Chinese Journal of Animal Nutrition >

2024 , Vol. 36 >Issue 5: 3131 - 3142

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.269

RESEARCH PAPER

Effects of Dietary Zanthoxylum bungeanum Seeds on Nutrient Apparent Digestibility, Intestinal Development, Immune Function and Digestive Enzyme Activities of Hu Sheep

  • LIU Zilong ,
  • LI Qiao ,
  • MA Xueyi ,
  • LI Taotao ,
  • MA Youji , *
Expand
  • College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China
* professor, E-mail:

Received date: 2023-07-26

  Online published: 2024-05-15

Fold

Abstract

The aim of this experiment was to study the effects of dietary Zanthoxylum bungeanum seeds on nutrient apparent digestibility, intestinal development, immune function and digestive enzyme activities of Hu sheep. Twenty-seven healthy 3-month-old Hu sheep male lambs with similar body weight [(25.66±3.03) kg] were selected and randomly divided into 3 groups with 9 sheep in each group. The control group was fed a basal diet, and the test groups Ⅰ and Ⅱ were substituted with 3% and 6% Zanthoxylum bungeanum seeds in equal amounts for part of the roughage in the basal diet, respectively. The pre-test period was 7 days, and the formal test period was 90 days. The results showed as follows: 1) the crude protein (CP) apparent digestibility of test group Ⅱ was significantly lower than that of the control group (P<0.05). The apparent digestibility of ether extract (EE) and calcium of test groups Ⅰ and Ⅱ was significantly higher than those of the control group (P<0.05), and the EE apparent digestibility of test group Ⅱ was significantly higher than that of test group Ⅰ (P<0.05). 2) The duodenal villus height/crypt depth of test group Ⅰ was significantly higher than that of the control group (P<0.05), and the jejunal villus height and villus height/crypt depth of test groups Ⅰ and Ⅱ were significantly higher than those of the control group (P<0.05). 3) The contents of immunoglobulin G (IgG), complement 3 (C3) and complement 4 (C4) in serum of test group Ⅱ were significantly higher than those of the control group (P<0.05), and the serum lysozyme (LZM) activity of test groups Ⅰ and Ⅱ was significantly higher than that of the control group (P<0.05). 4) The relative expression levels of Toll-like receptor 2 (TLR2) mRNA in duodenum and ileum of test group Ⅰ were significantly higher than those of control group and test group Ⅱ (P<0.05), and the relative expression level of TLR2 mRNA in jejunum of test group Ⅰ was significantly higher than that of the control group (P<0.05). The relative expression levels of TLR2 protein in duodenum, jejunum, and ileum of test group Ⅰ were significantly higher than that of control and test group Ⅱ (P<0.05). 5) The duodenal amylase activity of test groups Ⅰ and Ⅱ was significantly higher than that of the control group (P<0.05), and the ileal amylase activity of test groups Ⅰ and Ⅱ was significantly higher than of the control group (P<0.05). In conclusion, the addition of Zanthoxylum bungeanum seeds in diet can promote the intestinal development of Hu sheep and improve the intestinal immune function, and the addition level of 3% has the best effect.

Key words： Zanthoxylum bungeanum seeds; Hu sheep; intestine; immune; digestion

Cite this article

LIU Zilong , LI Qiao , MA Xueyi , LI Taotao , MA Youji . Effects of Dietary Zanthoxylum bungeanum Seeds on Nutrient Apparent Digestibility, Intestinal Development, Immune Function and Digestive Enzyme Activities of Hu Sheep[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2024 , 36(5) : 3131 -3142 . DOI: 10.12418/CJAN2024.269

我国是花椒的原产地[1],也是花椒种植大国,种植资源丰富。全国花椒种植面积约167万hm2,产量达40万t以上[2],但是由于加工技术水平受限,花椒产业全值化利用率较低,目前主要利用其果皮,而花椒籽通常作为加工废弃物被丢弃,造成环境污染与资源浪费[3]。花椒籽是花椒的主要副产物,富含优质蛋白质、不饱和脂肪酸和黑色素等有益成分,然而目前关于花椒籽的相关研究和应用较少[4]。随着现代化、规模化养殖业的发展,人们对绿色健康食品愈来愈重视,在畜牧业中也提出了绿色健康养殖的理念。
花椒籽具有天然性、无抗药性、多功能性等优点,其中含有膳食纤维、黑色素、多酚、黄酮、槲皮素和挥发油等多种天然物质,是抗生素类、激素类药物理想的替代品[5⇓-7]。研究表明,使用适量的花椒籽替代玉米有利于提高肥育猪的平均日增重[8];饲粮中添加3.5%的花椒籽可显著提高散养鸡的产蛋率,改善蛋品质[9];饲粮中添加花椒籽能够显著提高肉羊的营养物质表观消化率,提高其消化吸收能力[10];花椒提取物能够增强仔猪的抗病力,增强肠道抗氧化能力和免疫功能,促进肠道绒毛发育,增强肠道屏障功能[11]。但花椒籽对湖羊小肠发育和免疫功能的影响目前还未见报道。因此,本试验旨在探究基础饲粮中添加花椒籽对湖羊营养物质表观消化率、肠道发育、免疫功能和消化酶活性的影响,以期为花椒籽在湖羊养殖中的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

花椒籽从甘肃省临夏回族自治州广河县粮食市场购买,其常规营养成分含量见表1。湖羊公羔由甘肃省临夏回族自治州东乡县东沃良种羊繁育基地提供。
表1 花椒籽常规营养成分含量(干物质基础)

Table 1 Conventional nutrient contents in Zanthoxylum bungeanum seeds (DM basis) %

项目Items 含量Content
干物质(风干基础) DM (air-dry basis) 90.60
粗脂肪EE 22.50
粗蛋白质CP 15.60
中性洗涤纤维NDF 40.23
酸性洗涤纤维ADF 26.35
钙Ca 0.26
磷P 0.47

