Chinese Journal of Animal Nutrition >

2024 , Vol. 36 >Issue 5: 3352 - 3362

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.287

RESEARCH PAPER

Effects of Different Lactic Acid Bacteria Additives on Silage Quality of Natural Pasture Grass Silage

  • ZHAO Muqier ,
  • BAO Jian ,
  • WANG Zhijun ,
  • DU Shuai ,
  • LIU Jianliang ,
  • ZOU Yuqi ,
  • PAN Zeyu ,
  • JIA Yushan ,
  • GE Gentu , *
Expand
  • Key Laboratory of Forage Cultivation and the Processing and Highly Efficient Utilization of the Ministry of Agriculture, College of Grassland, Resources and Environment, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019, China
* professor, E-mail:

Received date: 2023-11-08

  Online published: 2024-05-15

Fold

Abstract

In this study, the effects of different lactic acid bacteria additives on nutritional quality, fermentation quality and microbial diversity of natural pasture grass silage were evaluated to improve the silage quality of natural pasture grass silage. The natural pasture grass of meadow steppe was used as ensiling raw material, with five treatments of control (CK), and additions of Limosilactobacillus fermentum (LF), Latilactobacillus graminis (LG), Latilactobacillus plantarum (LP) and Lentilactobacillus buchneri (LB) treatments were set up with three replicates in each treatment, and the indicators related to nutritional quality, fermentation quality and bacterial community structure of silage samples were determined after 60 days of ensiling. The results showed that four lactic acid bacteria additives improved the fermentation quality of natural pasture grass silage and reduced the loss of nutritional components to different degrees compared with the CK treatment. The LG treatment had the lowest pH and the highest lactic acid content, the acetic acid and ammoniacal nitrogen contents of the LF and LB treatments were significantly higher than of the other treatments (P<0.05), and butyric acid was not detected in all treatments. LG treatment had the highest content of water-soluble carbohydrate, and neutral detergent fiber content of the LF and LG treatments was significantly lower than that of the other treatments (P<0.05). Based on high-throughput sequencing, it was found that the abundances of Lentilactobacillus buchneri, Lactiplantibacillus plantarum and Limosilactobacillus fermentum were higher in the lactic acid bacteria additive treatments, while the abundances of Levilactobacillus brevis and Leuconostoc mesenteroides was higher in the CK treatment, and there was also a certain proportion of undesirable bacteria. In summary, combined with the comprehensive evaluation of the indicators of nutritional quality, fermentation quality and bacterial diversity, the silage quality of natural pasture grass silage is the best when Latilactobacillus graminis is added.

Key words： natural pasture grass; lactic acid bacteria; silage quality; microbial diversity

Cite this article

ZHAO Muqier , BAO Jian , WANG Zhijun , DU Shuai , LIU Jianliang , ZOU Yuqi , PAN Zeyu , JIA Yushan , GE Gentu . Effects of Different Lactic Acid Bacteria Additives on Silage Quality of Natural Pasture Grass Silage[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2024 , 36(5) : 3352 -3362 . DOI: 10.12418/CJAN2024.287

