添加300 mg/kg双歧杆菌冻干粉并注射生理盐水,C组在基础饲粮中添加600 mg/kg双歧杆菌冻干粉并注射生理盐水;D组饲喂基础饲粮并注射LPS,E组在基础饲粮中添加300 mg/kg双歧杆菌冻干粉并注射LPS,F组在基础饲粮中添加600 mg/kg双歧杆菌冻干粉并注射LPS。试验期共28 d,分为3个阶段,包括非应激期(第1~14天)、应激期(第15~21天)和恢复期(第22~28天)。于试验第15、17和19天分别对雏鹅进行1次腹腔注射,注射量均为1 mL/kg BW[12-13]。

1.3 基础饲粮

基础饲粮配方主要参考NRC(1994)[14]建议的鹅营养需要量,饲粮原料营养水平参考《中国饲料成分及营养价值表(2021年第32版)》[15],并结合扬州大学家禽生产与营养实验室历年研究成果[16-17]。基础饲粮以玉米、豆粕和小麦麸为基础原料配制,并采用近红外光谱法[18]测定基础原料中粗蛋白质、粗纤维、蛋氨酸和赖氨酸含量,基础饲粮组成及营养水平见表1。
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

项目Items 含量Content
原料Ingredients
玉米Corn 60.5
豆粕Soybean meal 29.0
小麦麸Wheat bran 6.8
石粉Limestone 1.0
磷酸氢钙CaHPO4 1.3
DL-蛋氨酸DL-Met 0.1
氯化钠NaCl 0.3
预混料Premix1) 1.0
合计Total 100.0
营养水平Nutrient levels2)
代谢能ME/(MJ/kg) 11.49
粗蛋白质CP 18.75
粗纤维CF 3.32
钙Ca 0.80
总磷TP 0.63
有效磷AP 0.32
蛋氨酸Met 0.40
赖氨酸Lys 0.97

1)每千克预混料含有 One kilogram of the premix contained the following:VA 1 250 000 IU,VB1 200 mg,VB2 750 mg,VB6 375 mg,VB12 2.25 mg,VD3 375 000 IU,VE 2 500 mg,VK3 200 mg,D-生物素 D-biotin 15 mg,叶酸 folic acid 125 mg,D-泛酸 D-pantothenic acid 1 125 mg,烟酰胺 nicotinamide 3 250 mg,胆碱 choline 50 g,植酸酶 phytase 300 000 U,Cu (as copper sulfate) 0.95 g,Fe (as ferrous sulfate) 9.5 g,Mn (as manganese sulfate) 9.5 g,Zn (as zinc sulfate) 9 g,I (as calcium iodate) 57.5 mg,Se (as sodium selenite) 40 mg。

2)粗蛋白质、粗纤维、蛋氨酸和赖氨酸为实测值,其余为计算值。CP, CF, Met and Lys were measured values, while the others were calculated values.

1.4 饲养管理

饲养试验于2022年9—10月在国家水禽基因库(江苏)进行。试验前对鹅舍及器具进行严格的冲洗和消毒,通风净化后再开始试验。试验鹅采用笼养,自由采食和饮水,自然光照通风,每天机械清粪1次,并保持舍内空气清洁。每日观察雏鹅生长情况,及时做好记录。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 肠道通透性

于试验第21和28天,分别从每个重复中随机取1只鹅,翅静脉采集血液样品,将采集的血液样品室温静置30 min后,在4 ℃条件下3 000 r/min离心10 min,分离得到的血清于-20 ℃冰箱中保存备用。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒测定血清中二胺氧化酶(DAO)活性和D-乳酸(D-LA)含量,试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司,具体操作步骤按照说明书进行。

1.5.2 回肠损伤评分

试验鹅采血后屠宰,取1 cm回肠中段置于4%多聚甲醛溶液中固定,经脱水包埋后制成回肠组织切片,进行苏木精-伊红(HE)染色,使用光学显微镜评估回肠组织损伤。根据Chiu等[19]划分的标准,肠损伤病理评分标准为:0分,绒毛上皮完整,组织结构正常;1分,轻微黏膜下和或固有层分离,毛细血管充血;2分,中度黏膜下和或固有层分离;3分,大面积黏膜下和或固有层分离,少量绒毛脱落;4分,肠绒毛剥脱至固有层,毛细血管扩张;5分,存在溃疡、固有层崩解和出血。每张切片选取3个视野,取其平均值。