实测值 measured values。

1.2 试验设计

选取健康的3月龄体重[(25.66±3.03) kg]相近的湖羊公羔27只,随机分为3个组,每组9只羊。对照组饲喂基础饲粮,试验Ⅰ和Ⅱ组分别用3%和6%的花椒籽等量替代基础饲粮中部分粗饲料。基础饲粮参照《中国肉用绵羊营养需要》[12]配制,试验饲粮组成及营养水平见表2,各组饲粮等能等氮。预试期7 d,正试期90 d。
表2 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础)

Table 2 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) %

项目
Items		 组别Groups
对照Control Ⅰ Ⅱ
原料Ingredients
玉米Corn 28.00 28.00 28.00
麦麸Wheat bran 12.00 12.00 12.00
豆粕Soybean meal 14.00 14.00 14.00
菜籽粕Rapeseed meal 4.00 4.00 4.00
花椒籽Zanthoxylum bungeanum seeds 3.00 6.00
苜蓿干草Alfalfa hay 13.00 10.00 10.00
麦草Wheat straw 10.30 10.30 10.30
全株玉米青贮Whole corn silage 14.00 14.00 11.00
预混料Premix1) 1.00 1.00 1.00
小苏打NaHCO3 1.00 1.00 1.00
氯化钠NaCl 1.00 1.00 1.00
石粉Limestone 1.00 1.00 1.00
磷酸氢钙CaHPO4 0.70 0.70 0.70
合计Total 100.00 100.00 100.00
营养水平Nutrient levels2)
代谢能ME/(MJ/kg) 9.75 9.76 9.76
粗蛋白质CP 15.38 15.35 15.59
粗脂肪EE 2.50 3.13 3.68
中性洗涤纤维NDF 28.35 28.22 28.18
酸性洗涤纤维ADF 16.27 16.20 16.17
钙Ca 0.97 0.93 0.93
磷P 0.52 0.53 0.54

1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of diets:Fe (as ferrous sulfate) 75 mg,Cu (as copper sulfate) 14 mg,Zn (as zinc sulfate) 80 mg,Se (as sodium selenite) 0.25 mg,I (as potassium iodide) 0.25 mg,Co (as cobalt) 0.30 mg,Mn (as manganese sulfate) 400 mg,VA 3 000 IU,VD 500 IU,VE 200 IU。

2)代谢能为计算值,其余为实测值。ME was a calculated value, while the others were measured values.

1.3 饲养管理

试验前对羊舍进行清洁消毒,羊舍保持自然通风与光照,对试验羊进行编号并做防疫处理后,单栏饲喂。试验期间,定期对羊舍进行消毒,保持羊舍干净整洁。

1.4 样品采集和指标测定

1.4.1 营养物质表观消化率

在正式试验结束前的7 d用粪袋进行全天24 h的粪便全收集,收集到粪便后立即称重,0 ℃保存。将每只羊的粪便混匀,采用四分法取总量的20%置于信封袋中65 ℃烘干48 h至恒重,粉碎后带回实验室,测定粗蛋白质(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)、钙、磷含量。营养物质表观消化率计算公式如下:
营养物质表观消化率(%)=100×(食入该营养
物质含量-粪便中该营养物质含量)/
食入该营养物质含量。
饲粮和粪样中水分含量的测定采用烘箱干燥法(GB/T 6435—2014)[13],CP含量的测定采用凯氏定氮法(GB/T 6432—2018)[14],EE含量的测定采用索氏脂肪抽提法(GB/T 6433—2006)[15],NDF和ADF含量的测定采用过滤法(GB/T 6434—2022)[16],钙含量的测定采用高锰酸钾法(GB/T 6436—2018)[17],磷含量的测定方法采用分光光度法(GB/T 6437—2018)[18]。饲粮代谢能参照《中国饲料成分及营养价值表》(2022年第33版)计算。

1.4.2 血清生化和免疫指标

饲养试验结束后,对所有试验羊进行颈静脉采血于10 mL,于3 600 r/min离心5 min,收集上层血清于-20 ℃保存。血清生化指标包括葡萄糖(GLU)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)含量和谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ATL)活性。血清免疫指标包括免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、补体3(C3)、补体4(C4)含量和溶菌酶(LZM)活性。以上指标均采用试剂盒测定,试剂盒购自北京华英生物科技有限公司,检测仪器为迈瑞BS-420全自动生化仪。

1.4.3 肠道组织结构

饲养试验结束后,对所有试验羊进行称重,并且选取6只体重相近的健康湖羊进行屠宰。屠宰后迅速剪取十二指肠、空肠和回肠组织,用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗干净,置于4%多聚甲醛溶液固定,进行苏木精-伊红(HE)染色,用Case Viewer软件测量小肠绒毛高度、隐窝深度,计算绒毛高度/隐窝深度(V/C)。

1.4.4 肠道Toll样受体2(TLR2)mRNA相对表达量

1.4.4.1 总RNA提取和cDNA合成

十二指肠、空肠和回肠组织采集同1.4.3,于液氮中保存,随后转移至-80 ℃冰箱中冷冻,用于总RNA和蛋白的提取。使用Trizol试剂(北京全式金生物公司)提取小肠组织总RNA,用超微量分光光度计(Implen公司,德国)检测总RNA浓度和纯度,然后按照反转录试剂盒(Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR,湖南艾科瑞生物公司)的说明合成第1链cDNA。

1.4.4.2 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

从NCBI数据库下载绵羊TLR2和β-肌动蛋白(β-actin)的mRNA序列,使用软件Oligo 6.0设计引物,并使用NCBI在线网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)检测引物的特异性,引物由西安擎科生物科技有限责任公司进行合成,引物序列信息见表3。qRT-PCR扩增体系为20 μL:上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,2×Fast qPCR Master Mixture (Green) 10 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 8 μL;反应程序采用两步法:95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s,共40个循环。qRT-PCR所得到的Ct值,采用2-△△Ct方法进行处理。
表3 引物序列信息