近年来,伴随着草牧业的迅猛发展,优质饲草料供给存在着巨大的缺口,广袤的草原面积为我国供应了丰富的天然草地牧草资源,因此合理且高效地利用天然草地牧草资源对保障饲草料供应具有重大意义[1]。目前,青贮是提高天然草地牧草饲料质量的常用手段[2],然而,与其他优质的青贮原料相比,天然草地牧草因其“三低一高”的特性,在无外源添加剂的情况下,很难制成优质青贮饲料[3]。添加剂是提高青贮饲料品质的重要手段,通过添加不同种类的添加剂可以调控天然草地牧草青贮发酵进程并改善其品质,而乳酸菌添加剂在其中起着举足轻重的地位[4]。Li等[5]将乳酸菌添加到赤峰市典型草原天然草地牧草青贮中,得出各处理均有效降低了青贮饲料的pH和氨态氮(NH3-N)含量,提高了乳酸(LA)含量,改善了青贮品质。Zhang等[6]研究发现,植物乳植物杆菌(Latilactobacillus plantarum)[曾用名:植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)]和布氏迟缓乳杆菌(Lentilactobacillus buchneri)的添加,在保证了大部分营养物质不被消耗的同时,抑制了不良微生物的繁殖活动。
当前的研究主要集中在商业菌剂对天然草地牧草青贮品质的影响,但将天然草地牧草本身筛选出的乳酸菌应用到天然草地牧草青贮的研究较少。为合理利用天然草地牧草资源,提高天然草地牧草青贮饲料的品质,深入地了解青贮饲料中的菌群组成及其相对丰度。近年来,Pacific Bioscience公司的单分子实时测序(single molecule real-time sequencing,SMRT)技术因其读数段长、速度快和精度准的特点而开始应用于饲草青贮的研究当中[7]。SMRT技术可以在物种水平上鉴定生物体,并已应用于意大利黑麦草[8]和柱花草[9]的青贮饲料,而在天然草地牧草青贮中则鲜见报道。因此,本研究旨在探讨不同乳酸菌添加剂对天然草地牧草青贮营养品质、发酵品质和菌群多样性的影响,对比不同乳酸菌的应用效果,为天然草地牧草的高效利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于内蒙古锡林郭勒盟乌拉盖牧场的草甸草原试验示范区,在乌拉盖管理区东北67 km处(44°04'19″N,119°13'43″E),海拔高达930 m,属半干旱大陆性气候,年降雨量为280~420 mm,其中70%分布于6—8月份,无霜期90~110 d,土壤类型以暗栗钙土为主。

1.2 试验材料

供试材料为2021年7月25日收获自锡林郭勒草原的天然草地牧草,样地的植物总盖度为50%~70%,详细信息如表1所示。供试乳酸菌添加剂发酵黏液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)和草广泛乳杆菌(Latilactobacillus graminis)来自于内蒙古农业大学草产品加工实验室,植物乳植物杆菌购自山东中科嘉亿生物工程有限公司,布氏迟缓乳杆菌购自江苏绿科生物技术有限公司。
表1 天然草地牧草中植物种类及其优势度

Table 1 Plant species in natural pasture grass and their dominance degrees %

编号
No.		 中文名称
Chinese name		 拉丁名
Latin name		 科
Family		 优势度
SDR
1 大针茅 Stipa grandis P.A. Smirn. 禾本科 10.62
2 贝加尔针茅 Stipa baicalensis Roshev 禾本科 5.78
3 羊草 Leymus chinensis (Trin.) Tzvel. 禾本科 25.51
4 冰草 Agropyron cristatum (L.) Gaertn. 禾本科 4.49
5 糙隐子草 Cleistogenes squarrosa (Trin.) Keng 禾本科 6.98
6 火绒草 Leontopodium leontopodioides (Willd.) Beauv. 菊科 4.38
7 差巴嘎蒿 Artemisia halodendron Turcz. et Bess. 菊科 7.85
8 冷蒿 Artemisia frigida (Willd.) Bess 菊科 1.06
9 猪毛蒿 Artemisia scoparia Waldst. et Kit. 菊科 2.18
10 麻花头 Klasea centauroides (L.) Cass. 菊科 5.11
11 阿尔泰狗娃花 Heteropappus altaicus (Willd.) Novopokr 菊科 1.35
12 扁蓿豆 Melissilus ruthenicus (L.) Peschkova (Trigonella ruthenica L.) 豆科 1.79
13 沙打旺 Astragalus adsurgens Pall. 豆科 1.28
14 瓦松 Orostachys fimbriata (Turcz.) Berg. 景天科 3.25
15 防风 Saposhnikovia divaricate (Trucz.) Schischk. 伞形科 1.70
16 地榆 Sanguisorba officinalis L. 蔷薇科 3.32
17 翻白委陵菜 Potentilla discolor Bunge 蔷薇科 1.29
18 银灰旋花 Convolvulus ammannnii Desr. 旋花科 2.66
19 鼠尾草 Salvia japonica Thunb. 唇形科 1.80
20 报春花 Primula malacoides Franch. 报春花科 1.45
21 蒙古韭 Allium mongolicum Regel. 百合科 2.00
22 狼毒 Arisaema lobatum Engl. 大戟科 4.15