1.5.3 回肠黏膜MUC2含量

采集回肠中部的肠段,用生理盐水冲洗干净食糜后纵向剖开肠段,并用载玻片刮取回肠黏膜至2 mL冻存管中,于-80 ℃冰箱中保存备用。采用ELISA试剂盒测定回肠黏膜中MUC2含量,试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司,具体操作步骤按照说明书进行。

1.6 透射电镜观察

1.6.1 样品采集

采取鹅的回肠中段,尽量减小牵拉、挫伤与挤压等机械损伤,用超薄刀片1~3 min内取样,取样长度1 cm。将取下后的回肠组织立即投入装有电镜固定液的培养皿内,用超薄刀片切割成1 mm3的小组织块。再将切割好的小组织块转移至装有新的电镜固定液的EP管内继续固定,4 ℃保存。

1.6.2 制片步骤

后固定:采用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)漂洗3次,每次15 min;采用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)配制的1%锇酸避光室温固定2 h;再次采用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)漂洗3次,每次15 min。
室温脱水:组织依次采用30%、50%、70%、80%、95%、100%和100%酒精脱水,每次20 min;并采用100%丙酮脱水2次,每次15 min。
渗透包埋:采用丙酮︰812包埋剂(1∶1)37 ℃渗透2~4 h,并用丙酮︰812包埋剂(1∶2)37 ℃渗透过夜,在用纯812包埋剂37 ℃渗透5~8 h;将纯812包埋剂倒入包埋板,将样品插入包埋板后37 ℃烤箱过夜。
聚合:包埋板放于60 ℃烤箱聚合48 h,取出树脂块备用。
超薄切片:树脂块于超薄切片机60~80 nm超薄切片,150目方华膜铜网捞片。
染色:铜网于2%醋酸铀饱和酒精溶液避光染色8 min;70%酒精清洗3次;超纯水清洗3次;2.6%枸橼酸铅溶液避二氧化碳染色8 min;超纯水清洗3次,滤纸稍吸干。铜网切片放入铜网盒内室温干燥过夜。
拍照:在日立HT7800型透射电镜下观察,采集图像并分析。

1.7 数据统计分析

采用SPSS 21.0软件的一般线性模型(GLM)程序进行有互作效应的双因素方差分析(two-way ANOVA),差异显著则采用Duncan氏法进行多重比较分析,结果采用平均值和均值标准误(SEM)表示,P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 饲粮中添加不同水平双歧杆菌对LPS应激雏鹅肠道通透性的影响

由表2可知,21日龄时,LPS应激显著提高了雏鹅血清中DAO活性和D-LA含量(P<0.05)。饲粮中添加双歧杆菌对雏鹅血清中DAO活性和D-LA含量有显著影响(P<0.05)。与不添加双歧杆菌相比,饲粮中添加300 mg/kg显著降低了雏鹅血清中DAO活性(P<0.05),饲粮中添加600 mg/kg显著降低了血清中DAO活性和D-LA含量(P<0.05),但饲粮中添加600 mg/kg双歧杆菌与饲粮中添加300 mg/kg双歧杆菌相比血清中DAO活性和D-LA含量均无显著差异(P>0.05)。LPS应激和饲粮中添加双歧杆菌对雏鹅血清中DAO活性和D-LA含量无显著互作效应(P>0.05)。
表2 饲粮中添加不同水平双歧杆菌对LPS应激雏鹅肠道通透性的影响

Table 2 Effects of different dietary levels of Bifidobacterium on intestinal permeability of goslings under LPS stress

项目
Items		 21日龄21 days of age 28日龄28 days of age
二胺氧化酶
DAO/
(U/mL)		 D-乳酸
D-LA/
(μmol/mL)		 二胺氧化酶
DAO/
(U/mL)		 D-乳酸
D-LA/
(μmol/mL)
组别Groups A 21.42b 46.35b 20.83b 49.10c
B 15.83a 46.01b 14.35a 42.49b
C 16.22a 39.88a 15.46a 35.17a
D 28.05d 62.83d 31.16c 66.80e
E 24.64c 55.50c 23.40b 55.21d
F 25.34cd 53.87c 21.40b 53.73cd
均值标准误SEM 0.88 1.48 1.04 1.85