Table 3 Primer sequence information

基因
Genes		 登录号
Accession No.		 引物序列
Primer sequence (5'—3')		 产物长度
Product length/bp
Toll样受体2
TLR2		 XM_012097285 F:TCCTGTTGCTCCTGCTCAC
R:CTTCCTGGGCTTCCTCTTG		 104
β-肌动蛋白
β-actin		 NM_001009784.1 F:CTTCCAGCCTTCCTTCCTGG
R:GCCAGGGCAGTGATCTCTTT		 180

1.4.5 肠道TLR2蛋白相对表达量

1.4.5.1 总蛋白提取

将冻存于-80 ℃的肠道组织充分研磨,称取0.1 g加入到1.5 mL离心管中,然后向其中加入1 mL RIPA高效组织裂解液和10 μL苯甲基磺酰氟(PMSF),反复振荡充分混匀,置于4 ℃充分裂解40 min,期间每间隔10 min振荡1次。最后4 ℃、12 000 r/min离心15 min,取上清液置于新的离心管中,于-80 ℃保存。

1.4.5.2 蛋白浓度测定与变性

用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白与5×十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液按比例4∶1混合均匀后,在金属浴上98 ℃加热10 min,随后保存于-20 ℃备用。

1.4.5.3 Western Blot检测

参考王霞[19]的方法,首先安装好洗干净的玻璃板,加入配好的12%的分离胶,用无水乙醇封口,室温静置1 h后,倒掉无水乙醇,加入配好的5%的浓缩胶,插好梳子,室温静置30 min后拔掉梳子,向上样孔中依次加入蛋白Marker和小肠组织变性蛋白,向电泳槽中加入适量1×电泳液,先50 V进行电泳,待样品跑过浓缩胶后,按80 V恒压跑到最底部。待电泳结束后取出凝胶,将其浸泡在1×电转液中,在转膜印夹从阴极板开始依次放上海绵垫片、滤纸、凝胶、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、滤纸、海绵垫片、阳极板,安装好后,在电转槽中加入1×转移缓冲液,在冰水浴中进行转膜,恒压100 V转移70~120 min后,将PVDF膜用封闭液室温下封闭1.5~2.0 h,然后在用一抗稀释液(上海碧云天生物公司)稀释好的兔源一抗Rabbit Anti-TLR2(北京博奥森生物技术有限公司)中37 ℃,2 h。然后用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗膜3次,1 h后,加入PBST稀释好的山羊抗兔二抗室温孵育60 min,用PBST洗涤后,在暗室中将化学发光液(北京索莱宝科技有限公司)均匀涂抹在膜上,经过显影、定影、水洗得到曝光的胶片。

1.4.6 肠道消化酶活性

分别称取0.1 g左右十二指肠、空肠和回肠组织样品,放入1.5 mL无菌无酶的离心管中,按组织块和生理盐水1∶9的比例混合,用组织破碎仪将其充分研磨,12 000 r/min离心10 min,吸取上清液立即进行胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性测定。以上指标均采用试剂盒测定,试剂盒购自北京华英生物科技有限公司。

1.5 数据统计分析

试验数据采用SPSS 26.0统计软件的ANOVA过程进行单因素方差分析,Duncan氏法进行多重比较检验,结果用平均值±标准差表示,P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 饲粮中添加花椒籽对湖羊营养物质表观消化率的影响

由表4可知,试验Ⅱ组的CP表观消化率显著低于对照组(P<0.05)。试验Ⅰ和Ⅱ组的EE和钙表观消化率显著高于对照组(P<0.05),且试验Ⅱ组的EE表观消化率显著高于试验Ⅰ组(P<0.05)。各组之间NDF、ADF和磷表观消化率无显著差异(P>0.05)。
表4 饲粮中添加花椒籽对湖羊营养物质表观消化率的影响

Table 4 Effects of dietary Zanthoxylum bungeanum seeds on nutrient apparent digestibility of Hu sheep %

项目
Items		 组别Groups P值
P-value
对照Control Ⅰ Ⅱ
粗蛋白质CP 48.26±2.74a 47.62±0.54a 43.20±0.74b 0.019
粗脂肪EE 6.40±0.40c 12.03±1.29b 26.18±2.21a 0.001
中性洗涤纤维NDF 45.74±0.19 43.49±1.33 46.10±1.37 0.055
酸性洗涤纤维ADF 49.16±0.56 49.28±2.03 50.82±0.70 0.288
磷P 17.31±10.17 27.04±8.71 25.31±11.90 0.510
钙Ca 31.96±4.49b 42.65±2.70a 42.58±4.47a 0.031

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 饲粮中添加花椒籽对湖羊肠道形态结构的影响

2.2.1 十二指肠形态结构

由表5可知,试验Ⅰ组的十二指肠绒毛高度/隐窝深度显著高于对照组(P<0.05)。各组之间十二指肠绒毛高度、隐窝深度和肌层厚度无显著差异(P>0.05)。
表5 饲粮中添加花椒籽对湖羊十二指肠形态结构的影响

Table 5 Effects of dietary Zanthoxylum bungeanum seeds on duodenal morphological structure of Hu sheep

项目
Items		 组别Groups P值
P-value
对照Control Ⅰ Ⅱ
绒毛高度Villus height/μm 795.68±35.32 820.90±48.62 811.73±72.22 0.722
隐窝深度Crypt depth/μm 260.92±38.17 199.78±17.11 255.08±79.16 0.111
绒毛高度/隐窝深度V/C 3.10±0.21b 4.14±0.16a 3.41±0.22ab 0.030
肌层厚度Muscular layer thickness/μm 306.92±24.21 322.32±53.44 348.05±45.31 0.274

2.2.2 空肠形态结构

由表6可知,试验Ⅰ和Ⅱ组的空肠绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度显著高于对照组(P<0.05)。各组之间空肠隐窝深度和肌层厚度无显著差异(P>0.05)。
表6 饲粮中添加花椒籽对湖羊空肠形态结构的影响

Table 6 Effects of dietary Zanthoxylum bungeanum seeds on jejunal morphological structure of Hu sheep