1.3 试验设计

试验采用单因素随机区组设计,设置5个处理,即对照(CK)以及添加发酵黏液乳杆菌(LF)、草广泛乳杆菌(LG)、植物乳植物杆菌(LP)和布氏迟缓乳杆菌(LB)处理,每个处理做3次重复。乳酸菌添加剂的添加量为1×105 CFU/g FM,按照处理将各乳酸菌以30 mL/kg FM溶液的形式喷洒入经切短至1~2 cm的天然草地牧草中,对照处理喷洒等量的无菌水,之后装入聚乙烯无菌袋,每袋约250 g,使用真空包装机真空密封,室温条件下青贮60 d后开袋,取样分析相关指标。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 营养成分含量

采用105 ℃烘干法[10]测定干物质(dry matter,DM)含量;采用GB/T 6438—2007中方法测定粗灰分含量后,根据粗灰分含量计算出有机物(organic matter,OM)含量;参照GB/T 6432—2018中方法测定粗蛋白质(crude protein,CP)含量;使用Ankom 2000型纤维分析仪按照所附说明书测定酸性洗涤纤维(acid detergent fiber,ADF)和中性洗涤纤维(neutral detergent fiber,NDF)含量;使用VELP SER148/6脂肪测试仪按照所附说明书测定粗脂肪(ether extract,EE)含量;采用蒽酮-硫酸比色法[11]测定可溶性碳水化合物(water-soluble carbohydrate,WSC)含量。

1.4.2 发酵品质

采用四分法取10 g天然草地牧草鲜样或青贮样品,与90 mL无菌水混合,利用医用纱布和滤纸过滤后立即用pH计测定pH,然后使用高效液相色谱仪测定有机酸含量[12],采用苯酚-次氯酸比色法[13]测定氨态氮(ammonia nitrogen,NH3-N)含量。

1.4.3 菌群多样性

将每个处理的天然草地牧草样品充分混合均匀后,按照细菌基因组DNA提取试剂盒提取天然草地牧草青贮饲料的总DNA,并对全长16S rRNA进行PCR扩增,利用PacBio Seque平台进行测序,使用USEARCH软件在相似性97%的水平上进行操作分类单元(OTU)的聚类,然后使用QIIME2中的DADA2方法对质控后的数据进行去噪处理,得到最优序列,再进行菌群多样性分析。

1.5 数据处理与分析

利用Excel 2021对试验原始数据进行预处理分析。使用SAS 9.2软件对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA),并采用Duncan氏法进行组间差异的多重比较。利用QIIME2软件平台进行菌群的α多样性分析(Chao1、Shannon、ACE和Coverage指数),采用R语言相关软件进行主成分分析(PCA)并作图。

2 结果与分析

2.1 天然草地牧草的原料特性

表2显示了天然草地牧草原料的营养品质。天然草地牧草中DM含量以鲜重计为50.12%;以干重计,天然草地牧草中OM含量为94.65%,CP含量为11.15%,NDF含量为64.87%,ADF含量为39.88%,EE含量为3.23%,WSC含量为1.78%。
表2 天然草地牧草的营养成分

Table 2 Nutritional components of natural pasture grass

项目
Item		 干物质
DM/% FM		 有机物
OM/% DM		 粗蛋白质
CP/% DM		 中性洗
涤纤维
NDF/% DM		 酸性洗
涤纤维
ADF/% DM		 粗脂肪
EE/% DM		 可溶性碳
水化合物
WSC/% DM
含量Content 50.12±0.39 94.65±0.24 11.15±0.16 64.87±0.63 39.88±0.14 3.23±0.16 1.78±0.12