脂多糖
LPS		 - 17.83a 44.08a 16.88a 42.25a
+ 26.01b 57.40b 25.32b 58.58b
双歧杆菌
Bifidobacterium/(mg/kg)		 0 24.74b 54.59b 26.00b 57.95c
300 20.24a 50.76ab 18.88a 48.85b
600 20.78a 46.87a 18.43a 44.45a
P值
P-value		 脂多糖LPS <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
双歧杆菌Bifidobacterium <0.001 0.003 <0.001 <0.001
互作效应Interaction 0.462 0.230 0.176 0.307

-:注射生理盐水;+:注射LPS;0:不添加双歧杆菌冻干粉;300:添加300 mg/kg双歧杆菌冻干粉;600:添加600 mg/kg双歧杆菌冻干粉。同列中同一种主效应间数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

-: saline injection; +: LPS injection; 0: without adding Bifidobacterium lyophilized powder; 300: add 300 mg/kg Bifidobacterium lyophilized powder; 600: add 600 mg/kg Bifidobacterium lyophilized powder. In the same column between the same main effect, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

28日龄时,LPS应激显著提高了雏鹅血清中DAO活性和D-LA含量(P<0.05)。饲粮中添加双歧杆菌对雏鹅血清中DAO活性和D-LA含量有显著影响(P<0.05)。与不添加双歧杆菌相比,饲粮中添加300和600 mg/kg均显著降低了雏鹅血清中DAO活性和D-LA含量(P<0.05),且饲粮中添加600 mg/kg双歧杆菌与饲粮中添加300 mg/kg双歧杆菌相比显著降低了血清中D-LA含量(P<0.05)。LPS应激和饲粮中添加双歧杆菌对雏鹅血清中DAO活性和D-LA含量无显著互作效应(P>0.05)。

2.2 饲粮中添加不同水平双歧杆菌对LPS应激雏鹅回肠损伤评分和MUC2含量的影响

由表3可知,21日龄时,LPS应激显著提高了雏鹅回肠损伤评分和MUC2含量(P<0.05)。饲粮中添加双歧杆菌对雏鹅回肠MUC2含量有显著影响(P<0.05)。与不添加双歧杆菌相比,饲粮中添加300 mg/kg对雏鹅回肠MUC2含量无显著影响(P>0.05),饲粮中添加600 mg/kg显著提高了回肠MUC2含量(P<0.05),但饲粮中添加600 mg/kg双歧杆菌与饲粮中添加300 mg/kg双歧杆菌相比回肠MUC2含量无显著差异(P>0.05)。LPS应激和饲粮中添加双歧杆菌对雏鹅回肠损伤评分和MUC2含量无显著互作效应(P>0.05)。
表3 饲粮中添加不同水平双歧杆菌对LPS应激雏鹅回肠损伤评分和MUC2含量的影响

Table 3 Effects of different dietary levels of Bifidobacterium on ileum injury score and MUC2 content of goslings under LPS stress

项目
Items		 21日龄21 days of age 28日龄28 days of age
损伤评分
Injury
score		 黏蛋白2
MUC2/
(pg/mg prot)		 损伤评分
Injury
score		 黏蛋白2
MUC2/
(pg/mg prot)
组别
Groups		 A 1.50a 111.30a 2.83a 148.87c
B 1.33a 121.82ab 2.00a 148.42c
C 1.33a 118.76ab 2.17a 168.01d
D 3.50b 123.70ab 4.00b 81.19a
E 2.67ab 149.05bc 2.33a 78.23a
F 2.83ab 175.47c 2.50a 127.03b
均值标准误SEM 0.23 5.74 0.18 6.16

脂多糖
LPS		 - 1.39a 117.29a 2.33 155.10b
+ 3.00b 149.41b 2.94 95.48a
双歧杆菌
Bifidobacterium/(mg/kg)		 0 2.50 117.50a 3.42b 115.03a
300 2.00 135.43ab 2.17a 113.32a
600 2.08 147.12b 2.33a 147.52b
P值
P-value		 脂多糖LPS <0.001 0.002 0.060 <0.001
双歧杆菌Bifidobacterium 0.530 0.048 0.005 <0.001
互作效应Interaction 0.764 0.164 0.465 0.020
28日龄时,LPS应激显著降低了雏鹅回肠MUC2含量(P<0.05)。饲粮中添加双歧杆菌对雏鹅回肠损伤评分和MUC2含量有显著影响(P<0.05)。与不添加双歧杆菌相比,饲粮中添加300 mg/kg显著降低了雏鹅回肠损伤评分(P<0.05);饲粮中添加600 mg/kg显著降低了回肠损伤评分(P<0.05),并显著提高了回肠MUC2含量(P<0.05),但饲粮中添加600 mg/kg双歧杆菌与饲粮中添加300 mg/kg双歧杆菌相比显著提高了回肠MUC2含量(P<0.05)。LPS应激和饲粮中添加双歧杆菌对雏鹅回肠MUC2含量有显著互作效应(P<0.05)。