项目
Items		 组别Groups P值
P-value
对照Control Ⅰ Ⅱ
绒毛高度Villus height/μm 576.45±47.99b 632.22±28.81a 664.62±50.60a 0.010
隐窝深度Crypt depth/μm 252.95±24.68 224.62±32.34 227.38±26.03 0.186
绒毛高度/隐窝深度V/C 2.30±0.21b 2.86±0.33a 2.96±0.18a 0.012
肌层厚度Muscular layer thickness/μm 262.68±11.95 277.70±20.66 266.62±21.04 0.365

2.2.3 回肠形态结构

由表7可知,各组之间回肠绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度和肌层厚度无显著差异(P>0.05)。
表7 饲粮中添加花椒籽对湖羊回肠形态结构的影响

Table 7 Effects of dietary Zanthoxylum bungeanum seeds on ileal morphological structure of Hu sheep

项目
Items		 组别Groups P值
P-value
对照Control Ⅰ Ⅱ
绒毛高度Villus height/μm 650.37±33.86 620.00±47.03 628.97±17.00 0.328
隐窝深度Crypt depth/μm 261.28±37.34 250.52±30.23 257.77±24.86 0.833
绒毛高度/隐窝深度V/C 2.54±0.13 2.50±0.21 2.46±0.19 0.930
肌层厚度Muscular layer thickness/μm 262.20±17.05 279.50±16.61 259.72±21.25 0.163

2.3 饲粮中添加花椒籽对湖羊血清生化和免疫指标的影响

2.3.1 血清生化指标

由表8可知,各组之间血清GLU、TC、TG、HDL、LDL含量和AST、ATL活性无显著差异(P>0.05)。
表8 饲粮中添加花椒籽对湖羊血清生化指标的影响

Table 8 Effects of dietary Zanthoxylum bungeanum seeds on serum biochemical indexes of Hu sheep

项目
Items		 组别Groups P值
P-value
对照Control Ⅰ Ⅱ
葡萄糖GLU/(mmol/L) 1.07±0.63 1.86±1.16 1.36±0.63 0.288
总胆固醇TC/(mmol/L) 1.43±0.23 1.45±0.29 1.45±0.17 0.983
甘油三酯TG/(mmol/L) 0.48±0.18 0.50±0.15 0.37±0.05 0.234
高密度脂蛋白HDL/(g/L) 0.60±0.09 0.67±0.15 0.64±0.08 0.554
低密度脂蛋白LDL/(g/L) 0.54±0.11 0.52±0.16 0.48±0.79 0.730
谷丙转氨酶ATL/(U/L) 22.45±4.09 21.88±3.12 18.35±3.60 0.140
谷草转氨酶AST/(U/L) 131.89±5.47 123.95±4.97 124.85±9.44 0.128

2.3.2 血清免疫指标

由表9可知,试验Ⅱ组的血清IgG、C3和C4含量显著高于对照组(P<0.05);试验Ⅰ和Ⅱ组的血清LZM活性显著高于对照组(P<0.05),且试验Ⅱ组显著高于试验Ⅰ组(P<0.05)。各组之间血清IgA和IgM含量无显著差异(P>0.05)。
表9 饲粮中添加花椒籽对湖羊血清免疫指标的影响

Table 9 Effects of dietary Zanthoxylum bungeanum seeds on serum immune indexes of Hu sheep

项目
Items		 组别Groups P值
P-value
对照Control Ⅰ Ⅱ
免疫球蛋白A IgA/(g/L) 1.48±0.21 1.57±0.18 1.38±0.18 0.214
免疫球蛋白G IgG/(g/L) 19.08±1.37b 20.52±1.95ab 21.69±1.49a 0.043
免疫球蛋白M IgM/(g/L) 1.26±0.22 1.15±0.11 1.02±0.12 0.068
补体3 C3/(g/L) 0.32±0.05b 0.36±0.86ab 0.43±0.07a 0.043
补体4 C4/(g/L) 0.09±0.01b 0.10±0.02ab 0.11±0.01a 0.021
溶菌酶LZM/(U/mL) 263.47±7.84c 293.49±8.62b 329.82±8.18a 0.001

2.4 饲粮中添加花椒籽对湖羊肠道TLR2 mRNA相对表达量的影响

由图1可知,试验Ⅰ组的十二指肠TLR2 mRNA相对表达量显著高于对照组和试验Ⅱ组(P<0.05)。试验Ⅰ组的空肠TLR2 mRNA相对表达量显著高于对照组(P<0.05),与试验Ⅱ组差异不显著(P>0.05)。试验Ⅰ组的回肠TLR2 mRNA表达量显著高于对照组和试验Ⅱ组(P<0.05)。
图1 饲粮中添加花椒籽时湖羊肠道TLR2 mRNA相对表达量的影响

数据柱形标注*表示差异显著(P<0.05)。图2同。

Fig.1 Effects of dietary Zanthoxylum bungeanum seeds on relative expression levels of TLR2 mRNA in intestine of Hu sheep

Value columns with * indicated significant difference (P<0.05). The same as Fig.2.

2.5 饲粮中添加花椒籽对湖羊肠道TLR2蛋白相对表达量的影响

由图2可知,试验Ⅰ组的十二指肠TLR2蛋白相对表达量显著高于对照组和试验Ⅱ组(P<0.05)。试验Ⅰ组的空肠TLR2蛋白相对表达量显著高于对照组和试验Ⅱ组(P<0.05)。试验Ⅰ组的回肠TLR2蛋白相对表达量显著高于对照组和试验Ⅱ组(P<0.05)。
图2 饲粮中添加花椒籽时湖羊肠道TLR2蛋白相对表达量的影响

Fig.2 Effects of dietary Zanthoxylum bungeanum seeds on relative expression levels of TLR2 protein in intestine of Hu sheep