2.2 不同乳酸菌添加剂对天然草地牧草青贮饲料营养品质的影响

由表3可知,相较于CK处理,乳酸菌添加剂处理的DM和WSC损失更低,其中,LP处理的DM含量最高,LG处理的WSC含量最高;与CK相比,LF和LP处理的OM含量显著提高(P<0.05);各处理的CP、ADF和EE含量均无显著差异(P>0.05),但LP处理表现出了更高的CP含量和更低的ADF含量;与CK和LB处理相比,LF和LG处理的NDF含量显著降低(P<0.05)。
表3 不同乳酸菌添加剂对天然草地牧草青贮饲料营养品质的影响

Table 3 Effects of different lactic acid bacteria additives on nutritional quality of natural pasture grass silage

处理
Treatments		 干物质
DM/% FM		 有机物
OM/% DM		 粗蛋白质
CP/% DM		 中性洗
涤纤维
NDF/% DM		 酸性洗
涤纤维
ADF/% DM		 粗脂肪
EE/% DM		 可溶性碳水
化合物
WSC/% DM
CK 41.88±0.27 93.57±0.06b 10.27±0.08 58.30±1.03a 35.41±0.02 3.61±0.03 0.84±0.04
LF 42.81±0.21 93.93±0.02a 10.76±0.06 55.21±0.30b 35.12±0.82 3.22±0.09 0.90±0.02
LG 42.36±0.80 93.52±0.09b 10.69±0.26 54.47±1.02b 34.69±0.33 3.48±0.12 0.94±0.01
LP 43.64±0.21 93.93±0.08a 10.87±0.20 56.57±0.52ab 34.55±0.95 3.43±0.08 0.87±0.02
LB 43.14±0.07 93.79±0.13ab 10.10±0.44 58.23±0.68a 35.11±0.39 3.29±0.16 0.85±0.03
均值标准误
SEM		 0.304 5 0.086 6 0.149 3 0.774 1 0.157 6 0.069 2 0.042 3
P值P-value 0.081 7 0.034 0 0.230 0 0.035 0 0.811 6 0.155 1 0.218 7

同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同小写字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。表4同。

In the same column, values with different lowercase letter superscripts indicated significant difference (P<0.05), while with the same lowercase letter or no letter superscripts indicated no significant difference (P>0.05). The same as Table 4.

2.3 不同乳酸菌添加剂对天然草地牧草青贮饲料发酵品质的影响

由表4可知,同CK处理相比,添加各乳酸菌添加剂均显著降低了天然草地牧草青贮饲料的pH(P<0.05),其中以LG处理的pH最低;与pH的变化相反,除了LB处理以外,各乳酸菌添加剂处理的LA含量均高于CK处理,以LG处理的LA含量最高,其与CK处理的差异达到显著水平(P<0.05);与CK处理相比,各乳酸菌添加剂处理的乙酸(AA)含量均有所提高,其中LF处理显著高于CK和LP处理(P<0.05);LB处理的青贮饲料中未检测到丙酸(PA),同CK和LP处理相比,LF和LG处理的PA含量显著降低(P<0.05);各处理的青贮饲料中均未检测到丁酸(BA);同CK处理相比,各乳酸菌添加剂处理的NH3-N含量均有所降低,其中LF和LB处理与CK处理差异显著(P<0.05)。
表4 不同乳酸菌添加剂对天然草地牧草青贮饲料发酵品质的影响

Table 4 Effects of different lactic acid bacteria additives on fermentation quality of natural pasture grass silage