2.3 透射电镜观察饲粮中添加不同水平双歧杆菌对LPS应激雏鹅回肠上皮细胞的影响

如图1所示,21日龄时,A组雏鹅回肠上皮细胞轻中度肿胀,细胞膜完整、连续,胞内基质均匀,细胞器数量适中;细胞核(N)近似椭圆形,异染色质少量增加、边集,核膜模糊;线粒体(M)轻度肿胀,膜完整,基质少量变浅,嵴变短;粗面内质网(RER)轻中度扩张,表面核糖体局部脱颗粒;微绒毛(Mv)大多排列整齐,长短均一,未见明显肿胀,少量断裂;细胞间紧密连接(TJ)结构模糊,可见中间连接(ZA)结构,张力丝减少,细胞间隙尚可。
图1 透射电镜下21日龄时A组雏鹅回肠上皮细胞

N:细胞核 nucleus;M:线粒体 mitochondria;RER:粗面内质网 rough endoplasmic reticulum;Mv:微绒毛 microvillus;TJ:紧密连接 tight junction;ZA:中间连接 zonula adherens;ASS:自噬溶酶体 autolysosome;Go:高尔基体 Golgi apparatus;Ly:溶酶体 lysosome;De:桥粒 desmosome;AP:自噬小体 autophagosome;Nu:核仁 nucleolus。下图同 the same as below。

Fig.1 Ileal epithelial cells of goslings in group A at 21 days of age under transmission electron microscope

如图2所示,21日龄时,B组雏鹅回肠上皮细胞轻度肿胀,细胞膜结构清晰,胞内基质整体略浅,细胞器数量适中;细胞核近似椭圆形,异染色质少量增加、边集,核膜模糊;线粒体轻度肿胀,膜完整,基质少量变浅,嵴变短;粗面内质网未见明显扩张,表面核糖体未见明显脱颗粒;微绒毛大多排列整齐,少量长短不均一,未见明显肿胀;细胞间紧密连接结构略显模糊,细胞间隙尚可。
图2 透射电镜下21日龄时B组雏鹅回肠上皮细胞

Fig.2 Ileal epithelial cells of goslings in group B at 21 days of age under transmission electron microscope

如图3所示,21日龄时,C组雏鹅回肠上皮细胞轻度肿胀,细胞膜结构清晰,胞内基质整体略浅,细胞器数量适中;细胞核近似椭圆形,异染色质增加、边集,核膜模糊;线粒体大多结构尚可,大小较为均一,未见明显肿胀,膜完整,基质均匀,嵴可见;粗面内质网轻度扩张,表面核糖体未见明显脱颗粒;可见自噬溶酶体(ASS);微绒毛排列整齐,未见明显肿胀,局部略显稀疏;细胞间可见紧密连接及中间连接结构,张力丝减少,细胞间隙尚可。
图3 透射电镜下21日龄时C组雏鹅回肠上皮细胞

Fig.3 Ileal epithelial cells of goslings in group C at 21 days of age under transmission electron microscope

如图4所示,21日龄时,D组雏鹅回肠上皮细胞中度肿胀,细胞膜连续,胞内可见大范围低电子密度水肿区,细胞器数量适中;细胞核近似不规则椭圆形,异染色质增加、边集,核膜模糊;线粒体轻度肿胀,膜完整,个别损伤者基质变浅、溶解,嵴变短;粗面内质网轻度扩张,表面核糖体未见明显脱颗粒;高尔基体(Go)囊膜略显扩张;微绒毛数量较多,大多排列整齐,长度较短;细胞间可见紧密连接及中间连接,结构较为模糊,细胞间隙尚可。
图4 透射电镜下21日龄时D组雏鹅回肠上皮细胞

Fig.4 Ileal epithelial cells of goslings in group D at 21 days of age under transmission electron microscope