2.6 饲粮中添加花椒籽对湖羊肠道消化酶活性的影响

由表10可知,在十二指肠中,试验Ⅰ和Ⅱ组的淀粉酶活性显著高于对照组(P<0.05),且试验Ⅱ组显著高于试验Ⅰ组(P<0.05);试验Ⅱ组的胰蛋白酶活性显著低于对照组和试验Ⅰ组(P<0.05)。在空肠中,试验Ⅰ和Ⅱ组的脂肪酶活性显著低于对照组(P<0.05)。在回肠中,试验Ⅰ和Ⅱ组的淀粉酶活性显著高于对照组(P<0.05),试验Ⅱ组的胰蛋白酶活性显著低于对照组和试验Ⅰ组(P<0.05)。
表10 饲粮中添加花椒籽对湖羊肠道消化酶活性的影响

Table 10 Effects of dietary Zanthoxylum bungeanum seeds on activities of digestive enzymes in intestine of Hu sheep

项目
Items		 组别Groups P值
P-value
对照Control Ⅰ Ⅱ
十二指肠Duodenum
淀粉酶Amylase/(U/g prot) 6.24±0.58c 16.15±2.13b 37.73±4.23a 0.001
脂肪酶Lipase/(U/mg prot) 6.20±1.14 7.16±0.35 7.14±1.70 0.265
胰蛋白酶Tryptase/(U/mg prot) 34.58±3.37a 32.99±2.39a 15.31±2.03b 0.001
空肠Jejunum
淀粉酶Amylase/(U/g prot) 0.95±0.10 0.51±0.12 0.48±0.33 0.066
脂肪酶Lipase/(U/mg prot) 14.32±0.55a 13.08±0.63b 12.00±0.55b 0.008
胰蛋白酶Tryptase/(U/mg prot) 141.18±20.57 146.22±23.20 158.32±13.59 0.574
回肠Ileum
淀粉酶Amylase/(U/g prot) 1.87±0.65b 5.11±0.63a 6.38±1.95a 0.011
脂肪酶Lipase/(U/mg prot) 11.12±1.70 11.04±1.18 11.79±1.52 0.797
胰蛋白酶Tryptase/(U/mg prot) 71.38±6.31a 76.55±10.04a 56.28±4.56b 0.035

3 讨论

3.1 饲粮中添加花椒籽对湖羊生长性能和营养物质表观消化率的影响

本课题组前期研究结果表明,各组之间末重、平均日增重、总增重、平均采食量差异不显著;与对照组相比,试验Ⅰ和Ⅱ组总增重分别提高了12.88%和14.83%;对照组料重比显著高于试验Ⅰ和Ⅱ组[20]。本试验中,试验Ⅰ和Ⅱ组的EE表观消化率均显著高于对照组;试验Ⅰ和Ⅱ组的ADF、钙、磷表观消化率高于对照组,但是差异不显著。研究表明,肉羊饲粮中添加花椒籽显著提高了肉羊的营养物质表观消化率[10]。我们推测可能是花椒籽对湖羊的营养物质表观消化率产生影响,提高了湖羊对饲粮的利用率。本试验中,饲粮中添加花椒籽可提高湖羊的营养物质表观消化率。

3.2 饲粮中添加花椒籽对湖羊肠道形态结构的影响

小肠是反刍动物重要的消化吸收器官,具有吸收食糜中营养物质的重要功能,在小肠壁上分布有大量的肠绒毛,它的长短与吸收面积和吸收功能密切相关。小肠绒毛是小肠组织发育的重要标志,其中小肠的绒毛高度、隐窝深度、黏膜厚度及绒毛高度/隐窝深度等,是评价动物消化道发育的重要指标[21]。绒毛高度/隐窝深度能够反映小肠的功能状态,较高的绒毛高度/隐窝深度表明小肠具有较高的养分吸收能力和较快的生长速度。有研究表明,饲粮中添加15 mL/kg的花椒精油显著增加小尾寒羊十二指肠绒毛长度、肌层厚度和绒毛高度/隐窝深度。饲粮中添加10 mL/kg的花椒精油可以提高小尾寒羊生长性能,并促进其胃肠道组织结构发育[22]。此外,植物精油在单胃动物小肠发育方面的研究表明,仔猪饲粮中添加30 mg/kg的植物精油可显著增加小肠各段绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度[23]。在本研究中,饲粮中添加花椒籽提高了十二指肠和空肠的绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度,推测花椒籽中槲皮素可以增加肠道吸收面积,改善了绵羊肠道的消化吸收能力。有研究表明,饲粮中添加槲皮素后,可以增加小鼠肠绒毛高度和黏膜厚度,肠道菌群稳态与肠道屏障功能明显恢复[24]。

3.3 饲粮中添加花椒籽对湖羊血清生化和免疫指标的影响

血清ATL和AST活性可反映肝脏功能,GLU、TC等含量与肾脏功能密切相关[25]。本试验中,各组之间血清生化指标均差异不显著,均处于正常值范围,可见花椒籽代替等量粗饲料不影响肝脏和肾脏功能,在湖羊饲粮中添加花椒籽是安全可靠的。LZM是生物体内具有杀菌和免疫调节等功能的非特异性免疫分子[26],它可以通过攻击肽聚糖来破坏细菌细胞壁的酶,是免疫应答的生物标志物,LZM作为炎症的间接标志物,提供关于粒细胞活性和单核细胞-巨噬细胞系统功能的信息;此外,LZM是环境中病原体数量的潜在指标[27]。免疫球蛋白含量的变化是评价动物机体免疫机能重要指标之一[28],IgA、IgG和IgM是动物血清中主要的三大类免疫球蛋白,IgA主要通过凝集微生物以控制肠道中病原微生物的感染、定植及增殖,增强肠道黏膜的免疫功能;IgM可以促进细胞吞噬作用,对细菌等抗原发挥调理作用;IgG主要是由脾脏和淋巴结中的浆细胞合成,是动物血清中含量最高的免疫球蛋白,有抗菌、抗病毒、抗毒素等作用,是评价动物免疫功能的重要指标[29-30]。本试验结果表明,饲粮中添加花椒籽可以提高湖羊血清IgG、C3、C4含量和LZM活性,这意味着机体免疫功能增强,证实花椒籽可提高湖羊的免疫功能。