处理
Treatments		 pH 乳酸
LA/
(g/kg FM)		 乙酸
AA/
(g/kg FM)		 丙酸
PA/
(g/kg FM)		 丁酸
BA/
(g/kg FM)		 氨态氮
NH3-N/
(g/kg FM)
CK 4.79±0.04a 8.64±0.03b 4.73±0.13c 1.37±0.08a ND 4.16±0.15a
LF 4.33±0.02cd 9.01±0.32b 5.99±0.26a 0.11±0.11c ND 3.45±0.23bc
LG 4.20±0.02d 9.60±0.23a 5.35±0.23abc 0.53±0.03b ND 3.80±0.16abc
LP 4.40±0.06c 9.06±0.20ab 4.88±0.27bc 1.39±0.19a ND 4.07±0.16ab
LB 4.65±0.03b 8.60±0.14b 5.55±0.20ab 0.00±0.00c ND 3.32±0.22c
均值标准误SEM 0.108 0 0.180 2 0.221 9 0.317 5 0.165 3
P值P-value <0.000 1 0.015 9 0.026 3 <0.000 1 0.036 9

ND表示未检测到。

ND mean not detected.

2.4 不同乳酸菌添加剂对天然草地牧草青贮饲料菌群多样性的影响

2.4.1 天然草地牧草青贮饲料的菌群α多样性分析

如图1所示,不同乳酸菌添加剂对ACE、Chao1和Shannon指数具有显著影响(P<0.05)。CK处理的ACE、Chao1和Shannon指数均高于各乳酸菌添加剂处理,表明乳酸菌添加剂使青贮饲料中菌群的丰富度及多样性发生了改变;各处理的Coverage指数均大于0.99,且差异不显著(P>0.05),表明测序结果均很好地代表了样本中的细菌群落的真实情况。
图1 天然草地牧草青贮饲料的菌群α多样性指数分析

数据柱标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05),无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

Fig.1 Analysis of bacterial community α diversity indexes of natural pasture grass silage

Data columns with different lowercase letters indicated significant difference (P<0.05), while with the same no lowercase letters indicated no significant difference (P>0.05).

2.4.2 天然草地牧草青贮饲料的菌群β多样性分析

如图2所示,主成分1(PC1)的贡献率为88.90%,主成分2(PC2)的贡献率为8.75%,CK处理分布在第4象限,而各乳酸菌添加剂处理则主要分布在第2、3象限。CK处理距离其他处理较远,说明其菌群结构与各乳酸菌添加剂处理差异较大。LF与LB处理、LG与LP处理之间的距离较近,表明它们之间菌群构成差异较小。
图2 天然草地牧草青贮饲料的菌群β多样性分析(主成分分析)

Fig.2 Analysis of bacterial community β diversity (PCA) of natural pasture grass silage

2.4.3 天然草地牧草青贮饲料的细菌群落结构分析

物种分类信息的差异说明了细菌群落结构变化对乳酸菌添加剂的响应。如表5所示,在属水平上,迟缓乳杆菌属(Lentilactobacillus)、促生乳杆菌属(Levilactobacillus)、乳植物杆菌属(Lactiplantibacillus)和黏液乳杆菌属(Limosilactobacillus)为各处理中的优势菌属;在种水平上,各乳酸菌添加剂处理中布氏迟缓乳杆菌、植物乳植物杆菌和发酵黏液乳杆菌相对丰度较高,而CK处理中则以短促生乳杆菌(Levilactobacillus brevis)和肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)为主。
表5 不同乳酸菌添加剂处理下天然草地牧草青贮饲料的细菌群落组成

Table 5 Bacterial community composition of natural pasture grass silage treated with different lactic acid bacteria additives