如图5所示,21日龄时,E组雏鹅回肠上皮细胞轻度肿胀,细胞膜连续,胞内基质变浅,细胞器数量适中;细胞核近似椭圆形,异染色质少量增加、边集,核膜模糊;线粒体轻度肿胀,膜完整,基质少量变浅,嵴变短;粗面内质网局部轻度扩张,表面核糖体未见明显脱颗粒;可见自噬溶酶体;微绒毛未见明显肿胀,大多排列整齐,长短均一;细胞间可见紧密连接及中间连接结构,致密区较淡,细胞间隙尚可。
图5 透射电镜下21日龄时E组雏鹅回肠上皮细胞

Fig.5 Ileal epithelial cells of goslings in group E at 21 days of age under transmission electron microscope

如图6所示,21日龄时,F组雏鹅回肠上皮细胞轻中度肿胀,细胞膜连续,胞内基质较大范围变浅、溶解,细胞器数量适中;细胞核近似椭圆形,异染色质少量增加,散在分布,双层核膜局部模糊;线粒体轻度肿胀,膜完整,基质少量变浅,嵴变短;粗面内质网轻度扩张,表面核糖体未见明显脱颗粒;可见溶酶体(Ly);微绒毛未见明显肿胀,大多排列整齐,长短均一;细胞间可见紧密连接及中间连接结构,连接复合体张力微丝略显减少,细胞间隙尚可。
图6 透射电镜下21日龄时F组雏鹅回肠上皮细胞

Fig.6 Ileal epithelial cells of goslings in group F at 21 days of age under transmission electron microscope

如图7所示,28日龄时,A组雏鹅回肠上皮细胞轻中度肿胀,细胞膜完整、连续,胞内基质整体溶解、变浅,细胞器数量适中;细胞核近似椭圆形,异染色质少量增加、边集,核膜模糊;线粒体轻度肿胀,膜完整,基质少量变浅,嵴变短;粗面内质网局部轻度扩张,表面可见核糖体附着;高尔基体未见明显增生、扩张;可见溶酶体;微绒毛排列整齐,长短均一;细胞间可见紧密连接及中间连接结构,致密区较短,连接复合体张力微丝减少,细胞间隙尚可。
图7 透射电镜下28日龄时A组雏鹅回肠上皮细胞

Fig.7 Ileal epithelial cells of goslings in group A at 28 days of age under transmission electron microscope

如图8所示,28日龄时,B组雏鹅回肠上皮细胞轻度肿胀,细胞膜完整、连续,胞内基质电子密度均匀,细胞器数量适中;细胞核近似椭圆形,异染色质少量增加、边集,核膜模糊;线粒体结构尚可,未见明显肿胀,膜完整,基质均匀,嵴可见;粗面内质网未见明显扩张,表面可见核糖体附着;高尔基体囊池扩张;可见自噬溶酶体;微绒毛排列整齐,长短均一,未见明显肿胀。细胞间可见紧密连接、中间连接及桥粒(De)结构,张力丝减少,细胞间隙尚可。
图8 透射电镜下28日龄时B组雏鹅回肠上皮细胞

Fig.8 Ileal epithelial cells of goslings in group B at 28 days of age under transmission electron microscope

如图9所示,28日龄时,C组雏鹅回肠上皮细胞轻度肿胀,细胞膜完整、连续,胞内基质电子密度均一,细胞器数量适中;细胞核近似椭圆形,异染色质少量增加、边集,核膜模糊;线粒体大多轻度肿胀,膜完整,基质部分变浅,嵴变短;粗面内质网轻度扩张,表面核糖体未见明显脱颗粒;可见溶酶体及自噬小体(AP);微绒毛排列整齐,长短略显不均一;细胞间可见紧密连接及中间连接结构,连接复合体张力微丝略显减少,细胞间隙紧密。
图9 透射电镜下28日龄时C组雏鹅回肠上皮细胞

Fig.9 Ileal epithelial cells of goslings in group C at 28 days of age under transmission electron microscope

如图10所示,28日龄时,D组雏鹅回肠上皮细胞中度肿胀,细胞膜完整、连续,胞内基质电子密度整体偏低,细胞器数量适中;细胞核近似椭圆形,异染色质少量增加、边集,核膜模糊;线粒体大多轻度肿胀,膜完整,基质少量变浅,嵴变短;粗面内质网轻度扩张,表面核糖体未见明显脱颗粒;高尔基体未见明显增生、扩张;微绒毛排列稀疏,较多变圆、脱落;细胞间可见紧密连接结构,细胞间隙紧密。
图10 透射电镜下28日龄时D组雏鹅回肠上皮细胞