3.4 饲粮中添加花椒籽对湖羊肠道TLR2 mRNA和蛋白相对表达量的影响

Toll样受体是一种包含3个结构域的Ⅰ型跨膜蛋白,属于模式识别受体,能够通过识别并结合相关分子模式从而诱导机体产生天然免疫[31]。在识别外源性配体或内源性分子后,将识别信号传递给髓样分化因子88(MyD88)接头蛋白,MyD88再将该信号传递给核因子-κB(NF-κB)并引起NF-κB活化[32],通过调节下游蛋白肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)等信号分子,促使激活子蛋白-1(AP-1)和其他激酶的活化,继而导致相关基因的转录,以此来参与机体的免疫反应[33]。从本试验结果可得,饲粮中添加花椒籽提高了血清IgG含量,改善了小肠Toll样受体通路中相关基因和蛋白的表达,小肠中TLR2 mRNA和蛋白相对表达量也随之提高,通过Toll样受体通路有效调节湖羊小肠的免疫功能。有研究表明,TLR2基因及其介导的下游通路的激活与胃肠道屏障功能的改善密切相关,它的表达升高可以提高肠道对病原菌入侵和感染的抵抗力[34]。本试验结果表明,在饲粮中添加3%的花椒籽能显著提高TLR2的mRNA相对表达量,表明花椒籽可以在肠道免疫调节中发挥作用,抵御病原菌对肠道结构的破坏,维持肠道结构的完整,提高羔羊的免疫力。然而我们还发现,随着花椒籽添加水平的增加,湖羊小肠中TLR2 mRNA相对表达量呈下降的趋势,这可能是因为随着花椒籽添加水平的增加,湖羊采食了过多的生物活性物质,如多酚类物质、黄酮类物质以及黑色素[7],抑制了免疫作用,对机体造成了一定程度上的负面影响。

3.5 饲粮中添加花椒籽对湖羊肠道消化酶活性的影响

消化酶是家畜肠道中重要的活性物质,不仅能反映动物对营养物质的消化吸收程度,还对其生长发育有着重要影响[35]。其中,淀粉酶主要参与肠道中碳水化合物的消化分解;脂肪酶主要将脂肪水解为甘油和脂肪酸;胰蛋白酶将蛋白质分解为大小不同等的肽段,更有助于肠道对蛋白质的分解消化[36]。本试验中,饲粮中添加花椒籽可以提高十二指肠和回肠的淀粉酶活性以及空肠胰蛋白酶活性,提高了部分肠道消化酶活性,促进了营养物质的消化吸收。

4 结论

饲粮中添加3%和6%的花椒籽可以提高湖羊EE、钙表观消化率,提高十二指肠和空肠的绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度,提高十二指肠和回肠的淀粉酶活性,促进肠道发育,提高肠道免疫功能,且添加水平为3%时效果最优。

References

Publishing order | Descend order by publishing year | Descend order by cited within
[1]
杨敏, 魏冰, 张小勇, 等. 花椒籽精深利用新工艺研究[J]. 粮食与食品工业, 2023, 30(2):1-5,10.

YANG M, WEI B, ZHANG X Y, et al. Explore on new process of deep utilization of the Zanthoxylum bungeanum seed[J]. Cereal & Food Industry, 2023, 30(2):1-5,10. (in Chinese)

[2]
尚学峰, 李杰, 梁永飞, 等. 饲粮中添加不同水平花椒籽对育肥猪脂肪酸组成和FABP1基因组织表达的影响[J]. 甘肃农业大学学报, 2023, 58(1):1-9.

SHANG X F, LI J, LIANG Y F, et al. Effects of different supplemental levels of Zanthoxylum bungeanum seeds on fatty acid composition and tissue expression of the FABP1 gene in fattening pigs[J]. Journal of Gansu Agricultural University, 2023, 58(1):1-9. (in Chinese)

[3]
袁丛军, 杨光能, 胡红, 等. 花椒废弃物功能化利用研究进展[J]. 中国农学通报, 2022, 38(17):75-81.

DOI

YUAN C J, YANG G N, HU H, et al. Functional utilization of Zanthoxylum bungeanum waste:research progress[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2022, 38(17):75-81. (in Chinese)

[4]
吕俊霞. 花椒籽蛋白提取及体外模拟消化产物的鉴定与分析[D].硕士学位论文. 雅安: 四川农业大学, 2020.

LV J X. Extraction of Zanthoxylum seed protein and identification and analysis of simulated digestion products in vitro[D].Master’s Thesis. Ya’an: Sichuan Agricultural University, 2020. (in Chinese)

[5]
李杰, 黄晓宇, 尚学峰, 等. FABP2基因在不同比例花椒籽饲喂育肥猪的组织差异表达、克隆及生物信息学分析[J]. 华北农学报, 2022, 37(6):228-238.

DOI

LI J, HUANG X Y, SHANG X F, et al. Differential expression,cloning and bioinformatics of FABP2 gene in tissues of fattening pigs fed with different proportions of Zanthoxylum seeds[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2022, 37(6):228-238. (in Chinese)

[6]
年婧, 景军强, 赵重博, 等. 椒目仁油微波-超声辅助提取工艺优化及降血脂活性研究[J]. 成都中医药大学学报, 2021, 44(4):54-61.

NIAN J, JING J Q, ZHAO C B, et al. Optimization of microwave-ultrasonic assisted extraction of oil from Zanthoxylum seed kernel and its hypolipidemic effect[J]. Journal of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2021, 44(4):54-61. (in Chinese)

[7]
董小华. 花椒籽活性物质的提取、抗氧化和抑菌活性的研究[D].硕士学位论文. 雅安: 四川农业大学, 2016.

DONG X H. Antioxidant and antibacterial activity of biological active components from Zanthoxylum bungeanum maxim seed[D].Master’s Thesis. Ya’an: Sichuan Agricultural University, 2016. (in Chinese)

[8]
梁永飞. 花椒籽替代不同比例玉米对育肥猪生产性能、肉品质、脂肪酸组成的影响[D].硕士学位论文. 兰州: 甘肃农业大学, 2020.