属水平
Genus levels		 种水平
Species levels		 处理Treatments 均值
标准误
SEM		 P值
P-value
CK LF LG LP LB
迟缓乳杆菌属
Lentilactobacillus		 布氏迟缓乳杆菌
Lentilactobacillus buchneri		 1.38
±0.19d		 84.42
±0.90ab		 65.22
±1.10c		 78.30
±2.10b		 84.88
±0.40a		 15.769 4 <0.000 1
促生乳杆菌属
Levilactobacillus		 短促生乳杆菌
Levilactobacillus brevis		 79.20
±4.50a		 0.73
±0.21b		 4.20
±0.21b		 1.61
±0.42b		 1.36
±0.24b		 15.456 3 <0.000 1
乳植物杆菌属
Lactiplantibacillus		 植物乳植物杆菌
Lactiplantibacillus plantarum		 3.36
±0.56b		 1.26
±0.08b		 20.44
±1.82a		 17.97
±2.32a		 6.28
±0.53b		 0.566 6 0.001 1
黏液乳杆菌属
Limosilactobacillus		 发酵黏液乳杆菌
Limosilactobacillus fermentum		 0.02
±0.01c		 10.26
±0.16a		 0.30
±0.13c		 0.06
±0.02c		 4.69
±0.34b		 2.004 1 <0.000 1
明串珠菌属
Leuconostoc		 肠膜明串珠菌
Leuconostoc mesenteroides		 7.25
±0.38a		 0.03
±0.02b		 0.17
±0.14b		 0.02
±0.01b		 0.35
±0.15b		 1.422 4 0.026 2
明串珠菌属
Leuconostoc		 柠檬明串珠菌
Leuconostoc citreum		 3.39
±0.19a		 0.02
±0.01b		 0.60
±0.06b		 0.00
±0.00b		 0.85
±0.44b		 0.649 1 0.033 3
泛菌属
Pantoea		 成团泛生菌
Pantoea agglomerans		 1.86
±0.48a		 0.13
±0.12a		 0.43
±0.38a		 0.17
±0.09a		 0.17
±0.08a		 0.331 7 0.380 4
unclassified_
Muribaculaceae		 unclassified_
Muribaculaceae		 0.59
±0.02a		 0.33
±0.14a		 0.21
±0.01a		 0.26
±0.16a		 0.30
±0.04a		 0.083 8 0.375 9
葡萄球菌属
Staphylococcus		 表皮葡萄球菌
Staphylococcus epidermidis		 1.08
±0.04a		 0.01
±0.01a		 0.58
±0.54a		 0.01
±0.01a		 0.00
±0.00a		 0.310 7 0.244 9
埃希氏菌属
Eacherichia		 弗格森埃希氏菌
Eacherichia fergusonii		 0.79
±0.29a		 0.35
±0.34a		 0.11
±0.04a		 0.06
±0.03a		 0.12
±0.03a		 0.176 0 0.582 6
其他
Others		 其他
Others		 1.08
±0.01c		 2.48
±0.25b		 7.74
±0.52a		 1.56
±0.14c		 1.00
±0.17c		 1.029 1 <0.000 1
LEfSe方法被用来评估不同样品之间细菌群落组成的差异,并探索各样品中的特定细菌种类。不同乳酸菌添加剂处理下天然草地牧草青贮饲料细菌群落的LEfSe分析结果如图3所示。当判别分析(LDA)得分>4.0时,CK处理中有5个细菌显著富集,LG处理中有1个细菌显著富集,LP和LB处理中各有2个细菌显著富集。
图3 不同乳酸菌添加剂处理下天然草地牧草青贮饲料细菌群落的LEfSe分析

Fig.3 Analysis of LEfSe of bacterial community of natural pasture grass silage treated with different lactic acid bacteria additives

2.4.4 天然草地牧草青贮饲料附着细菌群落功能分析

不同乳酸菌添加剂处理的天然草地牧草青贮饲料附着细菌群落不同水平的PICRUST 2功能预测分析如图4所示。在1级通路水平上,细菌群落功能主要为代谢、基因信息处理、环境信息处理、人类疾病、细胞代谢过程和有机系统6大类,其中代谢途径占据着绝对的优势地位;在2级通路水平上,细菌群落功能主要富集在碳水化合物代谢、脂质代谢、核苷酸代谢、氨基酸代谢、其他次生代谢产物的生物合成和膜传输等通路中,且各乳酸菌添加剂处理间差异不大;在3级通路水平上,排名前20的代谢通路中有15条属于代谢途径,碳水化合物代谢和氨基酸代谢仍是最主要的代谢通路,各乳酸菌添加剂处理在氨基酸代谢的3条通路中丰度较高,但在核苷酸代谢、聚糖的生物合成和代谢通路中呈现了不同的丰度。
图4 不同乳酸菌添加剂处理下天然草地牧草青贮饲料附着细菌的PICRUSt2功能预测分析