Fig.10 Ileal epithelial cells of goslings in group D at 28 days of age under transmission electron microscope

如图11所示,28日龄时,E组雏鹅回肠上皮细胞轻度肿胀,细胞膜完整、连续,胞内基质分布均匀,细胞器数量适中;细胞核近似椭圆形,核仁(Nu)居中,异染色质少量增加,散在分布,核膜模糊;线粒体大多轻度肿胀,膜完整,基质部分变浅,嵴变短;粗面内质网未见明显扩张,表面核糖体未见明显脱颗粒;高尔基体囊膜扩张;微绒毛排列紧密,数量丰富,未见明显肿胀;细胞间可见紧密连接、中间连接及桥粒结构,细胞间隙紧密。
图11 透射电镜下28日龄时E组雏鹅回肠上皮细胞

Fig.11 Ileal epithelial cells of goslings in group E at 28 days of age under transmission electron microscope

如图12所示,28日龄时,F组雏鹅回肠上皮细胞轻度肿胀,细胞膜完整、连续,胞内基质局部变浅,细胞器数量适中;细胞核近似椭圆形,异染色质略微增加,散在分布,核膜模糊;线粒体大多轻度肿胀,膜完整,基质少量变浅,嵴变短;粗面内质网轻度扩张,表面核糖体未见明显脱颗粒;高尔基体肥大,扁平囊扩张;可见自噬溶酶体及自噬小体;微绒毛数量丰富,未见明显肿胀,长短均一;细胞间可见紧密连接及桥粒结构,细胞间隙紧密。
图12 透射电镜下28日龄时F组雏鹅回肠上皮细胞

Fig.12 Ileal epithelial cells of goslings in group F at 28 days of age under transmission electron microscope

综合来看,21和28日龄时,相较于同日龄的其余5组,D组雏鹅回肠上皮细胞损伤均最为严重,胞质水肿明显,呈中度肿胀;21日龄时,D组细胞核近似不规则椭圆形,高尔基体囊膜扩张,微绒毛长度较短,细胞间紧密连接及中间连接结构模糊;28日龄时,D组微绒毛出现整体结构损伤,排列稀疏,较多变圆、脱落。21和28日龄时,A组上皮细胞出现一定程度的损伤,呈轻中度肿胀,粗面内质网均有扩张;21日龄时,A组表面核糖体甚至出现局部脱颗粒的现象。21和28日龄时,B组粗面内质网均未见扩张;同时E组相较D组粗面内质网扩张范围也较小或者未见扩张,胞质水肿也明显缓解;但是C组及F组粗面内质网均轻度扩张;并且21日龄时F组相较D组胞质水肿虽有缓解但范围依旧较大。相较同日龄的其余5组,21日龄时C组及28日龄时B组线粒体结构尚可,大小均一,未见肿胀,膜完整,基质均匀,嵴可见。21和28日龄时,除A组和D组外,其余各组均可观察到自噬小体或自噬溶酶体。

3 讨论

3.1 饲粮中添加不同水平双歧杆菌对LPS应激雏鹅肠道通透性的影响

肠道通透性是反映并评价肠道屏障损伤的重要指标[20]。血清中的DAO主要源于肠道且活性相对稳定,但当肠道屏障受损时,肠道通透性增大,DAO就会透过肠道屏障进入血液,使得血清中DAO活性升高[21]。D-LA主要源于肠道内乳酸杆菌、大肠杆菌等的代谢产物,由于哺乳动物体内缺乏代谢D-LA的酶,当肠道屏障遭到损伤时,D-LA会透过受损肠道屏障进入血液循坏,导致血清中D-LA含量升高[22]。因此,检测血清中DAO活性和D-LA含量,常被用于反映肠道屏障的损伤与修复以及肠道通透性的变化情况。
有研究表明,LPS应激会造成肠黏膜损伤,致使肠道通透性显著增大[23]。本试验结果表明,在LPS应激条件下,雏鹅血清中DAO活性和D-LA含量显著提高,肠道通透性显著增大,这与上述前人的研究相一致。本试验还发现,饲粮中添加双歧杆菌会显著降低雏鹅血清中DAO活性和D-LA含量,这表明添加双歧杆菌能够降低雏鹅肠道通透性。石梦玄[24]研究发现,口服适量动物双歧杆菌对小鼠肠道黏膜损伤具有预防作用,有助于肠道屏障功能恢复,从而达到改善肠道通透性的目的,这与本试验结果相一致。此外,饲粮中添加600 mg/kg双歧杆菌与饲粮中添加300 mg/kg双歧杆菌相比,除28日龄时显著降低了雏鹅血清中D-LA含量外,其余日龄肠道通透性指标均无显著差异。