LIANG Y F. Zanthoxylum seeds replacing corn in different proportions for fattening pigs effects of production performance,meat quality and fatty acid composition[D].Master’s Thesis. Lanzhou: Gansu Agricultural University, 2020. (in Chinese)

[9]
张萍, 骞姣, 邢蕾. 花椒籽粉对散养鸡产蛋性能和蛋品质的影响[J]. 当代畜禽养殖业, 2022(3):19-20.

ZHANG P, QIAN J, XING L. Effects of Zanthoxylum bungeanum seed powder on laying performance and egg quality of free-range chickens[J]. Modern Livestock and Poultry Breeding Industry, 2022(3):19-20. (in Chinese)

[10]
谢建鹏, 何振富, 王斐, 等. 花椒籽对肉羊生长性能、营养物质表观消化率及血清生化指标的影响[J]. 饲料研究, 2022, 45(22):11-14.

XIE J P, HE Z F, WANG F, et al. Effect of prickly ash seeds on growth performance,nutrient apparent digestibility and serum biochemical indexes of mutton sheep[J]. Feed Research, 2022, 45(22):11-14. (in Chinese)

[11]
谢红兵, 王永强, 韦光辉, 等. 花椒提取物对生长肥育猪生长性能及胴体品质的影响[J]. 养猪, 2016(5):42-45.

XIE H B, WANG Y Q, WEI G H, et al. Effect of pepper extract on growth performance and carcass quality in fattening pigs[J]. Swine Production, 2016(5):42-45. (in Chinese)

[12]
刁其玉. 中国肉用绵羊营养需要[M]. 4版. 北京: 中国农业出版社, 2019.

DIAO Q Y. Nutritional requirements of sheep for meat in China[M]. 4th ed. Beijing: China Agriculture Press, 2019. (in Chinese)

[13]
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会. 饲料中水分的测定:GB/T 6435—2014[S]. 北京: 中国标准出版社, 2015.

General Administration of Quality Supervision,Inspection and Quarantine of the People’s Republic of China, Standardization Administration of the People’s Republic of China. Determination of moisture in feedstuffs:GB/T 6435—2014[S]. Beijing: Standards Press of China, 2015. (in Chinese)

[14]
中华人民共和国国家市场监督管理总局, 中国国家标准化管理委员会. 饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法:GB/T 6432—2018[S]. 北京: 中国标准出版社, 2018.

State Administration for Market Regulation, Standardization Administration of the People’s Republic of China. Determination of crude protein in feeds—Kjeldahl method:GB/T 6432—2018[S]. Beijing: Standards Press of China, 2018. (in Chinese)

[15]
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会. 饲料中粗脂肪的测定:GB/T 6433—2006[S]. 北京: 中国标准出版社, 2006.

General Administration of Quality Supervision,Inspection and Quarantine of the People’s Republic of China, Standardization Administration of the People’s Republic of China. Determination of crude fat in feeds:GB/T 6433—2006[S]. Beijing: Standards Press of China, 2006. (in Chinese)

[16]
中华人民共和国国家市场监督管理总局, 中国国家标准化管理委员会. 饲料中粗纤维的含量测定:GB/T 6434—2022[S]. 北京: 中国标准出版社, 2022.

State Administration for Market Regulation, Standardization Administration of the People’s Republic of China. Determination of crude fiber content in feeds:GB/T 6434—2022[S]. Beijing: Standards Press of China, 2022. (in Chinese)

[17]
中华人民共和国国家市场监督管理总局, 中国国家标准化管理委员会. 饲料中钙的测定:GB/T 6436—2018[S]. 北京: 中国标准出版社, 2018.

State Administration for Market Regulation, Standardization Administration of the People’s Republic of China. Determination of calcium in feeds:GB/T 6436—2018[S]. Beijing: Standards Press of China, 2018. (in Chinese)

[18]
中华人民共和国国家市场监督管理总局, 中国国家标准化管理委员会. 饲料中总磷的测定分光光度法:GB/T 6437—2018[S]. 北京: 中国标准出版社, 2018.

State Administration for Market Regulation, Standardization Administration of the People’s Republic of China. Determination of phosphorus in feeds—Spectrophotometry:GB/T 6437—2018[S]. Beijing: Standards Press of China, 2018. (in Chinese)

[19]
王霞. 藏绵羊睾酮合成相关基因在睾丸和附睾中的表达特征及生物学功能[D].硕士学位论文. 兰州: 甘肃农业大学, 2021.

WANG X. The expression characteristics and biological function of Tibetan sheep testosterone synthesis-related genes in testes and epididymides[D].Master’s Thesis. Lanzhou: Gansu Agricultural University, 2021. (in Chinese)

[20]
马学义, 李乔, 祁成虎, 等. 花椒籽对湖羊羔羊生产性能、内脏器官指数和瘤胃组织形态发育的影响[J/OL]. 甘肃农业大学学报:1-12[2024-03-19].http://kns.cnki.net/kcms/detail/62.1055.S.20240319.1000.002.htm.

MA X Y, LI Q, QI C H, et al. Effects of Zanthoxylum bungeanum seeds on production performance,internal organ index and rumen tissue morphology of Hu sheep lambs[J/OL]. Journal of Gansu Agricultural University:1-12[2024-03-19].http://kns.cnki.net/kcms/detail/62.1055.S.20240319.1000.002.htm. in Chinese)

[21]
刘志鹏, 徐朋涛, 徐欢欢, 等. 山银花和大蓟提取物对产蛋后期蛋鸡肠道屏障功能、抗氧化能力和盲肠微生物的影响[J]. 动物营养学报, 2023, 35(8):5117-5131.

DOI

LIU Z P, XU P T, XU H H, et al. Effects of Lonicera flos and Cnicus japonicus extracts on intestinal barrier function,antioxidant capacity and cecal microbe of laying hens in late laying period[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2023, 35(8):5117-5131. (in Chinese)

[22]
张明良, 张海龙, 马世鹏, 等. 花椒精油对小尾寒羊生产性能和胃肠道组织结构的影响[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(2):556-563.