Fig.4 PICRUSt2 function prediction analysis of bacterial community attached to natural pasture grass silage treated with different lactic acid bacteria additives

3 讨论

3.1 不同乳酸菌添加剂对天然草地牧草青贮饲料营养品质的影响

营养品质是评价饲草品质和商业价值的必要指标。衡量青贮饲料营养品质的一个主要指标是DM含量。减少DM的损失对于提高青贮饲料的质量具有重要的现实意义[14]。本试验中所有乳酸菌添加剂处理和CK处理的DM含量是相似的,这可能是因为LA在所有组别中主导了微生物发酵,导致DM损失减少[15],使得各处理间差异不大。前人的结果表明,添加剂对青贮饲料的CP含量没有显著影响[16],这验证了本研究中CK处理和各乳酸菌添加剂处理的CP含量基本相同。此外,天然草地牧草中缺乏足够的发酵底物,无法快速降低pH、提高有机酸含量,进而抑制蛋白酶的活性,这可能是造成不同处理的CP含量无显著差异的另一个原因[17]。NDF含量在CK处理和4种乳酸菌添加剂处理之间存在一定的差异,LF和LG处理的NDF含量显著低于其他处理。这是因为发酵黏液乳杆菌和草广泛乳杆菌能抑制好氧细菌等有害微生物的生长繁殖,有效缓解营养物质降解,因此更多的非纤维类营养物质被保留下来[18]。在本研究中,与直接青贮相比,添加乳酸菌提高了WSC含量,且各乳酸菌添加剂处理的WSC含量也有所不同,不同乳酸菌间碳源利用能力的差异[19]可能是造成上述结果的主要原因。

3.2 不同乳酸菌添加剂对天然草地牧草青贮饲料发酵品质的影响

青贮饲料的发酵品质评定结果主要是由pH和LA等有机酸以及NH3-N含量共同决定的[20-21]。决定青贮饲料pH下降的关键指标主要为LA和AA。在本研究中,与CK处理相比,4种乳酸菌添加剂处理的pH均显著降低,这主要是由于添加乳酸菌使以LA为主的有机酸在天然草地牧草青贮中大量积累所致;同时,草广泛乳杆菌对提高LA含量和降低NH3-N含量均有积极作用,这可能是由于它们具有较强的耐酸能力。4种乳酸菌菌株产生大量的LA和一定量的AA,以降低pH,抑制不良微生物的繁殖活动,从而提高青贮饲料的发酵品质[22]。同样,Si等[23]证明,同质和异质乳酸菌接种剂均可以在青贮期间降低NH3-N含量和pH,有所不同的是,接种了LG和LP的天然草地牧草青贮饲料显示出了更高的LA含量和较低的AA含量,这也证明这2个群体转向了纯LA发酵。