3.2 饲粮中添加不同水平双歧杆菌对LPS应激雏鹅回肠损伤评分和MUC2含量的影响

本试验主要采用光学显微镜观察回肠组织切片的方法来进行回肠损伤评分,并结合回肠黏膜MUC2含量变化来相互佐证。回肠损伤评分主要从充血、溃疡以及肠绒毛剥脱等形态学角度,直观且相对定量地反映雏鹅回肠组织损伤的严重程度。MUC2具有物理屏障和免疫调节双重功能,在抗感染和防止消化道疾病等方面起着重要作用。MUC2分泌异常会使肠道屏障功能减弱和肠道通透性增大,引起肠黏膜细胞的炎症和损伤,其含量变化能够间接反映肠道损伤与修复情况[25]。
本试验发现,LPS应激显著提高了21日龄雏鹅回肠损伤评分,表明LPS应激对雏鹅回肠造成了损伤,但回肠MUC2含量21日龄时显著提高,而28日龄时显著降低。这与Castagliuolo等[26]在鼠模型试验中,应激状态下会释放促肾上腺皮质激素释放因子激活神经元和肥大细胞促进结肠杯状细胞MUC2分泌,在后期杯状细胞出现损耗进而MUC2分泌减少的结论相一致。21日龄时,回肠MUC2含量显著提高正是肠道应对LPS应激时所采取的保护机制,然而后期杯状细胞损耗导致MUC2分泌减少,因此28日龄时回肠MUC2含量显著降低。
本试验还发现,饲粮中添加双歧杆菌显著降低了28日龄雏鹅回肠损伤评分,显著提高了回肠MUC2含量。这与张美曦等[27]在雏鸡试验中,双歧杆菌能增加肠道杯状细胞数量,促进MUC2分泌的结论相一致。这表明饲粮中添加双歧杆菌有助于LPS应激雏鹅回肠损伤的缓解,其缓解作用是通过促进MUC2分泌来实现的。
此外,28日龄时,LPS应激和饲粮中添加双歧杆菌对雏鹅回肠MUC2含量有显著互作效应,表明两者间存在拮抗作用,其原因可能与饲粮中添加双歧杆菌能增加回肠杯状细胞数量来弥补因LPS应激所造成的杯状细胞损耗有关。此外,饲粮中添加600 mg/kg双歧杆菌与饲粮中添加300 mg/kg双歧杆菌相比,除28日龄时显著提高了雏鹅回肠MUC2含量外,其余日龄回肠损伤评分和MUC2含量均无显著差异。