DOI

ZHANG M L, ZHANG H L, MA S P, et al. Effects of Zanthoxylum bungeanum essential oil on production performance and gastrointestinal tissue structure of small-tail Han sheep[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2023, 50(2):556-563. (in Chinese)

[23]
LALLÈS J P, BOSI P, JANCZYK P, et al. Impact of bioactive substances on the gastrointestinal tract and performance of weaned piglets:a review[J]. Animal, 2009, 3(12):1625-1643.

[24]
袁满, 谢金丽, 虞立霞, 等. 槲皮素对肠道菌群的调节作用及其健康效应[J]. 营养学报, 2023, 45(1):98-103.

YUAN M, XIE J L, YU L X, et al. Regulation and health effects of quercetin on gut microbiota[J]. Acta Nutrimenta Sinica, 2023, 45(1):98-103. (in Chinese)

[25]
周孝琼, 陈洪博, 韦建云, 等. 发酵花生壳对湖羊生长性能、血液生化及免疫指标的影响[J]. 中国饲料, 2022(4):109-112.

ZHOU X Q, CHEN H B, WEI J Y, et al. Effects of fermented peanut shell on growth performance,blood biochemistry and immune indexes of lake sheep[J]. China Feed, 2022(4):109-112. (in Chinese)

[26]
梁文军, 柴聪聪, 李金傲, 等. 溶菌酶对犊牛腹泻和生长性能的影响[J]. 中国乳业, 2023(2):40-43,48.

LIANG W J, CHAI C C, LI J A, et al. Effects of lysozyme on growth performance and diarrhea of calves[J]. China Dairy, 2023(2):40-43,48. (in Chinese)

[27]
杨敏敏, 车育彦, 王睿, 等. 枯草芽孢杆菌对脂多糖应激肉仔鸡生长性能、免疫性能和血清抗氧化性能的影响[J]. 动物营养学报, 2022, 34(4):2347-2360.

DOI

YANG M M, CHE Y Y, WANG R, et al. Effects of Bacillus subtilis on growth performance,immune performance and serum antioxidant performance of broilers challenged with lipopolysaccharide[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2022, 34(4):2347-2360. (in Chinese)

[28]
马莉梅, 张海军, 陶萨茹拉, 等. 不同工艺制备的苜蓿干草对犊牛生产性能、消化性能和血液生化免疫指标的影响[J]. 家畜生态学报, 2023, 44(5):47-51.

MA L M, ZHANG H J, TAO S R L, et al. Effects of different alfalfa hay by preparation technology on production performance,digestive performance and blood biochemical immune indexes of calves[J]. Acta Ecologae Animalis Domastici, 2023, 44(5):47-51. (in Chinese)

DOI

[29]
邹明, 林汉卿, 邓华成, 等. 贵州白山羊血液生理生化指标及免疫球蛋白G测定与分析[J]. 兽医导刊, 2021(11):121-123.

ZOU M, LIN H Q, DENG H C, et al. Determination and analysis of blood physiological and biochemical indexes and immunoglobulin G in Guizhou white goats[J]. Veterinary Orientation, 2021(11):121-123. (in Chinese)

[30]
孟子琪, 杨磊, 高宇轩, 等. 不同胎次、温度及加热时间对奶山羊初乳中免疫球蛋白含量的影响[J]. 中国畜牧杂志, 2023, 59(4):298-302.

MENG Z Q, YANG L, GAO Y X, et al. Effects of different litter size,temperature and heating time on immunoglobulin content in colostrum of dairy goats[J]. Chinese Journal of Animal Science, 2023, 59(4):298-302. (in Chinese)

[31]
高岩. 饲喂酸化乳对犊牛生长性能、血液免疫指标及粪便微生物多样性的影响[D].硕士学位论文. 大庆: 黑龙江八一农垦大学, 2018.

GAO Y. Effects of feeding acidified milk on growth performance,blood immunologic indicator and fecal microorganism diversity in Holstein calves[D].Master’s Thesis. Daqing: Heilongjiang Bayi Agricultural University, 2018. (in Chinese)

[32]
DREXLER S K, FOXWELL B M. The role of Toll-like receptors in chronic inflammation[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2010, 42(4):506-518.

[33]
桂雪儿, 王志, 李思婷, 等. 鸡源复合益生菌对青年白羽肉杂鸡免疫球蛋白和Toll样受体通路的影响[J]. 浙江农业学报, 2020, 32(9):1609-1614.

DOI

GUI X E, WANG Z, LI S T, et al. Effect of chicken-derived compound probiotics on immunoglobulin and Toll-like receptor pathway of white feather broilers[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis, 2020, 32(9):1609-1614. (in Chinese)

DOI

[34]
PIERZCHALSKA M, PANEK M, CZYRNEK M, et al. Probiotic Lactobacillus acidophilus bacteria or synthetic TLR2 agonist boost the growth of chicken embryo intestinal organoids in cultures comprising epithelial cells and myofibroblasts[J]. Comparative Immunology,Microbiology and Infectious Diseases, 2017, 53:7-18.

[35]
曲星梅, 薛复来, 黄晓瑜, 等. 断奶日龄和日粮营养水平对陕北白绒山羊小肠形态发育和消化酶活性的影响[J]. 中国农业科学, 2019, 52(19):3460-3470.

DOI

QU X M, XUE F L, HUANG X Y, et al. Effects of weaning age and dietary nutritional levels on intestinal morphology and activity of digestive enzymes in 6-month-old Shaanbei white cashmere goats[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2019, 52(19):3460-3470. (in Chinese)

[36]
王嘉麟, 吴鹏鑫, 王胜男, 等. 饲粮中添加岩藻多糖对羔羊生长性能、肠道消化酶活性和微生物区系的影响[J]. 动物营养学报, 2023, 35(4):2417-2430.

DOI

WANG J L, WU P X, WANG S N, et al. Effects of dietary fucoidan on growth performance,intestinal digestive enzyme activities and microbial flora of lambs[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2023, 35(4):2417-2430. (in Chinese)

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