3.3 不同乳酸菌添加剂对天然草地牧草青贮饲料菌群多样性的影响

细菌群落结构变化、多样性和代谢产物的种类和功能是评价饲草青贮饲料发酵质量好坏的评估指标[24]。Du等[25]的研究表明,SMRT技术通过分析样品菌群全貌,最大限度地展示青贮饲料中附着细菌的种类和丰度,揭示不同青贮饲料细菌群落组成的差异性。本研究采用了SMRT技术在细菌区系层面阐明了4种乳酸菌添加剂处理下天然草地牧草青贮饲料所附着细菌群落的组成。本试验中,各处理青贮饲料样品的Coverage指数皆趋近于1,表明本次测序代表了样品中微生物的真实情况。在天然草地牧草青贮中,不同乳酸菌添加剂对天然草地牧草青贮饲料细菌群落的ACE、Chao1和Shannon指数均造成了显著影响,但各乳酸菌添加剂处理均低于CK处理,说明添加乳酸菌添加剂后青贮中复杂的细菌群落会逐渐被优势乳酸菌取代[26]。在β多样性分析中,不同处理中细菌群落存在明显分离现象,这表明乳酸菌添加剂对天然草地牧草青贮饲料附着的细菌群落的组成和结构有显著影响。这些结果与Zeng等[27]的报道一致。
细菌群落的组成和结构是青贮饲料品质特性的重要影响因素之一,乳酸菌在细菌群落中所占的比例直接影响着青贮发酵的速率和程度。乳植物杆菌属、迟缓乳杆菌属、片球菌属、乳球菌属、肠球菌属、链球菌属、魏斯氏菌属和明串珠菌属的细菌是青贮发酵过程中所需的功能细菌,是青贮中的启动点和关键点,并且已广泛用于改善青贮饲料的质量[14]。在不同的乳酸菌接种物处理下,青贮发酵结束后,乳酸菌是各处理青贮饲料中占比最大的细菌,在各处理中的占比均超过90%。在种水平上,各乳酸菌添加剂处理的主要细菌均为布氏迟缓乳杆菌、植物乳植物杆菌和发酵黏液乳杆菌,这与前人的研究结果[28]大体一致。与各乳酸菌添加剂处理相比,CK处理的细菌群落组成更加多样化,既有多种高占比的乳酸菌,包括短促生乳杆菌、植物乳植物杆菌、肠膜明串珠菌和柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum),也存在相对低占比的成团泛生菌(Pantoea agglomerans)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和弗格森埃希氏菌(Eacherichia fergusonii)等细菌,这是由于青贮60 d后,CK处理仍有较高的pH,LA发酵过程缓慢,导致杂菌生长较多。成团泛生菌在青贮过程中与乳酸菌竞争底物,影响发酵进程[29]。弗格森埃希氏菌是影响青贮饲料发酵的有害细菌,具有致病性,可引起动物疾病,危害家畜健康[30]。在本试验中,各乳酸菌添加剂处理的乳酸菌相对丰度也存在一定的差异,但菌群多样性总体水平变化不大,布氏迟缓乳杆菌为处理中的优势细菌物种。Seale[31]也发现了类似的结果,他认为异型发酵的耐酸乳杆菌属会控制青贮的最后阶段。然而,乳杆菌属物种及其比例的差异会影响青贮饲料品质。
细菌群落组成的差异会引起其代谢功能的变化,本研究利用PICRUSt2方法[32]基于标记基因测序谱预测群落功能潜力的能力,探讨不同乳酸菌添加剂对天然草地牧草青贮饲料细菌群落功能的影响。其中,氨基酸代谢、碳水化合物代谢、能量代谢和脂质代谢对发酵过程中的物质转化具有显著影响[33]。在本研究中,1级通路水平上主要为代谢和基因信息处理;2级通路水平上,碳水化合物代谢、脂质代谢和氨基酸代谢是各处理中富集最多的通路,这一结果反映了这些代谢过程一方面保证了细菌的生长,另一方面分解了青贮饲料中的蛋白质、氨基酸、脂类及碳水化合物,保证了青贮品质的提升,同时也伴随着一部分营养的损失;在3级通路水平上,氨基酸代谢仍是最主要的代谢通路,相较于CK处理,各乳酸菌添加剂处理在氨基酸代谢的3条通路中表现出了更高的丰度,青贮过程中菌群的生长繁殖易发生蛋白质水解,导致氨基酸代谢增加,从而影响青贮饲料的CP含量。这些氨基酸的代谢途径可能反映了天然草地牧草青贮饲料的优势菌群的代谢动态。

4 结论

本研究结果表明,4种乳酸菌添加剂(发酵黏液乳杆菌、草广泛乳杆菌、植物乳植物杆菌和布氏迟缓乳杆菌)均提高了天然草地牧草青贮饲料的发酵品质,减少了营养成分的损失,并提高了有益菌的相对丰度。综合分析天然草地牧草青贮饲料的营养品质、发酵品质和菌群多样性,以添加草广泛乳杆菌的青贮效果最佳。

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