3.3 透射电镜观察饲粮中添加不同水平双歧杆菌对LPS应激雏鹅回肠上皮细胞的影响

透射电镜观察结果表明,LPS会对雏鹅回肠上皮细胞造成损伤,尤其在缺乏双歧杆菌添加的D组中,这种损伤尤为明显,饲粮中添加双歧杆菌可以很好地缓解回肠上皮细胞损伤。在正常饲养的A组中,回肠上皮细胞会出现一定程度的损伤,这可能是养殖环境污染雏鹅易感外界病原所致[28]。通过在饲粮中添加300 mg/kg双歧杆菌冻干粉可以很好地缓解这些问题,但是添加600 mg/kg时其缓解效果则不明显,这说明相较于饲粮中添加600 mg/kg双歧杆菌,饲粮中添加300 mg/kg双歧杆菌可能更合适。同时,饲粮中添加双歧杆菌也有助于保护线粒体结构,并可诱导细胞自噬。
Wang等[29]报道,透射电镜观察腹腔注射LPS的肉鸡空肠上皮细胞发现,线粒体肿胀受损,嵴不明显,微绒毛断裂且稀疏,细胞间紧密连接及中间连接结构模糊。这与本次试验观察到的结果一致,并且本次试验还观察到细胞核形状改变,细胞质水肿,高尔基体、内质网等细胞器病变的现象,这些现象又再进一步证明LPS会对回肠上皮细胞造成严重的损伤。
钟世顺等[30]研究发现,体外试验中LPS作用肠上皮Lovo细胞3 h,透射电镜观察发现细胞凋亡。在预先使用双歧杆菌分泌型黏附素预孵30 min后,发现细胞凋亡明显减少,超微结构上表现为胞膜完整,核内染色质均匀分布,线粒体和内质网等细胞器结构清晰无肿胀。这说明双歧杆菌分泌型黏附素能抑制LPS对肠上皮细胞的损伤作用,同时也和本文双歧杆菌能缓解回肠上皮细胞损伤的体内试验相佐证。本试验中,双歧杆菌缓解肠道损伤的机理很可能也是通过分泌型黏附素实现,具体有待进一步的研究证明。
双歧杆菌作为一种益生菌,要求添加“足够数量”以获得健康益处[31]。本试验认为,在雏鹅饲粮中添加300 mg/kg双歧杆菌冻干粉更合适,这与产品说明书上的推荐用量相一致。Ouwehand[32]总结了双歧杆菌在人体应用中剂量-反应关系方面的研究,发现在一些疾病的治疗中,如坏死性小肠结肠炎,双歧杆菌没有显示出明确的剂量-反应关系。这说明在达到“足够数量”的前提下,双歧杆菌的添加水平并不是越高效果越好。中国食品科学技术学会益生菌分会发布的《益生菌“量效关系”的科学综述》[33]中指出,益生菌添加量并非越高越好,有些菌株在较低剂量情况下也可以发挥健康作用,避免陷入越高越好的误区。本试验在双歧杆菌达到产品推荐用量时,加倍添加未能取得更好的缓解效果。
Cao等[34]研究表明,仔猪LPS应激所致的肠道损伤会伴随小肠线粒体能量代谢紊乱;而王立生等[35]则发现双歧杆菌的完整肽聚糖在激活巨噬细胞的过程中可提高其线粒体膜电位,纠正线粒体能量代谢紊乱。这与本试验观察到的双歧杆菌有助于保护线粒体结构的现象相一致,其机制可能与调节能量代谢功能有关。
在透射电镜下观察到自噬小体或自噬溶酶体是证明细胞发生自噬的“金标准”[36]。自噬是细胞内一种自我保护和应激调控机制,一种清除自身受损、变性或衰老的大分子物质以及细胞器的过程,在实现细胞内的稳态以及细胞器的更新过程中发挥着重要作用[37]。陈楚岩[38]研究发现,双歧杆菌通过调节肠道内代谢产物丁酸的含量,诱导细胞自噬发挥保护肠黏膜的作用。这与本试验在饲粮中添加双歧杆菌的各组中观察到细胞自噬现象相一致。这表明双歧杆菌通过诱导细胞自噬参与缓解雏鹅回肠上皮细胞损伤的过程中。
本试验将透射电镜应用于雏鹅肠道健康方面的研究,证明了雏鹅LPS应激会造成回肠上皮细胞的损伤。通过透射电镜观察回肠上皮细胞的损伤与修复情况,有助于从超微结构上证明双歧杆菌对LPS应激雏鹅回肠上皮细胞损伤的缓解效果,并且建议在饲粮中添加300 mg/kg双歧杆菌冻干粉。这对双歧杆菌应用于雏鹅生产保证雏鹅健康和提高生产性能,具有重要的生产实践意义。

4 结论

1~28日龄雏鹅LPS应激会对回肠造成损伤致使MUC2分泌异常并增大肠道通透性。饲粮中添加双歧杆菌能通过促进MUC2分泌来实现对LPS应激雏鹅回肠损伤的缓解并改善肠道通透性。透射电镜观察发现,双歧杆菌能缓解LPS应激所造成的雏鹅回肠上皮细胞损伤,并通过诱导细胞自噬参与这一过程。在本试验条件下,饲粮中添加600 mg/kg双歧杆菌冻干粉未能取得更好的缓解效果,因此建议添加300 mg/kg。

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CHEN C Y. Study on the mechanism of probiotics protecting intestinal mucosal barrier by influencing autophagy[D]. Ph.D. Thesis. Beijing: Peking Union Medical College, 2020. (in Chinese)

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